הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

תכנון ופיתוח של מודל לחקר ההשפעה של חמצן משלים על המיקרוביום של סיסטיק פיברוזיס דרכי הנשימה

2.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62888

⸱

3 באוגוסט 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Molecular Biology & Biochemistry, University of California, Irvine, 3Department of Medicine, Massachusetts General Hospital, 4Department of Microbiology & Immunology, Geisel School of Medicine at Dartmouth, 5Swiss i-research and teaching institute

במאמר זה

סיכום

מטרת פרוטוקול זה היא לפתח מערכת מודל להשפעת היפרוקסיה על קהילות המיקרואורגניזמים של סיסטיק פיברוזיס דרכי הנשימה. מדיום כיח מלאכותי מחקה את הרכב הכיח, ותנאי התרבות ההיפרוקסית מדגימים את ההשפעות של חמצן משלים על קהילות מיקרוביות ריאות.

תקציר

קהילות מיקרוביות בדרכי הנשימה נחשבות לשחק תפקיד חשוב בהתקדמות של סיסטיק פיברוזיס (CF) ומחלות ריאות כרוניות אחרות. חיידקים סווגו באופן מסורתי על סמך יכולתם להשתמש או לסבול חמצן. חמצן משלים הוא טיפול רפואי נפוץ שניתן לאנשים עם סיסטיק פיברוזיס (pwCF); עם זאת, מחקרים קיימים על חמצן ועל המיקרוביום דרכי הנשימה התמקדו באופן שבו היפוקסיה (חמצן נמוך) ולא היפרוקסיה (חמצן גבוה) משפיעה על קהילות מיקרוביות הריאות האירוביות והפקולטיביות בעיקר. כדי לטפל בפער ידע קריטי זה, פרוטוקול זה פותח באמצעות מדיום כיח מלאכותי המחקה את הרכב הליחה מ- pwCF. השימוש בעיקור מסננים, המניב מדיום שקוף, מאפשר לשיטות אופטיות לעקוב אחר הצמיחה של חיידקים חד-תאיים בתרביות השעיה. כדי ליצור תנאים היפרוקסיים, מערכת מודל זו מנצלת טכניקות פולחן אנאירובי מבוססות כדי ללמוד תנאים היפרוקסיים; במקום להסיר חמצן, חמצן מתווסף לתרבויות על ידי התכתות יומית של בקבוקי סרום עם תערובת של חמצן דחוס ואוויר. כיח מ 50 pwCF עבר סטרינג יומי לתקופה של 72 שעות כדי לאמת את היכולת של מודל זה לשמור על תנאי חמצן דיפרנציאליים. רצף מטגנומי רובה ציד בוצע על דגימות כיח מתורבתות ולא תרבותיות מ 11 pwCF כדי לאמת את היכולת של מדיום זה כדי לתמוך בצמיחה של חיידקים קומנסליים ופתוגניים הנפוצים בליח סיסטיק פיברוזיס. עקומות גדילה התקבלו מ 112 מבודדים שהתקבלו מ- pwCF כדי לאמת את היכולת של מדיום כיח מלאכותי זה לתמוך בצמיחה של פתוגנים סיסטיק פיברוזיס נפוצים. אנו מוצאים כי מודל זה יכול תרבות מגוון רחב של פתוגנים ו commensals כיח CF, משחזר קהילה דומה מאוד כיח לא תרבותי בתנאים נורמוקסיים, ויוצר פנוטיפים תרבות שונים בתנאי חמצן שונים. גישה חדשה זו עשויה להוביל להבנה טובה יותר של השפעות בלתי צפויות הנגרמות על ידי שימוש בחמצן ב- pwCF על קהילות מיקרוביות בדרכי הנשימה ופתוגנים נשימתיים נפוצים.

מבוא

סיסטיק פיברוזיס (CF) היא מחלה גנטית המאופיינת בחוסר יכולת לנקות ריר סמיך מהריאות, מה שמוביל לזיהומים חוזרים ונשנים ולירידה בתפקוד הריאות המתקדמת, שלעתים קרובות גורמת לצורך בהשתלת ריאות או למוות. המיקרוביום דרכי הנשימה של אנשים עם סיסטיק פיברוזיס (pwCF) נראהלעקובאחר פעילות המחלה 1 , עם ירידה במגוון מיקרוביאלי הקשורים לתוצאות שליליות לטווח ארוך2,3. במחקרים קליניים של pwCF, טיפול בחמצן משלים קושר למחלה מתקדמת יותר4,5, אם כי באופן מסורתי, השימוש בטיפול בחמצן נתפס פשוט כסמן לחומרת המחלה6. מחקרים אחרונים מניסוי קליני של חולים עם כשל נשימתי הראו כי רמות חמצן גבוהות יותר של המטופל קשורות באופן פרדוקסלי לעלייה בזיהומים חיידקיים חמורים ותמותה גבוהה יותר7, דבר המצביע על כך שחמצן משלים עשוי לתרום לפתוגנזה של המחלה. ההשפעה של חמצן משלים על מיקרוביום הריאות סיסטיק פיברוזיס וקהילות מיקרוביות הקשורות לריאות ודמתי הנשימה לא נחקרה היטב.

לעתים קרובות לא ניתן לבצע מחקרים מכניים ישירות בנושאים אנושיים בשל קשיים לוגיסטיים וסוגיות אתיות פוטנציאליות הקשורות להתערבויות של תועלת רפואית לא ידועה או נזק. גישות תרגומיות המשלבות ביו-פיסצימנים אנושיים במערכות מודל יכולות להציע תובנות ביולוגיות חשובות במקרים אלה. בעוד היכולת להשתמש או לסבול חמצן היה באופן מסורתי מרכיב חשוב של סיווג מיקרוביאלי, מעט מאוד ידוע על איך הקדמה טיפולית של חמצן משלים לסביבה עלולה להרגיז קהילות מיקרוביות דרכי הנשימה. כדי לשפוך אור על ההשפעות הלא ידועות של חמצן משלים על המיקרוביום דרכי הנשימה של pwCF, היינו צריכים להתמודד עם שני אתגרים עיקריים; ראשית, יצירת מדיום תרבותי המהוער מבחינה פיזיולוגית את הרכב כיח CF; שנית, יצירת מערכת מודל המאפשרת שמירה על ריכוזי חמצן גבוהים בתרבות על פני פרקי זמן ממושכים.

מדיה כיח מלאכותי (ASM) נמצאים בשימוש נרחב כדי לחקות כיח ריאות ex vivo8,9,10, אבל אין קונצנזוס ברור על מתכון מסוים. פרוטוקול זה מתאר מתכון בינוני כיח מלאכותי ואסטרטגיית הכנה שתוכננה בקפידה כדי לתבח פיזיולוגית מ- pwCF. טבלה 1 מתארת את ערכי המתכון הנבחרים בהתבסס על ספרות שפורסמה. רכיבים כימיים בסיסיים ו- pH הותאמו לערכים שזוהו על ידי מחקרים של כיח CF אנושי11,12,13. חומרים מזינים פיזיולוגיים בריכוז נמוך נוספו באמצעות חלמון ביצה, אשר נכלל כמו 0.25% של נפח סופי10, כמו גם ויטמין ומתכת קורט מתערבב14,15. Mucin, המרכיב העיקרי של כיח16,נכלל ב 1% w / v14. למרות שעיקור מסנן אינטנסיבי יותר נבחר על פני הנוהג הקונבנציונלי יותר של עיקור חום כדי להפחית בעיות פוטנציאליות מפני denaturation הנגרמת על ידי חום של רכיבי מדיה חיוניים10. יתרון נוסף של עיקור מסנן הוא שהוא מייצר מדיה שקופה (עיקור חום יכול ליצור מדיה עכורה עקב משקעים ו קרישה של מלחים וחלבונים), ומאפשר מדיה כיח מלאכותי זה לשמש כדי לעקוב אחר צמיחה מיקרוביאלית המבוססת על עליות עכורה.

מערכת מודל זו לתרבות ההיפרוקסיקית מבוססת על טכניקות פולחן אנאירוביות שבהן מוסיפים חמצן ולא מוסרים, ויוצרים מודל להשפעת שימוש בחמצן משלים עבור pwCF. איור 1 ופרוטוקול התזת החמצן הנלווה מתארים את הרכיבים של מערכת שפיצוח חמצן, שניתן להשיג בעלות נמוכה מספקי מעבדה כלליים ומכלי בית חולים. מערכת זו מאפשרת ערבוב של חמצן דחוס ואוויר לריכוזים קבועים הנעים בין 21%-100% חמצן. השילוב של חיישן חמצן מאפשר אימות של ריכוז תערובת גז הפלט, כמו גם בדיקת הרכב גז הזרימה של בקבוקי סרום שהופצו בעבר כדי לוודא שתנאי החמצן נשמרו בטווח הרצוי.

פרוטוקול זה מתאר נהלים ליצירת מדיום כיח מלאכותי, בנייה ושימוש במערכת התזת חמצן, ויישום של שניהם על כיח CF תרבית בתנאי חמצן דיפרנציאליים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקר זה קיבל את אישור הוועדה לבדיקה מוסדית של השותפים (פרוטוקול מס' 2018P002934). קריטריון ההכללה כלל חולים מבוגרים עם סיסטיק פיברוזיס שסיפקו הסכמה מדעת בכתב למחקר. לא היה קריטריון אי-הכללה. על פי הנחיות הפרוטוקול, כל דגימות כיח נאספו מחולים עם סיסטיק פיברוזיס במהלך ביקור אשפוז מתוכנן עם הספק הקליני שלהם.

1. הכנה בינונית של כיח מלאכותי

הערה: הכמויות המפורטות כאן מיועדות לייצור של 1 ליטר של מדיום כיח מלאכותי סופי, ולהניח את ריאגנטים ספציפיים המפורטים בטבלת החומרים. יש להתאים מספרים עבור אמצעי אחסון אחרים או לשימוש של ריאגנטים שונים כדי להבטיח את אותו מוצר סופי. ראה טבלה 1 לריכוזים של יעד.

  1. תערובת כימית כיח מלאכותי (ASCM)
    הערה: ASCM מהווה 25% מהנפח הבינוני הסופי. הוא יציב מדף וניתן להכין אותו בכמויות גדולות או מראש. אם מכינים אותו לשימוש מאוחר יותר, יש לאחסן את התערובת הכימית ולאחסן אותה בבטחה בטמפרטורת החדר.
    1. מערבבים את פתרונות המניות הכימיים המרכיבים.
      1. הכן 1 M מלאי NaCl: להוסיף 58.44 גרם של NaCl לליטר מים סטריליים.
      2. הכן 1 M KCl: הוסף 74.55 גרם של KCl לליטר מים סטריליים.
      3. הכן 1 M MgSO4 מלאי: להוסיף 246.47 גרם של MgSO4·7H2O לליטר מים סטריליים, או 120.37 גרם של MgSO4 נטול מים נטולי מים סטריליים.
      4. הכן 1 M ציר גלוקוז: להוסיף 180.16 גרם של גלוקוז לליטר מים סטריליים.
    2. Autoclave לעקר את פתרונות מלאי כימי, כמו גם בקבוק ריק 250 מ"ל. בצע את שלבי השעבוד האוטומטי לערכים סטנדרטיים לפחות של 121 °C (70 °F) ו- 15 PSI למשך 30 דקות.
    3. הוסף 80.59 מ"ל של מים סטריליים לבקבוק ריק 250 מ"ל.
    4. הוסף 152.30 מ"ל של מניית NaCl 1 M לתערובת.
    5. הוסף 15.8 מ"ל של מניית KCl 1 M לתערובת.
    6. הוסף 610 μL של 1 M MgSO4 מניות לתערובת.
    7. מוסיפים 700 μL של 1 M ציר גלוקוז לתערובת.
  2. תערובת מוצין כיח מלאכותי (ASMM)
    הערה: ASMM מהווה 50% מהנפח הבינוני הסופי. ודא שהוא מוכן באותו יום כמו האצווה הבינונית הסופית.
    1. מוסיפים 450 מ"ל של מים סטריליים לבקבוק ריק של 1 ליטר.
    2. הוסיפו לבקבוק 50 מ"ל של תמיסת מלח עם אגירה בפוספט פיזפט (PBS).
    3. מוסיפים לבקבוק מוט ערבוב מגנטי חד פעמי.
    4. יש לאכוף אוטומטית את הבקבוק המכיל PBS ואת הבר המהומה.
    5. למדוד 10 גרם של אבקת mucin ולהוסיף אותו PBS.
    6. לנער את הבקבוק במרץ לערבוב ראשוני.
    7. מניחים את הבקבוק על צלחת חמה עם מערבב מגנטי. הגדר חום למיקוד בינוני-גבוה 50 °C (50 °F) ומהירות ערבוב ל 1100 סל"ד. שפר את המהירות בהדרגה כך שהבר לא יעוף מהמגנט.
      1. אפשר לחמם ומערבבים במשך 15 דקות.
      2. הרימו את הבקבוק עם כפפות עמידות בחום. יש לבחון אם אבקת מוצין מתיישבת מהתמיסה.
      3. אם אבקת mucin אינו מומס לחלוטין, להחזיר את הבקבוק לחום / stirrer במשך מרווחים של 5 דקות עד שהוא מומס לחלוטין.
    8. אפשר תערובת mucin להתקרר לטמפרטורת החדר.
  3. תערובת ביולוגית של כיח מלאכותי (ASBM)
    הערה: ASBM הוא 25% מהנפח הבינוני הסופי. הכן אותו באותו יום כמו אצווה בינונית הסופית, ובניגוד תערובות אחרות, לא לחשוף את מרכיביו לכל חום.
    1. הפשירו את מלאי הוויטמינים 100x במקרר 4 מעלות צלזיוס או בקרח.
      הערה: מנה מראש את מלאי הוויטמינים ל-10 מ"ל כדי למזער את מספר מחזורי ההקפאה/הפשרה.
    2. הוסף 124.24 מ"ל של מים סטריליים לבקבוק 250 מ"ל אוטומטי ריק.
    3. הוסיפו לתערובת 25.76 מ"ל של ציר חומצות אמינו חיוניות פי 50.
    4. הוסיפו לתערובת 80.14 מ"ל של ציר חומצות אמינו לא חיוניות 100x.
    5. הוסיפו לתערובת 10 מ"ל של מלאי ויטמינים 100x (מופשר).
    6. הוסף 1 מ"ל של 1000x עקבות מתכות מלאי לתערובת.
    7. מוסיפים לתערובת 8.33 מ"ל של 30% תחליב חלמון ביצה.
    8. הוסף 400 μL של 10 גרם / ליטר ציר פריטין לתערובת.
    9. מערבבים היטב את הפתרון באמצעות רעד ידני.
  4. מדיום כיח מלאכותי (ASM)
    1. הוסף 250 מ"ל של ASCM לבקבוק 1 L המכיל ASMM.
    2. מוסיפים 250 מ"ל של ASBM לבקבוק הבינוני.
    3. יש לתמצת את המדיום עם מאגר MOPS בסיסי (1 M) כדי להגיע ל- pH של 6.3 בנייר pH לטווח צר. לפני טיטציה, התערובת הבינונית תהיה חומצית מדי.
    4. יש לשמור בקירור את מדיום הליחה המלאכותי המתקבל ב-4 °C (70 °F) עד שיהיה מוכן לסינון.
    5. כדי להתחיל את תהליך הסינון, העבר 200 מ"ל של מדיום כיח מלאכותי לא מסונן למערכת סינון ואקום עם מסנן בגודל נקבובית 0.22 מיקרומטר.
    6. חבר את מערכת הסינון למשאבת הוואקום, הפעל את משאבת הוואקום, הגדר אותה ל-70 מ"ר ולאחר מכן הנח את התא על שייקר מסלולית רועד במהירות של 90 סל"ד בחדר קר במהירות של 4 מעלות צלזיוס.
      1. למעלה עם 150 מ"ל נוספים של המדיום כמו כמות ניכרת מסוננת. זה לוקח 1-2 ימים כדי לסנן 1 L של בינוני לחלוטין.
      2. חזור על הפעולה עם תאים נוספים עד שכל המדיה מסוננת.
        הערה: נסה לא לסנן יותר מ 350 מ"ל של המדיום באמצעות אותו מסנן 0.22 מיקרומטר מאז mucin יהיה לחבר את המסנן לאורך זמן.
    7. יש לשמור בקירור מדיום כיח מלאכותי מסונן ב-4 °C (70°F) עד שיהיה מוכן לשימוש. השתמש ASM בתוך חודש אחד של הכנה לתוצאות הטובות ביותר.

2. התזת חמצן

  1. הגדרת תחנת התזתה
    הערה: פרוטוקול זה צריך להיעשות במלואו רק פעם אחת, ולאחר מכן ניתן לשמור על ההתקנה באמצעות תחזוקה פשוטה לפי הצורך. ראה איור 1 לקבלת סכמטי חזותי של מערכת זרימת החמצן.
    1. להשיג ולאבטח כראוי את האוויר הדחוס ואת מיכלי החמצן.
      זהירות: לחץ גבוה הופך את הטנקים למסוכנים ביותר כאשר מטפלים בהן שלא כהלכה. ודא כי הטנקים אטומים ומאובטחים לחלוטין, אין דליפות כאשר הטנק סגור, וכי כל אנשי הטיפול מאומנים באופן מלא בשימוש בהם.
    2. חברו מוטת אוויר למיכל האוויר הדחוס עם מפתח ברגים. לקריאת זרימה אופטימלית על הרגולטור, צרף את הרגולטור קרוב ככל האפשר למיקום זקוף.
    3. חברו ווסת חמצן למיכל החמצן הדחוס, והצמידו קרוב ככל האפשר לתנוחה זקופה. בהתאם למיכל החמצן, ייתכן שיהיה צורך הפוך את הכיוון כדי להדק.
    4. חבר את הצינורות מהרגולטורים למחבר Y כדי לשלב את זרימת הגז משני המיכלים.
    5. חבר את הפלט של מחבר Y לשסתום צומת T המרכזי.
    6. חבר צד אחד של שסתום צומת T המרכזי למד לחץ גז.
    7. חבר את הצד השני של מד לחץ הגז למסנן מזרק סטרילי בקוטר 25 מ"מ עם גודל נקבובית 0.22 מיקרומטר.
    8. חבר מסנן מזרק נוסף בקוטר 25 מ"מ למזרק ללא בוכנה שישמש לשחרור גז במהלך השרצה.
    9. חבר את הצד האחרון של שסתום צומת T המרכזי לשסתום צומת T שני לצג החמצן.
    10. חבר מסנן מזרק בקוטר 25 מ"מ לצד אחד של שסתום צומת T השני, יחד עם צינורות לחבר מחטים 18 G.
    11. חבר את הצד האחרון של שסתום צומת T השני למנגנון ניטור החמצן.
    12. חבר צינור מנותק לצד השני של מנגנון ניטור החמצן שישמש כשחרור גז במהלך הניטור.
      אזהרה: בעת בדיקה/שימוש במערכת שפיצול החמצן, שים לב היטב למיקום צמתי ה- T והבטח שהוא תואם את הנתיב המיועד דרך המערכת. כישלון לעשות זאת יגרום להצטברות לחץ בתוך המערכת ולגרום לרכיבים להיכשל ולפרק .
    13. לתחזוקת המערכת ולשומר על ביצועים מיטביים, הפרקטיקות הבאות מועילות.
      1. לחזק את הקשרים עם כמויות ליברליות של סרט טפלון כדי לשפר מאוד את החותם שלהם ולהפחית את הסיכוי של רכיבים מתפרקים מהלחץ הפנימי.
      2. שמור על קצב זרימה משולב מתחת ל-10 ליטר לדקה כדי למתן לחץ מרבי ולמנוע כשלים.
      3. אם יש חשד לדליפה, השתמש בתמיסת חומר ניקוי כגון גלאי דליפות נוזלים זמינים מסחרית כדי לזהות את מיקומה בקלות, מכיוון שהוא יבעבע מעל כל דליפות גז. תיקון דליפות באמצעות סרט פוליטרפלואורואתילן (למשל, טפלון).
      4. החלף את מסנני המזרק בקוטר 25 מ"מ במערכת שפיצול החמצן דו-שבועי, אך זה משתנה בהתאם לתדירות השימוש. עם הזמן, חלקיקים שנתפסו במסנן מפחיתים את קצב זרימת הגז וגורמים להצטברות לחץ.
      5. כייל את צג החמצן ל-21% חמצן דחוס לפני ביצוע מדידות.
      6. עם השלמת השימוש במערכת, לכבות את המיכלים ולדמם את הגז העודף מן הרגולטורים עד הזרימה מפסיקה לחלוטין.
  2. תרבית בקבוק סרום
    1. תווית 500 מ"ל בקבוקי סרום אוטומטית עם מזהים מדגם, תאריך / שעה של חיסון, ואחוז חמצן היעד.
    2. בברדס ביולוגי, הוסיפו 24 מ"ל של מדיום הכיח המלאכותי לכל בקבוק סרום שמוקם.
    3. הוסף 1 מ"ל של כיח החולה הומוגני עם מחט 18-G (מדולל עם תמיסת מלח סטרילית במידת הצורך כדי להשיג נפח מספיק של מדגם עבור כל מצב תרבית) לכל בקבוק סרום.
    4. בעזרת פינצטה סטרילית, הניחו את פקקי הגומי האוטומטיים על החלק העליון של כל בקבוק סרום.
    5. לחץ על פקקי הגומי, הדאג לא לגעת בחלק התחתון של פקק הידיים.
    6. מוציאים את הבקבוקים מהמכסה המנוע, מורחים ומכווצים את אטמי האלומיניום. מוציאים את החלק המרכזי מהחותמים.
    7. נגב את החלק העליון של הבקבוקים עם לנגב אלכוהול ולהעביר אותם דרך להבת מבער Bunsen.
    8. הדביק מחט סטרילית 18-G למזרק ללא בוכנה עם מסנן. הכנס את שחרור הגז לבקבוק תחילה.
    9. הצמד מחט סטרילית 18-G לפלט הגז מהמערכת ולהכניס את מחט פלט הגז לתוך הבקבוק גם כן.
    10. לנתב את הצמתים מהמיכלים דרך צג החמצן. ודא שריכוז החמצן של המטרה זורם במערכת. כוון כ-5 ליטר לדקה של זרימת גז.
    11. לנתב מחדש את צמתי T מהמיכלים עד לתפוקת הגז. הגז מתחיל לזרום דרך בקבוק הנסיוב.
      זהירות: שים לב למד הלחץ במהלך התזת חמצן. אם הלחץ עולה באופן בלתי צפוי, כבה את המערכת באופן מיידי.
    12. הפעל חמצן sparge דרך בקבוק הסרום במשך 1 דקות. ב 5 L / min, זה מאפשר 10 חילופי אוויר ומבטיח את האטמוספירה הפנימית מגיע ללחץ החלקי הרצוי.
    13. הסר את גז שחרור מחט 18-G.
    14. אפשר ללחץ בבקבוק הסרום לבנות לאטמוספירה +1 (2 אטמוספרות בגובה פני הים) ולאחר מכן הסר מיד את מחט פלט הגז.
      הערה: שמירה על לחץ מסייעת שמירה על תנאים היפרוקסיים לאורך זמן.
    15. מניחים את בקבוק הסרום בשייקר אינקובטור 37 מעלות צלזיוס במהירות של 150 סל"ד. לדגור את הדגימות במשך שלושה מרווחי זמן של 24 שעות. בכל מרווח של 24 שעות, קחו aliquot לניתוח במורד הזרם, סובבו מחדש את הדגימות והחזירו אותן לדגירה לזמן דגירה כולל של 72 שעות.
  3. מדידת חמצן תזרים
    1. כייל את מד החמצן ל-21% אוויר דחוס, ואז כבה את המיכל.
    2. לנתב את צריכת בקבוק הסרום דרך צג החמצן ולהדביק מחט סטרילית עד הסוף.
    3. הכנס את המחט דרך פקק הגומי לתוך בקבוק הסרום.
    4. המתן עד שקריאת היציאה תתייצב. קצב זרימה נמוך מבקבוקי הסרום אומר שזה עשוי לקחת עד 2 דקות. דווח על הפרש השיא מאוויר החדר (מספר הרחוק ביותר מ-21%).
    5. אם מבצע קריאות מרובות, לשטוף את המערכת עם אוויר דחוס בין קריאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פרוטוקולים אלה הוחלו על 50 דגימות כיח צפויות מ pwCF המציגות לטיפול שגרתי במרפאת סיסטיק פיברוזיס באשפוז בבית החולים הכללי של מסצ'וסטס בבוסטון, מסצ'וסטס. הכיח של כל מטופל היה בתרבית מתחת ל-21%, 50% ו-100% בתנאי חמצן באמצעות מדיום הכיח המלאכותי, עם 0.5 מ"ל עליקוטים שנלקחו מכל תרבית ב-24 שעות, 48 שעות ו-72 שעות של זמן תרבות לבדיקה. תרבויות צולמו כאשר החילוצים נעשו כדי לעקוב אחר שינויים חזותיים. בנוסף, 0.5 מ"ל aliquot של כל דגימת כיח ראשוני נלקח לפני culturing. התוצאה הייתה 10 דגימות נפרדות לכל מטופל ו- N סופי של 500 דגימות. ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במחקר זה פותח מודל במבחנה כדי לחקור את ההשפעה של היפרוקסיה על קהילות חיידקי ריאות. מודל זה, המבוסס על כיח מלאכותי בינוני ויומיומי של בקבוקי סרום, שומר על ריכוזי חמצן גבוהים ותומך בצמיחת חיידקים המזוהים בליחה מ- pwCF.

ישנם מספר שלבים קריטיים של גישה זו. הראשון הוא הבחירה להשתמש סינון עיקור ולא עיקור חום של מדיום כיח מלאכותי. עיקור מסנן מונע דנטורינג של מוצין ורכיבים רגישים אחרים לחום של המדיום ומניב מדיום ברור שניתן להשתמש בו לאמצעים אופטיים של צמיחה מיקרוביאלית. בעוד סינון-עיקור הוצע ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

חלק מעבודה זו בוצע במעבדה הביולוגית הימית בתמיכת המעבדה הביולוגית הימית, DOE (DE-SC0016127), NSF (MCB1822263), HHMI (מספר מענק 5600373) ומתנה מקרן סימונס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תמיסת ויטמינים BME (100x)MilliporeSigmaB6891תמיסה מרוכזת של ויטמינים משלימים.
Crimper, 30 מ"מDWK Life Sciences224307Crimper להצמדת אטמי אלומיניום לבקבוקי סרום.
D-(+)-גלוקוזMilliporeSigmaG7021אבקת גלוקוז מוצק (איזומר דקסטרורוטטורי).
משאבת דיאפרגמה ME 2 NTVACUUBRAND20730003משאבת ואקום לסינון ואקום.
תחליב חלמון ביצהHiMediaFD045תחליב סטרילי של 30% חלמון במי מלח.
פריטין, מופק מתמיסתחלבון אחסון ברזל)MilliporeSigmaF7879
מבער FIREBOY plus Safety BunsenIntegra Biosciences144000Bunsen עם ממשק משתמש ותכונות בטיחות.
נייר pH הידריון (1.0– 14.0)מעבדה מיקרו חיונית94נייר בדיקת pH לטווח של 1.0 – 14.0.
נייר pH הידריון (4.0– 9.0)מעבדה חיוניתמיקרו 55נייר בדיקת pH לטווח של 4.0 – 9.0.
נייר pH הידריון (6.0– 8.0)מעבדה חיוניתמיקרו 345נייר בדיקת pH לטווח של 6.0 – 8.0.
מכשיר בטיחות Hypodermic Needle-Pro EDGE, 18 GSmiths Medical40181518 G מחטים עם מכסי בטיחות.
מד לחץ בשורהMilliporeSigma20469מד לחץ גז לניטור לחץ הבקבוק.
Innova 42 Incubated ShakerEppendorf2231000756משולב אינקובטור/שייקר מסלולי.
מזרק Luer-Lok עם מחט מחוברתBecton Dickinson309580שילוב מזרק 3 מ"ל ומחט 18 גרם.
מבחר שסתומי LuerPrecision Instruments14011שסתומים לצינורות זרימת גז.
LSE Orbital ShakerThermoFisher Scientific6780-NPשייקר אורביטלי לתסיסה של מדיה במהלך הסינון.
מגנזיום גופרתי HeptahydrateMilliporeSigmaM2773מלח אנגלי מוצק (מגנזיום גופרתי הפטהידרט).
ווסת אוויר רפואי חד שלבי עם מד זרימהWestern EnterprisesM1-346-15FMווסת קצב זרימת אוויר עם מד 15 ליטר לדקה.
תמיסת חומצות אמינו MEM (50x)MilliporeSigmaM5550תמיסה מרוכזת של חומצות אמינו חיוניות.
תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100x) MEMMilliporeSigmaM7145תמיסה מרוכזת של חומצות אמינו לא חיוניות.
מסנן Millex-GP, 0.22 ומיקרו; mMilliporeSigmaSLMP25SS0.22 ומיקרו; מ מסנן מזרק סטרילי ממברנה פוליאתרסולפון.
Milli-Q AcademicMilliporeSigmaZMQS60E01מערכת סינון מים סטרילית Milli-Q.
מוניטור חמצן MiniOX 3000MSA814365ניטור אחוז חמצן בזרימת גז.
מאגר MOPS (1 מ', pH 9.0)BBM-90של Boston BioProductsלהתאמת pH של מדיה.
מוצין מאבקתמוצין (חלבון מגליקוזיל היוצר ג'ל מגליקוזיל) שלקיבה חזיריתSigmaM2378
ערכת התאמה דוקרנית מפוליפרופילן טבעימכשיר הרווארד72-1413מחברים לצינורות זרימת גז.
ערכת הכנת ספריית ה-DNA Nextera XTIlluminaFC-131-1096הכנת ספרייה לזיהוי במהלך הרצף.
מערכת ריצוף NovaSeq 6000Illumina770-2016-025-Nפלטפורמת ריצוף רובה ציד ליצירת קריאות לדוגמה.
ווסת חמצן חד שלבי עם מד זרימהWestern EnterprisesM1-540-15FMווסת קצב זרימת חמצן עם מד 15 ליטר לדקה.
צינורות חמצן עם 2 מחברים סטנדרטייםSunMed2001-01צינורות לחיבור רכיבי מערכת גז.
תמיסת מלח חוצצת פוספט, 10x, pH 7.4Molecular Biologicals InternationalMRGF-6235תמיסת מלח מרוכזת עם פוספט.
PC 420 פלטה חמה/בוחשמרשל סיינטיפיקCO-PC420פלטה חמה/מערבל משולב.
אשלגן כלוריMilliporeSigmaP9541מלח אשלגן כלורי מוצק.
מוטות ערבוב חד פעמיים PTFEThermoFisher Scientific14-513-95מוטות ערבוב מגנטיים חד פעמיים.
PTFE חוט חוט אטם טפלון קלטתVWR470042-938קלטת טפלון לחיזוק חיבורי מערכת גז.
מחסנית טיהור Q-Gard 2MilliporeSigmaQGARD00D2מחסנית טיהור למערכת Milli-Q.
בקבוקי אחסון מדיה לשימוש חוזרבקבוקי ThermoFisher Scientific06-423Aלערבוב ואחסון מדיה תרבית.
פקק גומי, 30 מ"מ, אפור ברומובוטילDWK מדעי החיים224100-331פקקי גומי לבקבוקי סרום.
בקבוק סרום עם סימונים יצוקים, 500 מ"לDWK Life Sciences223952בקבוקי סרום זכוכית לתרבית אטומה.
סט הארכת קדח קטןBraun Medical471960הארכת צינורות עם מחברי נעילת לואר.
נתרן כלוריMilliporeSigmaS3014מלח נתרן כלורי מוצק.
בקרת ספייק אין I (עומס מיקרוביאלי גבוה)ZymoBIOMICSD6320חיידקי ספייק אין (I. halotolerans ו- A. halotolerans) לחישובי עומס מיקרוביאלי מוחלט
מערכת סינון ואקום סטרילית לשחרור מהיר StericupMilliporeSigmaS2GPU02RE250 מ"ל 0.22 ומיקרו; תא סינון ואקום M.
מגבונים חד פעמיים קוטל חיידקים Super Sani-Clothחד פעמיים מקצועיים בינלאומייםH04082מגבונים חד פעמיים לקוטלי חיידקים לעיקור.
תערובת מתכות קורט, 1000xThermoFisher ScientificNC0112668תמיסה מרוכזת של מתכות קורט פיזיולוגיות.
אטם אלומיניום לא מרופד, 30 מ"מDWK Life Sciences224187-01אטמי אלומיניום מכווצים על גבי פקקי גומי.
מיכל אוויר בדרגה רפואית USPAirgasAI USP200מיכל אוויר דחוס לקלט למערכת הזילוף.
מיכל חמצן בדרגה רפואית USPAirgasOX USP200מיכל חמצן דחוס לקלט למערכת הזילוף.
פריטין ( של טחול הסוסים .מאגר MOPS .

מקורות

  1. Carmody, L. A., et al. Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis. PLoS One. 13 (3), 0194060(2018).
  2. Acosta, N., et al. Sputum microbiota is predictive of long-term clinical outcomes in young adults with cystic fibrosis. Thorax. 73 (11), 1016-1025 (2018).
  3. Muhlebach, M. S., et al. Initial acquisition and succession of the cystic fibrosis lung microbiome is associated with disease progression in infants and preschool children. PLoS Pathogens. 14 (1), 1006798(2018).
  4. Zolin, A., Bossi, A., Cirilli, N., Kashirskaya, N., Padoan, R. Cystic fibrosis mortality in childhood. Data from European cystic fibrosis society patient registry. International Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (9), (2018).
  5. Ramos, K. J., et al. Heterogeneity in survival in adult patients with cystic fibrosis with FEV1 30% of predicted in the United States. Chest. 30 (6), 1320-1328 (2017).
  6. Ramos, K. J., et al. Predictors of non-referral of patients with cystic fibrosis for lung transplant evaluation in the United States. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (2), 196-203 (2016).
  7. Girardis, M., et al. Effect of conservative vs conventional oxygen therapy on mortality among patients in an intensive care unit: The Oxygen-ICU randomized clinical trial. JAMA. 316 (15), 1583-1589 (2016).
  8. Comstock, W. J., et al. The WinCF model - An inexpensive and tractable microcosm of a mucus plugged bronchiole to study the microbiology of lung infections. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55532(2017).
  9. Diraviam Dinesh, S. Artificial sputum medium. Protocol Exchange. , Version 1 (2010).
  10. Kirchner, S., et al. Use of artificial sputum medium to test antibiotic efficacy against Pseudomonas aeruginosa in conditions more relevant to the cystic fibrosis lung. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3857(2012).
  11. Grandjean Lapierre, S., et al. Cystic fibrosis respiratory tract salt concentration: An Exploratory Cohort Study. Medicine. 96 (47), Baltimore. 8423(2017).
  12. Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).
  13. Van Sambeek, L., Cowley, E. S., Newman, D. K., Kato, R. Sputum glucose and glycemic control in cystic fibrosis-related diabetes: a cross-sectional study. PLoS One. 10 (3), 0119938(2015).
  14. Flynn, J. M., Niccum, D., Dunitz, J. M., Hunter, R. C. Evidence and role for bacterial mucin degradation in cystic fibrosis airway disease. PLoS Pathogens. 12 (8), 1005846(2016).
  15. Gallagher, T., et al. Liquid chromatography mass spectrometry detection of antibiotic agents in sputum from persons with cystic fibrosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 65 (2), (2021).
  16. Voynow, J. A., Rubin, B. K. Mucins, mucus, and sputum. Chest. 135 (2), 505-512 (2009).
  17. Sui, H. Y., et al. Impact of DNA extraction method on variation in human and built environment microbial community and functional profiles assessed by shotgun metagenomics sequencing. Frontiers in Microbiology. 11, 953(2020).
  18. McIver, L. J., et al. bioBakery: a meta'omic analysis environment. Bioinformatics. 34 (7), 1235-1237 (2018).
  19. Truong, D. T., et al. MetaPhlAn2 for enhanced metagenomic taxonomic profiling. Nature Methods. 12 (10), 902-903 (2015).
  20. Stammler, F., et al. Adjusting microbiome profiles for differences in microbial load by spike-in bacteria. Microbiome. 4 (1), 28(2016).
  21. Henke, M. O., Renner, A., Huber, R. M., Seeds, M. C., Rubin, B. K. MUC5AC and MUC5B mucins are decreased in cystic fibrosis airway secretions. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 86-91 (2004).
  22. Henderson, A. G., et al. Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyper concentration and increased osmotic pressure. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3047-3060 (2014).
  23. Matthews, L. W., Spector, S., Lemm, J., Potter, J. L. Studies on pulmonary secretions. I. The over-all chemical composition of pulmonary secretions from patients with cystic fibrosis, bronchiectasis, and laryngectomy. American Review of Respiratory Disease. 88, 199-204 (1963).
  24. Ibanez de Aldecoa, A. L., Zafra, O., Gonzalez-Pastor, J. E. Mechanisms and regulation of extracellular DNA release and its biological roles in microbial communities. Frontiers in Microbiology. 8, 1390(2017).
  25. Tunney, M. M., et al. Detection of anaerobic bacteria in high numbers in sputum from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (9), 995-1001 (2008).
  26. Worlitzsch, D., et al. Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Investigation. 109 (3), 317-325 (2002).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מיקרוביום של סיסטיק פיברוזיסמצע ליחה מלאכותיקהילות מיקרוביאליות של דרכי הנשימההזרקת חמצןתרבית בבקבוק סרוםריצוף מטגנומיהרכב קהילה מיקרוביאליתפתוגנים של הריאותסטריליזציה באמצעות סינון
תכנון ופיתוח של מודל לחקר ההשפעה של חמצן משלים על המיקרוביום של סיסטיק פיברוזיס דרכי הנשימה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.