הכנת הדגימה על ידי כרסום קרן יונים ממוקדת תלת-ממדית לטומוגרפיית קריו-אלקטרונים ברזולוציה גבוהה

סיכום

כאן, אנו מציגים צינור לכרסם קרן יונים ממוקדת מתאם תלת-ממדי על הנחיית הכנת דגימות תאיות לטומוגרפיה קריו-אלקטרונית. המיקום התלת-ממדי של חלבונים בעלי תיוג פלואורסצנטי נקבע תחילה על ידי מיקרוסקופ קריו-פלואורסצנטי, ולאחר מכן מיועד לכרסום. הפרוטוקול מתאים לתאי יונקים, שמרים וחיידקים.

תקציר

טומוגרפיית קריו-אלקטרונים (cryo-ET) הפכה לשיטת הבחירה לחקר אולטרה-מבנה תאי וקומפלקסים מולקולריים במצבם הטבעי, קפוא. עם זאת, cryo-ET דורש שהדגימות יהיו דקות מספיק כדי לא לפזר או לחסום את קרן האלקטרונים של האירוע. עבור דגימות תאיות עבות, ניתן להשיג זאת על ידי כרסום קרן יונים ממוקדת הקפאה (FIB). פרוטוקול זה מתאר כיצד להתמקד באתרים סלולריים ספציפיים במהלך כרסום FIB באמצעות גישה תלת-ממדית מתאמת, המשלבת נתוני מיקרוסקופ פלואורסצנטי תלת-ממדי עם מידע ממיקרוסקופ אלקטרונים סורק FIB. באמצעות טכניקה זו, ניתן למקד אירועים ומבנים תאיים נדירים בדיוק גבוה ולהמחיש אותם ברזולוציה מולקולרית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים קריו-שידור (cryo-TEM).

מבוא

כרסום קרן יונים ממוקד מאפשר הכנת דגימות ביולוגיות דקות מדגימות קבועות בהקפאה ללא הבעיות הקשורות בדרך כלל לחתכים מכניים כגון סימני סכין וחפצי דחיסה¹. בשילוב עם טומוגרפיה קריו-אלקטרונית, כרסום FIB מאפשר מחקרים ביולוגיים ברזולוציה גבוהה של המורפולוגיה התאית וקביעת המבנה של קומפלקסים מקרומולקולריים ישירות מתוך תאים ברזולוציה תת-ננומטרית ^2,3,4. בעוד מינים רבים, כגון ריבוזומים, נמצאים בקלות בלמלות FIB שנחתכו באופן אקראי, תהליכים תאיים רבים מסתמכים על קולוקליזציה של מספר קומפלקסים או ממוקמים לאתרים ספציפיים בתוך התא. כתוצאה מכך, מיקוד יעיל נדרש כדי לא לאבד את התכונה הביולוגית של עניין במהלך תהליך הכרסום ולהיות מוגבל לפגיעות אקראיות. לכן יש צורך בגישה מתאמתית המשלבת נתונים ממיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM)-FIB ומיקרוסקופ אור קריו-פלואורסצנטי (FLM). בעוד שניתן להשמיט את המתאם הראשוני ולשלב נתוני FLM ו- cryo-ET רק לאחר רכישת TEM^5,6, כרסום קרן יונים ממוקד מונחה פלואורסצנטיות מאפשר בחירה מדויקת של אזור הכרסום מראש^, ובכך מביא לאיסוף נתונים יעיל יותר. מאז תפיסתו⁷, היישום של כרסום FIB מתואם תלת-ממד במחקרים ביולוגיים היה מוגבל עד שדיווחנו לאחרונה על זיהוי תא חדש המופרד פאזה נוזלי-נוזלי (LLPS) בשמרים באמצעות טכניקה זו⁸.

מתואר כאן פרוטוקול מיקרוסקופ אור ואלקטרונים תלת-ממדי מתואם קריו-ממדי (CLEM), שניתן להשתמש בו כדי לחקור מגוון רחב של דגימות, החל מחיידקים ועד תאי שמרים ויונקים. בעוד שהניסויים בוצעו באמצעות סט מסוים של מכשירים, השלבים הבודדים אינם כבולים לחומרה ספציפית וניתן להעביר אותם בקלות למערכות אחרות כהרחבה לפרוטוקולים קיימים ^3,5. רשימה של ציוד נבדק והגדרות מוצעות מופיעות בטבלת החומרים ובטבלה 1. ארבעת השלבים העיקריים של הצינור הם: (1) הכנת דגימות, (2) לוקליזציה של תכונות מעניינות באמצעות מיקרוסקופ קריו-פלואורסצנטי, (3) כרסום קרן יונים ממוקד במתאם תלת-ממדי, ו-(4) לוקליזציה של המבנים המיועדים לרכישת נתוני קריו-ET על הלאמות במיקרוסקופ אלקטרונים קריו-הולכה (איור 1).

פרוטוקול

איור 1: סיכום זרימת העבודה עם מבחר שלבים קריטיים. הפרוטוקול כולו מחולק לארבעה שלבים בהתאם לציוד בו נעשה שימוש: הכנת דגימה, כולל הקפאת צלילה, מיקרוסקופ קריו-פלואורסצנטי, כרסום קרן יונים ממוקד קריו, ומיקרוסקופ אלקטרונים קריו-אלקטרונים. עבור כל שלב, מספר נקודות מפתח מודגשות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

1. תרבית תאים והקפאת רשתות

1. תרבית תאים לפי בחירה ומיטוב אסטרטגיות התיוג והטיפול בטמפרטורת החדר לפני המעבר לניסויים בהקפאה. מטרות מעניינות מסומנות באמצעות איחוי חלבונים פלואורסצנטיים או צביעה חיה (למשל, Halo-Tag, LysoTracker, BODIPY, צביעת נוגדנים חיים וכו '). אם יש צורך בטיפול בחומרים כימיים או ביולוגיים (מולקולות קטנות, מדיה מיוחדת, siRNA וכו ') כדי לחקור את התהליך הביולוגי המעניין, מטב את התנאים (למשל, זמן, ריכוז) באמצעות הדמיית FLM של תאים חיים.
   1. ודא שניתן למקם בהצלחה את האתרים המעניינים מעל הרקע במספר מספיק של תאים באמצעות הגדרות הדמיה התואמות ככל האפשר לתנאי הקפאה מאוחרים יותר (כלומר, NA, זמן חשיפה וכו ').
2. בחירה והכנה של רשתות
   1. בחר רשתות עם גודל חורים וריווח המתאימים לתאים ולסמנים הפידוקיאליים שנעשה בהם שימוש (ראה שלב 1.3.1). אין להשתמש בסרט רציף ללא חורים מכיוון שהדבר עלול לגרום ליותר מדי חיץ שיורי לאחר הכתמים ובכך להפחית את יעילות הוויטריפיקציה ולעכב את זיהוי החרוזים. למגע ממושך של התאים עם הרשתות, ודא שתמיכת הרשת וחומר הסרט תואמים ביולוגית.
   2. פלזמה לנקות את רשתות cryo-EM כדי להפוך אותם הידרופיליים יותר. לשימוש בתרבית תאים דבקים, יש לעקר את הרשתות לאחר ניקוי פלזמה עם קרינת UV למשך 20 דקות במכסה מנוע זרימה למינרית. לחלופין, ניתן לטפל מראש ברשתות באמצעות תרכובות המסייעות בהידבקות תאים, כגון פולי-L-ליזין או קונקנבלין A, כמתואר להלן.
      הערה: באופן כללי, שילובי הרשת/הדגימה הבאים שימשו בהצלחה בתהליך העבודה של cryo-FIB מתאם: שמרים: Cu או Au, 200 mesh, R1/4 פחמן או סרט SiO₂ , מצופה אופציונלית ב- concanavalin A; Escherichia coli: Cu או Au, 200 mesh, R1/4 פחמן או סרט SiO₂ ; Chlamydomonas reinhardtii: Cu או Au, 200 mesh, R1/2 או R1/4 פחמן או סרט SiO₂ ; HeLa: Au, 200 רשת, סרט R1/4 SiO₂ , מצופה פולי-L-ליזין; HEK293: Au, 200 רשת, סרט R1/4 SiO₂ , מצופה פולי-L-ליזין.
   3. Concanavalin ציפוי לשיפור החיבור של תאי שמרים:
      • הכינו תמיסת ציפוי של 1 מ"ג/מ"ל של concanavalin A בחיץ HEPES של 10 mM עם 100 μM CaCl₂, pH 8.5. מניחים טיפה אחת (50 μL) מתמיסת הציפוי ושתי טיפות מים מזוקקים בנפרד על חתיכת סרט פרפין.
      • הרימו את הרשת המנוקה בפלזמה עם פינצטה בכוח הפוך והכניסו אותה בזהירות לתוך טיפת תמיסת הציפוי, תוך הימנעות מתנועות בניצב לרשת כדי למנוע נזק לסרט.
      • לאחר ~ 5 שניות דגירה, שטפו את הרשת פעמיים על ידי הכנסתה לטיפות המים באופן דומה. לבסוף, יש להסיר את עודפי הנוזל על ידי מריחת נייר סינון על גב הרשת ולתת לרשת להתייבש לחלוטין לפני שחרורו מהפינצטה. השתמשו ברשתות המיובשות להקפאת צלילה.
   4. ציפוי פולי-L-ליזין לתרבית תרחיף ותאים דבקים:
      • הכינו תמיסת ציפוי של 1 מ"ג/מ"ל של פולי-ל-ליזין במאגר נתרן בוראט 0.1 מ', pH 8.5.
      • מניחים רשתות מנוקות פלזמה לתוך צלחת מתאימה לתרבית תאים ולעקר במשך 20 דקות על ידי קרינת UV.
      • הוסיפו בעדינות מספיק תמיסת ציפוי כדי לכסות את כל הרשתות ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך שעתיים לפחות. שאפו את הנוזל ושטפו בעדינות את הרשתות פעמיים עם PBS לפני זריעת התאים לריכוז הרצוי.
3. הכנת תאים וחרוזים fiducial
   הערה: חרוזים Fiducial נדרשים לרישום תלת-ממדי של נתוני הפלואורסצנטיות עם תמונות שצולמו במיקרוסקופ FIB/SEM כדי לאפשר כרסום FIB מתאם תלת-ממדי.
   1. בחר חרוזים הניתנים לזיהוי בכל שיטות ההדמיה, כלומר FLM, SEM ו- IB (קוטר מומלץ 0.5-1 מיקרומטר), אך ודא שהם אינם עולים על מבנה המטרה התאית במהלך הדמיה פלואורסצנטית כדי להקל על הבחנה בין החרוזים לבין התכונה הביולוגית המעניינת. הסר חומרים משמרים ציטוטוקסיים בחרוזים פידוקיאליים (למשל, NaN₃) לפי הוראות היצרן.
      הערה: להבחנה קלה יותר בין התכונות הביולוגיות של העניין לבין הפידוקיאלים, כדאי אם ספקטרום הפליטה הפלואורסצנטי חופף רק באופן חלקי, כך שניתן יהיה להבחין בין אותות בהתבסס על הבדלי עוצמה בתעלות FLM.
   2. אם נעשה שימוש בתרבית תרחיף, יש לגדל את התאים לצפיפות מתאימה (למשל, שמרים OD 600 = 0.8, E. coli OD 600 = 0.8-1.0, C. reinhardtii ₁₅₀₀ תאים/μL) ולבצע טיפולים כנדרש לניסוי כגון שינוי תווך, הוספת כימיקלים, רעב וכו '. חבר את הרשתות המנוקות בפלזמה לפינצטה כנדרש בשיטת הצלילה (ידנית/אוטומטית), והחל 4 μL של מתלה התא מעורבב עם ~ 1 x 10⁵ חרוזים / μL של תרחיף חרוזים fiducial בצד הסרט של הרשתות.
      הערה: לקבוע את הדילול האופטימלי של תאים ופידוקיאלים בניסויי טיטרציה (למשל, על ידי בדיקת cryo-FLM או FIB/SEM, ראה להלן). עם זאת, עבור רוב התאים הגדלים בתרחיף, ריכוז סופי של ~ 1 x 10⁵ חרוזים / μL של 1 מיקרומטר חרוזים fiducial (דילול 1:20 מהמלאי; ראה טבלת חומרים לפרטים) הוכיח נקודת התחלה טובה.
   3. אם משתמשים בתרבית דבקה, יש לנקות את הפלזמה ולעקר את הרשתות באמצעות קרינת UV לתרבית אספטית. במידת הצורך, יש לצפות מראש רשתות בתרכובות המסייעות להידבקות התאים (למשל, פולי-ל-ליזין, פיברונקטין ולמינין; ראה שלב 1.2.2). זרעו וגדלו תאים על הרשתות בצלחות תרבית רגילות או בצלחות עם חלוקות משנה לרשתות.
   4. התייחס לדגימות לפי הצורך לניסוי ושמור על התאים בתנאים אופטימליים רק עד לקיפאון (למשל, 37 ° C / 5% CO₂ עבור HEK / HeLa). מוציאים בזהירות את הרשתות מצלחת התרבית ומחברים אותן לפינצטה הצוללת. יש למרוח 4 μL של מדיום התרבית מעורבב עם fiducials (1 x 10,⁵ חרוזים/μL עבור 1 μm fiducials) על הצד הנושא את התא.
4. להקפיא את התאים באמצעות הליך הקפאה ידני או אוטומטי. במידת האפשר, רק כתם את הרשת מהצד הנגדי לתאים כדי למנוע נזק מכני לתאים (איור 2A). במערכות צלילה אוטומטיות בעלות שתי זרועות, השיגו זאת על ידי הנחת יריעת פוליטטרה-פלואוראתילן (למשל, טפלון) במקום נייר ניקוי על הפד הפונה לתאים. העבירו את הרשתות לקופסאות אחסון ושמרו אותן בחנקן נוזלי (lN₂) עד לשימוש.
   אזהרה: lN₂ וחומרים קריוגנים אחרים עלולים לגרום נזק חמור לעיניים ולעור. השתמש בציוד מגן אישי (PPE) ועבוד רק בחלל מאוורר היטב כדי למנוע הצטברות של ריכוזי N₂ מסוכנים.
   הערה: כל השלבים הבאים צריכים להתבצע בצורה הטובה ביותר בשלב הנוזלי של lN₂ כדי למנוע זיהום של משטחי התא והלמלה, מכיוון שהדבר עלול לסבך את העיבוד במורד הזרם. צמצם מגע עם גבישי קרח צפים על ידי שימוש תמיד בחנקן נוזלי נקי (למשל, מסנן להסרת קרח צף), ביטול שלבי העברה מיותרים, ואם אפשר, עבודה בסביבה מבוקרת לחות.
5. הרכיבו וחתכו את הרשתות הקפואות ב-AutoGrids עם מגרעת והתאים הפונים כלפי מעלה (איור 2A) לצורך דימות קריו-פלואורסצנטי וכרסום FIB לאחר מכן. כדי להבטיח יישור תקין של הדגימות ב- TEM, כיוון הכרסום צריך להיות אורתוגונלי לציר ההטיה cryo-ET. בהתאם לכך, מקמו את סימני הכיוון (לדוגמה, צריבה בלייזר או נקודות סמן נשלפות) על רשתות אוטומטיות לפני הגזירה כדי לסייע ביישור זה (איור 2A).
6. מסך את איכות הרשת (איור 2B) ב-cryo-FLM וב-FIB/SEM. מטב את צפיפות התא, זמן הניקוי והכוח כדי לקבל פיזור שווה של תאים וחרוזים. השתמשו בדימות אור מוחזר במיקרוסקופ קריו-פלואורסצנטי או השתמשו ב-cryo-FIB-SEM כדי לוודא שגם התאים וגם החרוזים נראים בבירור (איור 2B, חיצים לבנים).
7. במידת הצורך, חזור על הצניחה בתנאים טובים יותר, כגון ריכוז תאים משתנה ו / או זמן ניקוי. לאחר שנמצאו פרמטרים מתאימים לצניחה, אל תחזור על סינון הרשת עבור כל סבב חדש של ניסויים.

איור 2: סינון רשתות מתאימות באמצעות SEM ו-IB . (A) יש להציב סימני כיוון על הרשתות האוטומטיות בניצב לכיוון הכרסום כדי לפשט את הטעינה הנכונה לתוך ה-TEM. התאים מותקנים כשפניהם כלפי מעלה ברשת האוטומטית שהורכבה. (B) לאחר הקפאת צוללת, רשתות נבדקות ב- SEM כדי להעריך ולמטב את תנאי הצניחה: א) לא צריכים להיות יותר מדי תאים בכל רשת. עבור תאי HeLa, למשל, אין להשתמש ביותר מ 1-4 תאים / ריבוע. עבור תאים קטנים יותר כגון Saccharomyces cerevisiae (מוצג כאן), גושים של 4-6 תאים נמצאו שימושיים. ב) חרוזים פידוקיאליים (חיצים לבנים) צריכים להיות גלויים בבירור, ולא צריך להיות יותר מדי חיץ סביב התאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

2. מיקרוסקופ אור Cryo-fluorescence

1. עבור כל רשת, קבל סקירה כללית בניגודיות פלואורסצנטית ודיפרנציאלית (DIC) (שדה רחב) או במצב שיקוף ובחר ריבועי רשת מתאימים עם אות פלואורסצנטי. בחר שדות ראייה המכילים הן את התאים המעניינים והן מספר מספיק של סמני נאמנות (6-12).
   1. ודא שהתאים והחרוזים מפוזרים באופן שווה, לא צפוף מדי, לכיוון מרכז כל ריבוע. בחרו רק ריבועים הנגישים הן למכשיר FIB-SEM והן למכשיר TEM, ומכאן שהם מרוחקים לפחות שלושה ריבועים מקצה הרשת ב-200 רשתות רשת (איור 3A, בתוך העיגול האדום).
2. בכל אחד מריבועי הרשת שנבחרו, קבל ערימה פלואורסצנטית עם שלב מיקוד המתאים לדקונבולוציה מאוחרת יותר, כלומר, <1/2 מגבלת הרזולוציה הצירית. במידת האפשר, השתמש במטרות צמצם מספרי גבוה (NA) כדי להגדיל את ספירת הפוטון ואת דיוק הלוקליזציה.
   1. במיקרוסקופ קונפוקלי עם מטרה NA 0.9, רכשו ערימות בגודל צעד של 300 ננומטר, תוך דגימת יתר של ערך נייקוויסט. הקליטו ערימות צבעים מרובות במידת הצורך (איור 2B). אחסן רשתות מתחת ל-lN₂ עד לשימוש חדש.
      הערה: כדי לקבוע את גודל השלב האופטימלי, בחר את הערכים המחושבים על-ידי תוכנת בקרת המיקרוסקופ או השתמש בכלים מקוונים⁹. בדוק אם יש דימום של אות בין ערוצים מכיוון שדימום מוגזם מזיק לניסויי קולוקליזציה. עם זאת, חלקם עשויים להיות יתרון לתקן סטיות כרומטיות בערימות מרובות צבעים.
3. Deconvolve ערימות באמצעות תוכנה מתאימה^10,11 ופרוס מחדש⁷ אותם אם נדרש גודל פיקסל איזוטרופי. דה-קונבולוציה – בדיוק כמו בטמפרטורת החדר – מנקה את אות ה-FLM ועשויה לשפר את דיוק הלוקליזציה (איור 3C).

איור 3: בחירת ריבועים לרכישת מחסנית FLM ושיפור נתונים באמצעות דה-קונבולוציה. (A) סקירה כללית של רשת עם תאי שמרים המבטאים eGFP-Ede1 (ירוק) ו-mCherry-Atg8 (מגנטה). בחרו מיקומים עם פיזור טוב של חרוזים ותאים, אך הימנעו מקצות הרשת (אדום מוצלל). הקופסאות מציינות מיקומים עם התפלגות תאים טובה שבהם נלקחו ערימות פלואורסצנטיות. (B) הקרנה בעוצמה מרבית (MIP) של ערימת הצבעים המרובים שצולמה על הריבוע בקופסה הצהובה (מ-A) לאחר דה-קונבולוציה. דה-קונבולוציה של ערימות FLM מנקה באופן משמעותי אותות רקע לא רצויים ומסייעת למקם חרוזים ב-z בצורה מדויקת יותר, כפי שניתן לראות מהתקפי גאוס לפני (C) ואחרי דה-קונבולוציה (D) (ההתאמות בוצעו ב-3DCT ומוצגות עבור החרוז המסומן ב-1). התמונות מציגות תצוגות MIP מוגדלות של הערוץ האדום (עירור: 552 ננומטר, פליטה: 585-650 ננומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

3. כרסום קרן יונים ממוקד

1. טען את הרשתות לתוך מכשיר cryo-FIB-SEM והשתמש בסימני החיתוך ו/או הכיוון כדי להבטיח כיוון מתאים למיקום מאוחר יותר ב-TEM (איור 2A). ודא שכיוון הכרסום מאונך לציר ההטיה של ה- TEM.
2. השתמש במערכת הזרקת גז (GIS; CpMePtMe₃) בעמדות הבמה שהוגדרו מראש על ידי מערך FIB-SEM כדי לצפות את הרשתות בשכבה אורגנומטלית מגינה. אין למרוח יותר מדי, מכיוון שהדבר עלול להפריע ללוקליזציה של חרוזים פידוקיאליים ב- TEM מאוחר יותר. השתמשו בציפוי פלזמה כדי למרוח פלטינה מתכתית כדי להפחית את טעינת הדגימה.
   הערה: אם אין הגדרות זמינות עבור ציפוי GIS, ניתן למצוא אותן בקלות על ידי ביצוע סבבים רצופים של ציפוי קצר (~ 2 שניות), ולאחר מכן כרסום FIB. ודא שעדיין ניתן לחתוך את הדגימה בהצלחה בזרמים בינוניים (~ 100 pA) ללא שוליים נראים לעין של שכבת האורגנומטלית המגנה סביב קצוות הלמלה. הן הזמן והן המרחק של מחט ה- GIS (ביחס לדגימה) הם פרמטרים חשובים שיש לקחת בחשבון. אין להפעיל את מחט ה-GIS בטמפרטורת החדר (כלומר, 45°C), אך קרה ככל האפשר כדי לספק ציפוי אחיד (25-27°C).
3. הקלט סקירה כללית של רשת SEM ובצע מתאם דו-ממדי עם סקירות FLM כדי למצוא את ריבועי הרשת שעבורם נרשמו ערימות פלורסנט. בדוק ידנית את שתי התצוגות או השתמש בחבילות תוכנה שונות 7,10,12 כדי למצוא את ריבועי הרשת. כאן, המוקד הוא על ארגז הכלים למתאם תלת-ממדי (3DCT)⁷, המשתמש בטרנספורמציה תלת-ממדית של גוף קשיח עם קנה מידה איזוטרופי בין תצוגות. הדרכה מצוינת על פונקציות 3DCT זמין באינטרנט¹³.
   1. בחר וסמן לפחות ארבעה מיקומים תואמים, לדוגמה, ציוני דרך כגון פסי רשת או חורים בסרט התמיכה, הן בסקירת הרשת FLM והן ב- SEM (לחיצה ימנית) וחשב את שינוי הצורה בין הנקודות המסומנות (קורלציה).
   2. לאחר מכן, מקם את הסמנים במרכז ריבועי הרשת המתאימים שעבורם נרכשו ערימות FLM וחזה את מיקומם בתצוגת SEM (קורלציה; איור 4A).
4. עבור כל ריבוע רשת מתואם, צלם תמונת קרן יונים (IB) בזרם נמוך (≤10 pA) בזווית כרסום FIB לפי בחירתך (10°-25° עבור מעבורת 45° לפני הטיה). בחר שדה ראייה (כלומר, מיקום והגדלה) התואם לנתוני הפלואורסצנטיות. עבור 200 רשתות רשת, קבל נתונים פלואורסצנטיים ונתוני FIB/SEM כדי להכיל ריבועי רשת בודדים, כולל פסי הרשת (ראה איור 3A ואיור 4A).
   הערה: הכרסום צריך להתבצע בזווית רדודה ככל האפשר כדי למנוע איבוד טווח זוויתי משמעותי במהלך cryo-ET ולאפשר זיהוי של מספר מספיק של חרוזים fiducial. לדוגמה: עם הטיית במה של 17°, הטיה מראש של מעבורת של 45°, והטיה של קרן FIB של 52° ביחס לצניחה, ההטיה מראש של lamella היא 10°, אשר כמעט עונה על הטווח הזוויתי המועדף של ±60° ב- TEM על ידי הטיה מ- -50° ל- +70°, המקסימום של מחזיקי קריו-TEM רבים.
5. צלם תמונת SEM של אותו ריבוע כדי לסייע בזיהוי חרוזים תואמים בתצוגת פלואורסצנטיות וקרן יונים.
6. בצע רישום של מחסנית FLM תלת-ממדית מפותלת ותצוגת קרן יונים דו-ממדית עבור כל מיקום עם 3DCT כמתואר בשלבים הבאים (איור 4B).
   1. טען את מחסנית FLM התלת-ממדית המותאמת ואת תצוגת קרן היונים (IB) המתאימה ב- 3DCT.
      הערה: ניתן לטעון נתוני פלואורסצנטיות של צבעים מרובים כעד שלושה קובצי ערימה נפרדים של ערוץ יחיד.
   2. בחר 4 חרוזים פידוקיאליים בנתוני הפלואורסצנטיות ולחץ לחיצה ימנית על רשימת המיקומים כדי לקבוע את מיקומם התלת-ממדי באמצעות התאמת האות על ידי גאוס ב- x, y ו- z. בחר את החרוזים המתאימים בתמונת IB ובצע מתאם תלת-ממדי ראשוני (קורלציה).
   3. הוסף באופן איטרטיבי חרוזים נוספים בתמונה הפלואורסצנטית, מקד את מיקומם התלת-ממדי וחזה את מיקומם בתצוגת IB כדי להוסיף במהירות חרוזים נוספים לרישום ולבדוק את דיוק המתאם. ב- 3DCT, ערכי שגיאת שורש-ממוצע-ריבוע (RMSE) מסופקים כדי להעריך את עקביות המתאם⁷.
      1. ודא שערכי RMSE קטנים ובסדר דיוק הלוקליזציה (~300 ננומטר). כדי לקבוע את דיוק הקורלציה, השמט כמה חרוזים פידוקיאליים הניתנים לזיהוי ברור הן בפלואורסצנטיות והן בקרן יונים בכוונה במהלך שלב הרישום. עשו זאת על ידי בדיקת מיקומם החזוי לעומת המיקום בפועל בתמונת קרן היונים. אם המיקום החזוי שונה באופן משמעותי מן האמיתי, לחזור על המתאם הראשוני עם קבוצה חדשה של fiducials.
         הערה: מתאם 6-8 חרוזים הוכח כמספיק לרישום מדויק של ערימות FLM ותצוגות IB. עם זאת, הוספת חרוזים נוספים (עד 12-15) על פני טווח רחב של ערכי z (למשל, על ידי בחירת חרוזים בסרגל הרשת או בריבועים סמוכים) עשויה לשפר את דיוק הקורלציה.
   4. בחר את האותות הסלולריים הממוקדים, התאם את מיקומם התלת-ממדי במחסנית FLM והחל את הטרנספורמציה כדי לחזות את מיקומי המטרה בתצוגת IB (איור 4B).
      הערה: כל ערך ברשימת מיקומי FLM, שאין לו מקבילה ברשימת IB, יטופל כאות לחיזוי.
7. עבור כל ריבוע מתואם, העבירו מיקומים חזויים של התכונות המעניינות למכשיר FIB-SEM ומקמו תבניות כרסום למלה (איור 4C). העבר מיקומים באופן ידני (לדוגמה, על ידי מדידת המרחק לציוני דרך גלויים, כגון תאים או חרוזים פידוקיאליים) או השתמש באוטומציה ובסקריפטים כפי שהם מיושמים, לדוגמה, ב- SerialFIB¹⁴. אם יש אותות מרובים לכל תא, מקם את הדפוסים כך שיכללו כמה שיותר נקודות עניין (POI) באותה למלה כדי להגדיל את התפוקה.
8. תחילה גס, ולאחר מכן לטחון דק את lamellas לעובי סופי של 150-250 ננומטר. הימנע מצעדים (למשל, חתכים להפגת מתחים¹⁵) הגורמים לצניחה של הלמלה ובכך גורמים לתזוזה של התכונה הממשית של עניין ביחס לערימות FLM שנרכשו בעבר. השתמש בהליכי כרסום FIB ידניים³ או אוטומטיים^{של 14,16,17,18}. בכל אחת מהשיטות, ודא שהתכונה המעניינת נשארת במרכז הלמלה על ידי דילול סימטרי שלה מלמעלה ומלמטה.
9. כדי להעריך את דיוק הכרסום עבור כל למלה, בצע את אותו רישום כמו בשלב 3.4. עם זאת, הפעם, השתמש בתמונת IB הסופית לאחר כרסום FIB ובדוק אם המיקומים החזויים של התכונות המעניינות כלולים בתוך הלמלה הסופית. לחלופין, שכבו את ההקרנות המסובבות של ערימות FLM, שהתקבלו מהפלט של 3DCT ומסקריפטים מותאמים אישית¹⁹, עם תמונת IB הסופית (איור 4C, הוספה קטנה).

איור 4: הליך כרסום FIB מתאם תלת-ממדי . (A) מתאם דו-ממדי של סקירות FLM (משמאל) ו-SEM (מימין) של הרשת משמש לאיתור ריבועי הרשת שעליהם צולמו בעבר ערימות פלורסנט. (B) עבור כל ריבוע שנבחר, לאחר רישום תלת-ממדי ודו-ממדי של מיקומים פידוקיאליים תואמים ב-3DCT (תיבות צבעוניות), נבחרים מיקומים בעלי תכונות ביולוגיות מעניינות בנתוני FLM. בהתבסס על חיזוי המיקומים המתאימים בתמונת קרן היונים (עיגולים אדומים), נבחרים אתרים להכנת למלה. (C) מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) ותמונות קרן יונים (IB) משמשות כדי לשמור על המטרה ממורכזת במהלך הכרסום. עוביים סופיים של 150-250 ננומטר נמצאו מתאימים לעיבוד נוסף במורד הזרם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

4. TEM מתאם

1. טען את הרשתות לתוך TEM, וודא שכיוון הלמלה (כפי שניתן לראות מסימני חיתוך או כיוון) מאונך לציר ההטיה.
   הערה: ניתן לשלוט במיקרוסקופים של יצרנים שונים באמצעות תוכנות שונות, כגון Tomo5, TOM או SerialEM²⁰. כאן, המוקד הוא על האחרון.
2. רכוש מונטאז' רשת וסקירות עבור כל ריבוע רשת המכיל lamellas. ודא כי ההגדלה וזמן החשיפה מתאימים כדי לדמיין את החרוזים fiducial בתמונות TEM מבלי להוסיף באופן משמעותי את מינון האלקטרונים הכולל. רכוש מפות TEM ברזולוציה גבוהה (מונטאז'ים) של כל lamella.
3. Register ו- 3D-2D מתאמים את ערימת FLM עם ריבוע הרשת TEM וסקירות ה- lamella ב- 3DCT. השתמש באותו הליך המתואר בשלב 3.6 על ידי בחירת מיקומי חרוזים מתאימים בתמונות פלואורסצנטיות (x, y, z - התאמה גאוסיאנית) ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. לאחר מכן, בחר את עמדות העניין בערוצי FLM והעבר אותם לסקירות TEM. במידת הצורך, השתמש בהליך דו-שלבי הכולל מתאם ראשון בין FLM לבין TEM בהגדלה נמוכה, והשני מתאם TEM בהגדלה נמוכה לגבוהה (איור 5).
4. העבר מיקומים באופן ידני (על ידי מדידת מרחקים לציוני דרך), כלי הרישום והמפה הזמינים בתוך SerialEM²⁰, או תוכנה חיצונית כגון CorRelator²¹.
5. הגדר והפעל סדרות הטיה במיקומים מתואמים. השתמש בהגדלה, ביטול מיקוד ומינון כולל מתאימים (ראה טבלת חומרים וטבלה 1 לפרטים). התחל את הרכישה בהטיה מראש שנקבעה על ידי הלמלה (ראה גם הערה בשלב 3.4) והשתמש בסכמת הטיה סימטרית^{מינון 22}. השתמש ברכישה ידנית או אצווה.

איור 5: לוקליזציה של מיקומים מתואמים ב-TEM. לאחר כרסום FIB מוצלח במתאם תלת-ממדי והעברה למיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, מתבצע רישום תלת-ממדי עבור כל ריבוע טחון בין חרוזים פידוקיאליים (קופסאות צבעוניות) בערימות FLM וסקירות TEM כדי למקם אתרים פוטנציאליים עבור cryo-ET (עיגולים אדומים). לאחר מכן ניתן לרכוש סקירות למלה בהגדלה גבוהה יותר (התקרבות) כדי להגדיר טומוגרפיה בצורה מדויקת יותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תוצאות

הפרוטוקול מספק סיור בצנרת המשמשת לגילוי מרבץ החלבון האנדוציטי התלוי בתחום EH ואנדוציטוזה 1 (Ede1) (END) והפירוק והלכידה שלו בגופים אוטופגיים⁸. END הוא תא מופרד פאזה נוזלי-נוזלי בשמרי אפייה (S. cerevisiae), החוצץ מגוון חלבונים המעורבים באנדוציטוזה בתיווך קלאתרין (CME) לאחר אירועים אנדוציטיים כושלים. אחד המרכיבים העיקריים שלה הוא Ede1, אשר משמש כרכיב CME וכקולטן אוטופגיה סלקטיבית לפירוק תא LLPS חדש זה. בהתאם לכך, נעשה שימוש באיחוי EGFP של Ede1 (EGFP-Ede1) תחת שליטתו של מקדם האלכוהול דהידרוגנאז (ADH) כדי לדמיין ENDs מכיוון שביטוי יתר של Ede1 מפריע לשלבים המוקדמים של אנדוציטוזה ולכן גורם באופן מכונן LLPS.

ברשת קפואה עם תאי שמרים בעלי ביטוי יתר של EGFP-Ede1 וסמנים פידוקיאליים של 1 מיקרומטר, נבחרו חמישה מיקומים לרכישת מחסנית FLM בערוץ GFP (איור 6A; TFS Corrsight; מצב קונפוקל, גודל צעד מיקוד של 300 ננומטר, טווח של 10 מיקרומטר). הרשת הועברה למכשיר FIB (Quanta 3D FEG), וריבועי הרשת שעבורם נרכשו ערימות FLM זוהו על ידי ביצוע מתאם דו-ממדי של סקירות הרשת הפלואורסצנטיות וה-SEM (השווה שלב 3.2).

עבור כל אחד מהריבועים שנבחרו, תמונות קרן יונים צולמו בזרם נמוך (10 pA, הגדלה של 1200x), ומיקומים פידוקיאליים תואמים נרשמו ב- 3DCT. לאחר בחירת מיקומים בעלי תכונה ביולוגית מעניינת והתאמת המיקום התלת-ממדי שלהם בתוך ערימת ה-FLM, הטרנספורמציה שנמצאה יושמה על מיקומי END משוערים, ונבחרו האתרים להכנת למלה (איור 6B). קרן FIB הנוטה 11° ביחס למשטח הרשת שימשה בדוגמאות המוצגות כאן (45° FIB מעבורת pre-tilt; הטיית שלב 18°). מיקומים מעניינים הועברו, ותבניות FIB שורטטו באופן ידני (איור 6D) על-ידי מדידת המרחק של המיקומים החזויים ביחס לציוני דרך בולטים בתמונת FIB (למשל, חורים, זיהומי קרח, חרוזים פידוקיאליים). דיוק הרישום הוערך על ידי השמטת חרוזים שניתן היה לזהות בבירור בתמונת FLM ו-IB, ולאחר מכן השוואת מיקומם בפועל והחזוי בתצוגת קרן היונים (למשל, יהלום באיור 6B,C). המתאם עבור הריבוע המוצג באיור 6C נמצא מדויק (כלומר, המיקום החזוי של מיקומי חרוזי FLM חפף באופן מושלם עם מיקום IB המתאים שלהם וערכי RMSE של תת-פיקסלים המדווחים ב-3DCT עבור הרישום). לפיכך, למלות נחתכו במיקומים החזויים (אתר B) וטחנו דק לעובי של ~200 ננומטר (קיזוז תבנית סופית).

איור 6: תוצאות מייצגות עבור מיקוד תלת-ממדי של משקעי חלבון אנדוציטי (END) בשמרים. (A) סקירת SEM של הרשת לפני הכרסום. הקופסאות הצבעוניות מציינות ריבועי רשת שעבורם נלקחו מראש ערימות פלואורסצנטיות. (B-C) מתאם תלת-ממדי בריבוע רשת. לאחר רישום מספר חרוזים פידוקיאליים תואמים (קופסאות צבעוניות) בנתוני FLM (B, המוצגים כאן כהקרנה בעוצמה מרבית) ובתמונת קרן היונים (C), אומת הדיוק של הרישום התלת-ממדי על ידי חיזוי מיקום החרוז המצוין עם היהלום. לאחר מכן, נחזו מיקומי אות המטרה (עיגולים אדומים) בתצוגת קרן היונים עבור שני אתרי כרסום פוטנציאליים. (D) זום אין של אתר B המציג את המיקומים החזויים של שלושה פונקטה מטרה (עיגולים אדומים) ואת תבניות הכרסום הראשוניות (קופסאות צהובות). פונקטום פלואורסצנטי רביעי נחזה להיות נמוך בהרבה מהפונקטה השנייה ולכן לא היה ממוקד במהלך הכרסום (עיגול אפור). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

לאחר כרסום FIB מוצלח והעברת הרשת למיקרוסקופ אלקטרונים בשידור קריו-תמסורת (טיטאן קריוס פעל במהירות של 300 קילו-וולט וצויד בגלאי אלקטרונים ישיר Gatan K2 ובמסנן אנרגיה ביוקוונטית), נרשמה סקירת רשת ב-SerialEM ושימשה לאיתור ריבועים עם למלות. עבור כל למלה נרכשו תמונות סקירה, ונתוני FLM נרשמו ב-3DCT (3D-2D) באמצעות חרוזים פידוקיאליים תואמים. מיקומים של המאפיינים הביולוגיים המעניינים (איור 7A) נחזו לאחר מכן באמצעות הטרנספורמציה שחושבה מהחרוזים הפידוקיאליים. סקירות Lamella שתועדו בהגדלה גבוהה יותר נתפרו, ואתרים מעניינים היו מתואמים באמצעות ציוני דרך גלויים בבירור (למשל, חרוזים fiducial). לחלופין, ניתן להפיק סקירות CLEM קלאסיות בתוכנות^{שונות 10,12}.

בהתבסס על המתאם, נמצאו ארבעה אתרים פוטנציאליים לרכישת טומוגרפיה עבור הלמלה המוצגת באיור 7A. אולם זה כולל גם מיקום שלא הותקף במהלך כרסום FIB מתואם תלת-ממד (השוו איור 6D; עיגול אפור) ומיקום שנחסם על-ידי זיהום קרח (איור 7; קופסאות אפורות). בהתאם לכך, ניתן היה להקליט טומוגרפיה רק עבור שתי עמדות (איור 7B). בסך הכל, הושגה הצלחה במתאם של ~75%, כלומר למלות ששרדו את המעבר למבני TEM ו-END באתרים החזויים (12 אתרים מתואמים). לאחר שחזור טומוגרפיה, סגמנטציה והתאמת תבניות, ניתן להמחיש מבני END בודדים בהקשר המקורי שלהם (איור 7C,D). זה כולל את הרשתית האנדופלסמית (ER) המקיפה את ה- END, טיפות שומנים מדי פעם יוצרות מגע, וריבוזומים, שאינם נכללים בתא LLPS. יחד, זה מראה כיצד כרסום FIB מתאם תלת-ממדי יכול לספק מידע ברמה המולקולרית של תהליכים ביולוגיים נדירים מתאים שלמים.

איור 7: תוצאות מייצגות להמחשת END עם cryo-ET. (A) סקירת TEM בהגדלה נמוכה של אתר הכרסום המוצגת באיור 6 יכולה להיות מתואמת בקלות עם היטל העוצמה המרבית FLM (איור 6B) כדי למקם מאפיינים ביולוגיים מעניינים (צלבים אדומים). (B) בשלב שני, ניתן להתאים תצוגה גבוהה יותר (תפורה), ולהגדיר מיקומים לרכישת טומוגרפיה (קופסאות צהובות). התעלמו ממיקומים שנבעו מהאות מחוץ למישור (תיבה אפורה, השוו איור 6D). (ג-ד) באמצעות גישת FIB תלת-ממדית זו, ניתן לדמיין את מרבץ החלבון האנדוציטי (END) בסביבתו הטבעית. מבנים כגון הרשתית האנדופלסמית (ER), ריבוזומים, ממברנות וטיפות שומנים ניתנים לזיהוי ולהמחשה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

הגדרות מנקה פלזמה
Harrick פלזמה מנקה PDG-3XG :	תדר רדיו setiing: "HI", 30 שניות; פלזמה N2
הגדרות בוכנה
TFS Vitrobot סימן IV:	100% לחות; blotforce = 8; blottime = 10 שניות; זמן המתנה 0 שניות; (זה אמור לעבוד עבור רוב תאי המתלה והדבק)
מיקומים ותזמונים של FIB GIS
Quanta 3D FEG:	הטיה = 0, סיבוב = -180, מיקום Z = 13.5, נקודת הגדרת טמפרטורה = 26.15° , זמן = 8 שניות
TFS Scios:	הטיה = 0, סיבוב = -180, מיקום Z = 9.8, נקודת הגדרת טמפרטורה = 28° C, זמן = 7 שניות
TFS Aquilos 1:	מיקום מוגדר מראש של תוכנה, נקודת טמפרטורה = 28°, זמן = 7 שניות
TFS Aquilos 2:	מיקום מוגדר מראש של תוכנה, נקודת הגדרת טמפרטורה = 28°, זמן = 7 שניות
הגדרות FIB Sputter Coater
מערכת מניין:	בתא הכנה מניין: 10 mA, 40 s
TFS Scios:	10 W, 500 V, 250 mA, 0.2 mbar, 15 שניות
TFS Aquilos 1:	1kV, 10 mA, 10 Pa, 15 שניות
TFS Aquilos 2:	1kV, 10 mA, 10 Pa, 15 שניות
רכישת טומוגרמה
טיטאן קריוס Gi2	מצלמת K2, מסנן אנרגיה ביוקוונטי Gatan
	חריץ 20 eV; ערכת הטיה סימטרית מינון (האגן) עם צעדים של 2°; התחל ב- +10° (lamella pre-tilt!) עד +70° ו- -50°
טיטאן קריוס Gi4	פלקון 4; מסנן האנרגיה Selectris X
	חריץ 10 eV; ערכת הטיה סימטרית מינון (האגן) עם צעדים של 2°; התחל ב- +10° (lamella pre-tilt!) ל- +70° ו- -50°
רכישת FLM
Corrsight (מצב קונפוקלי)	מטרה: Zeiss EC Plan-Neofluar 40×/0.9 NA Pol; פרמטרים של רכישת מחסנית: גודל פיקסל x-y = 161.25 ננומטר, גודל צעד z = 300 ננומטר.
Leica SP8 Cryo-Confocal	מטרה: Leica HCX PL APO 50x / 0.90 CLEM; פרמטרים של רכישת מחסנית: גודל פיקסל x-y = 84 ננומטר, גודל צעד z = 300 ננומטר.

טבלה 1: רשימת הציוד שנבדק וההגדרות המוצעות.

דיון

1. שלבים קריטיים בפרוטוקול

אופטימיזציה של תרבית תאים ופרמטרים של צניחת רשת היא בסיסית עבור זרימת עבודה זו. בתחילת הפרויקט, כדאי להשקיע זמן כדי לייעל אסטרטגיות תיוג, את התפלגות התאים ואת חרוזי fiducial, ולבדוק פרמטרים שונים של הכנת רשת ו blotting. עבודה עם דגימה קפואה אופטימלית תקל באופן משמעותי על עיבוד במורד הזרם.

כמו בכל ניסוי TEM, דגימות זגוגית נדרשות. עבור תאי יונקים גדולים כגון HeLa, 1-2 תאים לכל ריבוע רשת עדיפים, אך תאים עדיין עשויים להיות זגוגיים בצפיפות גבוהה יותר. לחלופין, ניתן לשפר את הוויטריפיקציה בתאי יונקים (למשל, HEK293, HeLa) על ידי דגירה שלהם עם גליצרול של 2.5-10% (v/v) שנוסף למדיום התרבית 10 דקות לפני צלילה²³. במידת האפשר, ניתן להשתמש בתבניות רשת כדי להבטיח מיקום ופיזור מושלמים של התאים, ובכך לשפר את הוויטריפיקציה ומתאם מאוחר יותר²⁴.

בעוד שניתן לבחור תאים ספציפיים במהלך זרימת העבודה, מעט מדי תאים המציגים את התכונה הביולוגית המעניינת יפחיתו באופן משמעותי את התפוקה הכוללת. כדי לשפר את המתאם בתאים חיוביים POI, יש להשתמש בפלואורופורים בהירים מספיק. זה חשוב במיוחד ברמות ביטוי אנדוגניות. מצאנו כי בתנאי קריו, mVenus לעתים קרובות תפקד טוב יותר מאשר EGFP בשל בהירותו המוגברת²⁵ והשינוי ההיפסוכרומי, מה ששומר אותו מתאים להגדרות מסנן GFP סטנדרטיות בתנאי הקפאה²⁶. עבור מבני מטרה שאינם דמויי נקודה, יש לשקול גם את הפשרה בין אורך גל לדיוק לוקליזציה (גבול עקיפה של Abbe).

מתאם תלת-ממדי יעיל דורש גם שהרשתות יהיו יציבות מבחינה מכנית ויטופלו בזהירות רבה. בעוד שניתן להשתמש ברשתות זהב או נחושת סטנדרטיות עם תמיכת פחמן, ניתן להגדיל את שיעור ההצלחה באופן משמעותי על ידי שימוש בסרטי SiO₂ קשיחים יותר בהתאם לפרויקט. עם זאת, עדיין לא נקבע באופן חד משמעי אם (א) יציבות מכנית או (ב) מקדמי התפשטות תרמית תואמים (מצע לעומת יריעה) להפחתת קמטים בהקפאה²⁷, הם הגורם המכריע ביותר למתאם תלת-ממדי מוצלח. יתר על כן, עבור להרים רשתות Au שבירות, מנות מצופות polydimethylsiloxane ניתן להשתמש⁵.

בנוסף להבטחת יציבות הדגימה, יש צורך בבחירה זהירה של פרמטרי הדמיה FLM לקבלת ערימות פלואורסצנטיות באיכות גבוהה המתאימות למיקוד אופטימלי במהלך כרסום FIB. בהקשר זה, מומלץ גם לבדוק טכניקות שונות של denoising²⁸ או deconvolution על נתוני FLM, שכן הוא עשוי לשפר במידה ניכרת את הלוקליזציה של fiducials ואותות סלולריים. כאשר מקשרים את האות הפלואורסצנטי לתמונות FIB-SEM, דגימה טובה של חרוזים פידוקיאליים חשובה. הם צריכים להיות מפוזרים היטב סביב התאים ואולי בגבהים z שונים. זה גם נוהג טוב לאמת את עקביות המתאם על ידי בדיקת המיקומים החזויים לעומת בפועל של חרוזים שהושארו בכוונה מחוץ למודל הפידוקיאלי אך ניתן לתאם בבירור בעין. יש לשקול תמיד גם את ערכי RMSE של 3DCT כדי לבדוק את עקביות הרישום.

מכיוון שקיעת חומר טחון ומים שיוריים מתא FIB-SEM (כלומר, זיהום מחדש) מגדילה את עובי הלמלה האפקטיבי על ידי הוספת חומר אמורפי לשני צדדיו, שמירה על למלות טחונות עדינות במיקרוסקופ למשך זמן ממושך בדרך כלל מפחיתה את איכות נתוני TEM עקב אירועי פיזור אלקטרונים נוספים. לפיכך, כרסום מבוצע לרוב בצורה דו-שלבית: ראשית, כל המיקומים נטחנים בערך (כלומר, לכ 800 ננומטר), ולאחר מכן דק (ל~ 150-250 ננומטר), והרשת נפרקת מיד לאחר השלמת הלמלה האחרונה. עם זאת, ניתן להשיג הצלחה קורלציונית טובה יותר על ידי עיבוד עמדות העניין באופן חכם באתר, ומכאן ביצוע כרסום גס ועדין על אותה למלה ישירות זו אחר זו, שכן זה לא משאיר זמן לכיפוף או עיוות. זה, עם זאת, מפחית את המספר המרבי של lamellas שניתן לייצר בכל רשת בהתאם לקצב זיהום מחדש של המערכת. בקצב של 20 ננומטר / שעה, 4-6 lamellas מיוצרים בתוך 1-1.5 שעות.

תנועה של הרשת כולה או של הלאמלות הגסות >300 ננומטר תגרום למתאם גרוע או לא מוצלח (ראו גם מגבלות שיידונו להלן). לכן יש לבדוק אותו באופן קבוע, למשל על ידי השוואת תמונות IB לפני, במהלך ואחרי כרסום FIB. אתרים המראים תנועה משמעותית (>300 ננומטר) יש להשליך. מטב את הכנת הדגימה (כלומר, בחירת סוג הרשת, צפיפות התא ופרמטרים של צלילה; ראה פרוטוקול סעיף 1) ואסטרטגיית כרסום כדי למנוע תנועות אלה. ניתן להפחית באופן משמעותי את כיפוף הלמלה על ידי כרסום מבחינת האתר כמתואר בשלב 3.6 והקטנת רוחב הלמלה. כפי שהוזכר קודם, בעוד חתכים להפגת מתח 15 תוכננו כדי להפחית את כיפוף הלמלה, הם לעתים קרובות גורמים^לתנועה מתואמת של הלמלה המנותקת, ובכך מונעים למעשה קורלציה. ניתן להשתמש במערכות FLM משולבות כדי לפתור בעיה זו.

2. שינויים ובעיות של השיטה

מומלץ מאוד לבצע אפיון יסודי של הדגימה בהדמיה של תאים חיים לפני היציאה לתנאי הקפאה. אופטימיזציה של דגימות התאים, תוכניות הטיפול, והידיעה לאיזה סוג של אות לצפות לפני הכניסה לזרימת העבודה הקרויה יכולה לשפר באופן משמעותי את שיעור ההצלחה שלה.

בתהליך העבודה המוצג כאן, מיקרוסקופ פלואורסצנטי עצמאי עם שלב קריו-שלב משמש לצילום הדגימות, ואחריו העברה של הרשתות למיקרוסקופ קרן היונים הממוקדת. עם זאת, הוא נבדק על מערכות שבהן מיקרוסקופ פלואורסצנטי משולב בתא FIB-SEM, ולכן אין צורך בהעברת דגימה כדי לקבל תמונות פלואורסצנטיות 29,30,31. באמצעות מערכות משולבות כאלה, ניתן לצלם עמדות עניין במהלך כרסום FIB ולאחריו כדי לבדוק את נוכחותו של אות הפלואורסצנטיות של המטרה מבלי להגדיל את הסיכון לזיהום הלמלות הסופיות. עם זאת, חשוב לזכור את הפרמטרים האופטיים של המיקרוסקופים המשומשים, כמו, למשל, מטרת NA נמוכה תגביל את הדיוק שבו ניתן למקם חרוזים ואותות מטרה. עם זאת, הגדרות FLM משולבות יסייעו גם להתמודד טוב יותר עם עיוותים קלים של רשתות ולמלות, מכיוון שניתן לעדכן באופן רציף ערימות FLM ולהשוות אותן לתצוגות SEM ו- IB עדכניות.

כחלופה להדמיית פלואורסצנטיות של הלמלה בין כרסום FIB ורכישת נתוני TEM, ניתן להשתמש בקורלציה שלאחר TEM כדי לאמת מיקום וכרסום נכונים של הלמלות ^5,6.

במהלך כל השלבים של זרימת העבודה המתאמת, אך במיוחד במהלך TEM, מומלץ ליצור שכבת-על של נתוני הפלואורסצנטיות המוקרנים בתמונות FIB-SEM/TEM. השקפות CLEM קלאסיות כאלה עוזרות להבין באופן אינטואיטיבי יותר איזה חלק של התאים נמצא בתוך הלאמלות. זה משמש גם כבדיקת שפיות שימושית כדי לאמת את דיוק הקורלציה.

3. מגבלות השיטה

גישת FIB עם מתאם תלת-ממדי דורשת דגימות שניתן לספק עם חרוזים fiducial. בהתאם לכך, שיטה זו מוגבלת כיום לרשתות קפואות. עבור דגימות קפואות (רקמות) בלחץ גבוה (HPF), כיום ניתן לבצע רק מתאמים דו-ממדיים. באופן פוטנציאלי, סמנים פידוקיאליים פנימיים (למשל, אברונים, טיפות שומנים מוכתמות) יכולים להיות פתרון לבעיה זו^32,33. שיעור ההצלחה הסופי של המתאם תלוי בגורמים רבים, כולל איכות הדגימה, מערך המיקרוסקופ הפלואורסצנטי, עובי הלמלה וגודל מבנה היעד. דיוק המתאם באמצעות גישת הרישום התלת-ממדית המתוארת מוערך בטווח של 200-300 ננומטר בתמונת IB הסופית, המקביל בערך לעובי האופייני של למלות^טחונות FIB 7. בהתאם לכך, מבנים תאיים קטנים בהרבה מזה יהיה קשה למיקוד כרגע. בנוסף, תנועה מוגזמת באתר הכרסום (>300 ננומטר) מפחיתה גם היא את דיוק הקורלציה, בעיה שניתן לטפל בה באמצעות הגדרות FLM המשולבות במכשירי FIB/SEM. Lamellas המראים עיוות חזק או כיפוף במהלך כרסום צריך, בכל מקרה, להיות מחוץ זרימת העבודה במורד הזרם.

בסך הכל, הדמיית קריו-פלואורסצנטיות מוגבלת כיום על ידי קריטריון עקיפה של Abbe. עם יישום שגרתי יותר (ומסחור) של שיטות cryo-FLM סופר-פתורות, מיקוד מדויק יותר של מבנים סלולריים עשוי להיות אפשרי, במיוחד כאשר משולבים ב- FIB/SEM לפעולה תוך כדי תנועה.

4. משמעות השיטה

במיוחד בהשוואה לטכניקות לא ממוקדות ופוסט-קורלציה, גישת כרסום FIB במתאם תלת-ממדי מאפשרת בחירת מיקומים מתאימים לפני שלב TEM הגוזל זמן ומשאבים. בכך הוא מאפשר איסוף נתונים יעיל יותר ותכנון פרויקטים. יתר על כן, הנתונים הפלואורסצנטיים המתואמים מוסיפים שכבת מידע שיכולה להיות חיונית לפענוח הטומוגרפיה ולשילוב תוצאות cryo-ET בפרויקטים בקנה מידה גדול, במיוחד כאשר מדובר במכלולי חלבונים לא מובנים או כאלה קטנים מדי להתאמת תבניות וממוצע תת-טומוגרפיה.

5. חשיבות ויישומים עתידיים פוטנציאליים

בשילוב עם זרימות עבודה מתקדמות כגון הרמת הקפאה מתוך דגימות HPF 34,35, נפח cryo-FIB-SEM 36 והדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה מעולה^26,37,38,39, הכנת למלה ממוקדת תלת-ממד מציעה את האפשרות לא רק לנתח תהליכים ביולוגיים בתאים מבודדים, אלא גם להפוך דגימות רקמות וחולים לנגישות לכרסם FIB וטומוגרפיה של אלקטרונים קריו-אלקטרונים. ככזה, הוא יאפשר דיסקציה של תהליכים פתולוגיים ברזולוציה גבוהה ובכך יהווה אבן בניין אינטגרלית לקראת ביופסיה בקנה מידה ננומטרי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Autogrids	Thermo Fisher Scientific / 1036173 תוצרת בית	(ללא חיתוך), 1205101 (עם חיתוך)
טבעות C	Thermo Fisher Scientific	1036171
Corrsight עם מודול קריו	Thermo Fisher Scientific		FLM אלטרנטיבה 1
Dynabeads MyOne COOH	Thermo Fisher Scientific	65011	מומלץ 1 & מיקרו; m חרוזים פידוציאליים
רשתות EM R1/4 SiO2	Quantifoil	N1-S13nAu20-01
Falcon 4 מצלמה w. מסנן אנרגיה פוסט-טור Selectris X	Thermo Fisher Scientific		מצלמה/מסנן חלופה 1
FIB Aquilos 1	Thermo Fisher Scientific		FIB חלופה 1
FIB Aquilos 2	Thermo Fisher Scientific		FIB חלופה 2
FIB Quanta 3D FEG	Thermo Fisher Scientific		FIB חלופה 3
FIB Scios	Thermo Fisher Scientific		FIB חלופה 4
K2 מצלמת פסגה w. מסנן אנרגיה לאחר עמודה 968 Quantum K2	Gatan		מצלמה/מסנן חלופה 2
Leica TCS SP8 עם מודול קריו	Thermo Fisher Scientific		FLM חלופה 2
מנקה פלזמה PDC-3XG
(0.25 מ"מ)	plastx24.de	11645	חתוך לאותם מידות כמו נייר סינון
TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi2	Thermo Fisher Scientific		TEM חלופה 1
TEM טיטאן קריוס XFEG 300 קילו V Gi4	תרמו פישר מדעי		TEM חלופה 2
THUNDER Imager  EM Cryo CLEM	Thermo Fisher Scientific		FLM אלטרנטיבה 3
Vitrobot Mark IV	Thermo Fisher Scientific		לחלופין, השתמש בבוכנה מנואל
נייר סינון Whatman	Sigma Aldrich	10311807	55 מ"מ; צריך לחתוך כך שיתאים ל-Vitrobot