תכנון ופיתוח של מודל לחקר ההשפעה של חמצן משלים על המיקרוביום של סיסטיק פיברוזיס דרכי הנשימה

Summary

מטרת פרוטוקול זה היא לפתח מערכת מודל להשפעת היפרוקסיה על קהילות המיקרואורגניזמים של סיסטיק פיברוזיס דרכי הנשימה. מדיום כיח מלאכותי מחקה את הרכב הכיח, ותנאי התרבות ההיפרוקסית מדגימים את ההשפעות של חמצן משלים על קהילות מיקרוביות ריאות.

Abstract

קהילות מיקרוביות בדרכי הנשימה נחשבות לשחק תפקיד חשוב בהתקדמות של סיסטיק פיברוזיס (CF) ומחלות ריאות כרוניות אחרות. חיידקים סווגו באופן מסורתי על סמך יכולתם להשתמש או לסבול חמצן. חמצן משלים הוא טיפול רפואי נפוץ שניתן לאנשים עם סיסטיק פיברוזיס (pwCF); עם זאת, מחקרים קיימים על חמצן ועל המיקרוביום דרכי הנשימה התמקדו באופן שבו היפוקסיה (חמצן נמוך) ולא היפרוקסיה (חמצן גבוה) משפיעה על קהילות מיקרוביות הריאות האירוביות והפקולטיביות בעיקר. כדי לטפל בפער ידע קריטי זה, פרוטוקול זה פותח באמצעות מדיום כיח מלאכותי המחקה את הרכב הליחה מ- pwCF. השימוש בעיקור מסננים, המניב מדיום שקוף, מאפשר לשיטות אופטיות לעקוב אחר הצמיחה של חיידקים חד-תאיים בתרביות השעיה. כדי ליצור תנאים היפרוקסיים, מערכת מודל זו מנצלת טכניקות פולחן אנאירובי מבוססות כדי ללמוד תנאים היפרוקסיים; במקום להסיר חמצן, חמצן מתווסף לתרבויות על ידי התכתות יומית של בקבוקי סרום עם תערובת של חמצן דחוס ואוויר. כיח מ 50 pwCF עבר סטרינג יומי לתקופה של 72 שעות כדי לאמת את היכולת של מודל זה לשמור על תנאי חמצן דיפרנציאליים. רצף מטגנומי רובה ציד בוצע על דגימות כיח מתורבתות ולא תרבותיות מ 11 pwCF כדי לאמת את היכולת של מדיום זה כדי לתמוך בצמיחה של חיידקים קומנסליים ופתוגניים הנפוצים בליח סיסטיק פיברוזיס. עקומות גדילה התקבלו מ 112 מבודדים שהתקבלו מ- pwCF כדי לאמת את היכולת של מדיום כיח מלאכותי זה לתמוך בצמיחה של פתוגנים סיסטיק פיברוזיס נפוצים. אנו מוצאים כי מודל זה יכול תרבות מגוון רחב של פתוגנים ו commensals כיח CF, משחזר קהילה דומה מאוד כיח לא תרבותי בתנאים נורמוקסיים, ויוצר פנוטיפים תרבות שונים בתנאי חמצן שונים. גישה חדשה זו עשויה להוביל להבנה טובה יותר של השפעות בלתי צפויות הנגרמות על ידי שימוש בחמצן ב- pwCF על קהילות מיקרוביות בדרכי הנשימה ופתוגנים נשימתיים נפוצים.

Introduction

סיסטיק פיברוזיס (CF) היא מחלה גנטית המאופיינת בחוסר יכולת לנקות ריר סמיך מהריאות, מה שמוביל לזיהומים חוזרים ונשנים ולירידה בתפקוד הריאות המתקדמת, שלעתים קרובות גורמת לצורך בהשתלת ריאות או למוות. המיקרוביום דרכי הנשימה של אנשים עם סיסטיק פיברוזיס (pwCF) נראה^לעקובאחר פעילות המחלה 1 , עם ירידה במגוון מיקרוביאלי הקשורים לתוצאות שליליות לטווח ארוך^2,3. במחקרים קליניים של pwCF, טיפול בחמצן משלים קושר למחלה מתקדמת יותר^4,5, אם כי באופן מסורתי, השימוש בטיפול בחמצן נתפס פשוט כסמן לחומרת המחלה⁶. מחקרים אחרונים מניסוי קליני של חולים עם כשל נשימתי הראו כי רמות חמצן גבוהות יותר של המטופל קשורות באופן פרדוקסלי לעלייה בזיהומים חיידקיים חמורים ותמותה גבוהה יותר⁷, דבר המצביע על כך שחמצן משלים עשוי לתרום לפתוגנזה של המחלה. ההשפעה של חמצן משלים על מיקרוביום הריאות סיסטיק פיברוזיס וקהילות מיקרוביות הקשורות לריאות ודמתי הנשימה לא נחקרה היטב.

לעתים קרובות לא ניתן לבצע מחקרים מכניים ישירות בנושאים אנושיים בשל קשיים לוגיסטיים וסוגיות אתיות פוטנציאליות הקשורות להתערבויות של תועלת רפואית לא ידועה או נזק. גישות תרגומיות המשלבות ביו-פיסצימנים אנושיים במערכות מודל יכולות להציע תובנות ביולוגיות חשובות במקרים אלה. בעוד היכולת להשתמש או לסבול חמצן היה באופן מסורתי מרכיב חשוב של סיווג מיקרוביאלי, מעט מאוד ידוע על איך הקדמה טיפולית של חמצן משלים לסביבה עלולה להרגיז קהילות מיקרוביות דרכי הנשימה. כדי לשפוך אור על ההשפעות הלא ידועות של חמצן משלים על המיקרוביום דרכי הנשימה של pwCF, היינו צריכים להתמודד עם שני אתגרים עיקריים; ראשית, יצירת מדיום תרבותי המהוער מבחינה פיזיולוגית את הרכב כיח CF; שנית, יצירת מערכת מודל המאפשרת שמירה על ריכוזי חמצן גבוהים בתרבות על פני פרקי זמן ממושכים.

מדיה כיח מלאכותי (ASM) נמצאים בשימוש נרחב כדי לחקות כיח ריאות ex vivo^8,9,10, אבל אין קונצנזוס ברור על מתכון מסוים. פרוטוקול זה מתאר מתכון בינוני כיח מלאכותי ואסטרטגיית הכנה שתוכננה בקפידה כדי לתבח פיזיולוגית מ- pwCF. טבלה 1 מתארת את ערכי המתכון הנבחרים בהתבסס על ספרות שפורסמה. רכיבים כימיים בסיסיים ו- pH הותאמו לערכים שזוהו על ידי מחקרים של כיח CF אנושי^11,12,13. חומרים מזינים פיזיולוגיים בריכוז נמוך נוספו באמצעות חלמון ביצה, אשר נכלל כמו 0.25% של נפח סופי¹⁰, כמו גם ויטמין ומתכת קורט מתערבב^14,15. Mucin, המרכיב העיקרי של כיח^16,נכלל ב 1% w / v¹⁴. למרות שעיקור מסנן אינטנסיבי יותר נבחר על פני הנוהג הקונבנציונלי יותר של עיקור חום כדי להפחית בעיות פוטנציאליות מפני denaturation הנגרמת על ידי חום של רכיבי מדיה חיוניים¹⁰. יתרון נוסף של עיקור מסנן הוא שהוא מייצר מדיה שקופה (עיקור חום יכול ליצור מדיה עכורה עקב משקעים ו קרישה של מלחים וחלבונים), ומאפשר מדיה כיח מלאכותי זה לשמש כדי לעקוב אחר צמיחה מיקרוביאלית המבוססת על עליות עכורה.

מערכת מודל זו לתרבות ההיפרוקסיקית מבוססת על טכניקות פולחן אנאירוביות שבהן מוסיפים חמצן ולא מוסרים, ויוצרים מודל להשפעת שימוש בחמצן משלים עבור pwCF. איור 1 ופרוטוקול התזת החמצן הנלווה מתארים את הרכיבים של מערכת שפיצוח חמצן, שניתן להשיג בעלות נמוכה מספקי מעבדה כלליים ומכלי בית חולים. מערכת זו מאפשרת ערבוב של חמצן דחוס ואוויר לריכוזים קבועים הנעים בין 21%-100% חמצן. השילוב של חיישן חמצן מאפשר אימות של ריכוז תערובת גז הפלט, כמו גם בדיקת הרכב גז הזרימה של בקבוקי סרום שהופצו בעבר כדי לוודא שתנאי החמצן נשמרו בטווח הרצוי.

פרוטוקול זה מתאר נהלים ליצירת מדיום כיח מלאכותי, בנייה ושימוש במערכת התזת חמצן, ויישום של שניהם על כיח CF תרבית בתנאי חמצן דיפרנציאליים.

Protocol

מחקר זה קיבל את אישור הוועדה לבדיקה מוסדית של השותפים (פרוטוקול מס' 2018P002934). קריטריון ההכללה כלל חולים מבוגרים עם סיסטיק פיברוזיס שסיפקו הסכמה מדעת בכתב למחקר. לא היה קריטריון אי-הכללה. על פי הנחיות הפרוטוקול, כל דגימות כיח נאספו מחולים עם סיסטיק פיברוזיס במהלך ביקור אשפוז מתוכנן עם הספק הקליני שלהם.

1. הכנה בינונית של כיח מלאכותי

הערה: הכמויות המפורטות כאן מיועדות לייצור של 1 ליטר של מדיום כיח מלאכותי סופי, ולהניח את ריאגנטים ספציפיים המפורטים בטבלת החומרים. יש להתאים מספרים עבור אמצעי אחסון אחרים או לשימוש של ריאגנטים שונים כדי להבטיח את אותו מוצר סופי. ראה טבלה 1 לריכוזים של יעד.

1. תערובת כימית כיח מלאכותי (ASCM)
   הערה: ASCM מהווה 25% מהנפח הבינוני הסופי. הוא יציב מדף וניתן להכין אותו בכמויות גדולות או מראש. אם מכינים אותו לשימוש מאוחר יותר, יש לאחסן את התערובת הכימית ולאחסן אותה בבטחה בטמפרטורת החדר.
   1. מערבבים את פתרונות המניות הכימיים המרכיבים.
      1. הכן 1 M מלאי NaCl: להוסיף 58.44 גרם של NaCl לליטר מים סטריליים.
      2. הכן 1 M KCl: הוסף 74.55 גרם של KCl לליטר מים סטריליים.
      3. הכן 1 M MgSO₄ מלאי: להוסיף 246.47 גרם של MgSO₄·7H₂O לליטר מים סטריליים, או 120.37 גרם של MgSO4 נטול מים נטולי מים סטריליים.
      4. הכן 1 M ציר גלוקוז: להוסיף 180.16 גרם של גלוקוז לליטר מים סטריליים.
   2. Autoclave לעקר את פתרונות מלאי כימי, כמו גם בקבוק ריק 250 מ"ל. בצע את שלבי השעבוד האוטומטי לערכים סטנדרטיים לפחות של 121 °C (70 °F) ו- 15 PSI למשך 30 דקות.
   3. הוסף 80.59 מ"ל של מים סטריליים לבקבוק ריק 250 מ"ל.
   4. הוסף 152.30 מ"ל של מניית NaCl 1 M לתערובת.
   5. הוסף 15.8 מ"ל של מניית KCl 1 M לתערובת.
   6. הוסף 610 μL של 1 M MgSO₄ מניות לתערובת.
   7. מוסיפים 700 μL של 1 M ציר גלוקוז לתערובת.
2. תערובת מוצין כיח מלאכותי (ASMM)
   הערה: ASMM מהווה 50% מהנפח הבינוני הסופי. ודא שהוא מוכן באותו יום כמו האצווה הבינונית הסופית.
   1. מוסיפים 450 מ"ל של מים סטריליים לבקבוק ריק של 1 ליטר.
   2. הוסיפו לבקבוק 50 מ"ל של תמיסת מלח עם אגירה בפוספט פיזפט (PBS).
   3. מוסיפים לבקבוק מוט ערבוב מגנטי חד פעמי.
   4. יש לאכוף אוטומטית את הבקבוק המכיל PBS ואת הבר המהומה.
   5. למדוד 10 גרם של אבקת mucin ולהוסיף אותו PBS.
   6. לנער את הבקבוק במרץ לערבוב ראשוני.
   7. מניחים את הבקבוק על צלחת חמה עם מערבב מגנטי. הגדר חום למיקוד בינוני-גבוה 50 °C (50 °F) ומהירות ערבוב ל 1100 סל"ד. שפר את המהירות בהדרגה כך שהבר לא יעוף מהמגנט.
      1. אפשר לחמם ומערבבים במשך 15 דקות.
      2. הרימו את הבקבוק עם כפפות עמידות בחום. יש לבחון אם אבקת מוצין מתיישבת מהתמיסה.
      3. אם אבקת mucin אינו מומס לחלוטין, להחזיר את הבקבוק לחום / stirrer במשך מרווחים של 5 דקות עד שהוא מומס לחלוטין.
   8. אפשר תערובת mucin להתקרר לטמפרטורת החדר.
3. תערובת ביולוגית של כיח מלאכותי (ASBM)
   הערה: ASBM הוא 25% מהנפח הבינוני הסופי. הכן אותו באותו יום כמו אצווה בינונית הסופית, ובניגוד תערובות אחרות, לא לחשוף את מרכיביו לכל חום.
   1. הפשירו את מלאי הוויטמינים 100x במקרר 4 מעלות צלזיוס או בקרח.
      הערה: מנה מראש את מלאי הוויטמינים ל-10 מ"ל כדי למזער את מספר מחזורי ההקפאה/הפשרה.
   2. הוסף 124.24 מ"ל של מים סטריליים לבקבוק 250 מ"ל אוטומטי ריק.
   3. הוסיפו לתערובת 25.76 מ"ל של ציר חומצות אמינו חיוניות פי 50.
   4. הוסיפו לתערובת 80.14 מ"ל של ציר חומצות אמינו לא חיוניות 100x.
   5. הוסיפו לתערובת 10 מ"ל של מלאי ויטמינים 100x (מופשר).
   6. הוסף 1 מ"ל של 1000x עקבות מתכות מלאי לתערובת.
   7. מוסיפים לתערובת 8.33 מ"ל של 30% תחליב חלמון ביצה.
   8. הוסף 400 μL של 10 גרם / ליטר ציר פריטין לתערובת.
   9. מערבבים היטב את הפתרון באמצעות רעד ידני.
4. מדיום כיח מלאכותי (ASM)
   1. הוסף 250 מ"ל של ASCM לבקבוק 1 L המכיל ASMM.
   2. מוסיפים 250 מ"ל של ASBM לבקבוק הבינוני.
   3. יש לתמצת את המדיום עם מאגר MOPS בסיסי (1 M) כדי להגיע ל- pH של 6.3 בנייר pH לטווח צר. לפני טיטציה, התערובת הבינונית תהיה חומצית מדי.
   4. יש לשמור בקירור את מדיום הליחה המלאכותי המתקבל ב-4 °C (70 °F) עד שיהיה מוכן לסינון.
   5. כדי להתחיל את תהליך הסינון, העבר 200 מ"ל של מדיום כיח מלאכותי לא מסונן למערכת סינון ואקום עם מסנן בגודל נקבובית 0.22 מיקרומטר.
   6. חבר את מערכת הסינון למשאבת הוואקום, הפעל את משאבת הוואקום, הגדר אותה ל-70 מ"ר ולאחר מכן הנח את התא על שייקר מסלולית רועד במהירות של 90 סל"ד בחדר קר במהירות של 4 מעלות צלזיוס.
      1. למעלה עם 150 מ"ל נוספים של המדיום כמו כמות ניכרת מסוננת. זה לוקח 1-2 ימים כדי לסנן 1 L של בינוני לחלוטין.
      2. חזור על הפעולה עם תאים נוספים עד שכל המדיה מסוננת.
         הערה: נסה לא לסנן יותר מ 350 מ"ל של המדיום באמצעות אותו מסנן 0.22 מיקרומטר מאז mucin יהיה לחבר את המסנן לאורך זמן.
   7. יש לשמור בקירור מדיום כיח מלאכותי מסונן ב-4 °C (70°F) עד שיהיה מוכן לשימוש. השתמש ASM בתוך חודש אחד של הכנה לתוצאות הטובות ביותר.

2. התזת חמצן

1. הגדרת תחנת התזתה
   הערה: פרוטוקול זה צריך להיעשות במלואו רק פעם אחת, ולאחר מכן ניתן לשמור על ההתקנה באמצעות תחזוקה פשוטה לפי הצורך. ראה איור 1 לקבלת סכמטי חזותי של מערכת זרימת החמצן.
   1. להשיג ולאבטח כראוי את האוויר הדחוס ואת מיכלי החמצן.
      זהירות: לחץ גבוה הופך את הטנקים למסוכנים ביותר כאשר מטפלים בהן שלא כהלכה. ודא כי הטנקים אטומים ומאובטחים לחלוטין, אין דליפות כאשר הטנק סגור, וכי כל אנשי הטיפול מאומנים באופן מלא בשימוש בהם.
   2. חברו מוטת אוויר למיכל האוויר הדחוס עם מפתח ברגים. לקריאת זרימה אופטימלית על הרגולטור, צרף את הרגולטור קרוב ככל האפשר למיקום זקוף.
   3. חברו ווסת חמצן למיכל החמצן הדחוס, והצמידו קרוב ככל האפשר לתנוחה זקופה. בהתאם למיכל החמצן, ייתכן שיהיה צורך הפוך את הכיוון כדי להדק.
   4. חבר את הצינורות מהרגולטורים למחבר Y כדי לשלב את זרימת הגז משני המיכלים.
   5. חבר את הפלט של מחבר Y לשסתום צומת T המרכזי.
   6. חבר צד אחד של שסתום צומת T המרכזי למד לחץ גז.
   7. חבר את הצד השני של מד לחץ הגז למסנן מזרק סטרילי בקוטר 25 מ"מ עם גודל נקבובית 0.22 מיקרומטר.
   8. חבר מסנן מזרק נוסף בקוטר 25 מ"מ למזרק ללא בוכנה שישמש לשחרור גז במהלך השרצה.
   9. חבר את הצד האחרון של שסתום צומת T המרכזי לשסתום צומת T שני לצג החמצן.
   10. חבר מסנן מזרק בקוטר 25 מ"מ לצד אחד של שסתום צומת T השני, יחד עם צינורות לחבר מחטים 18 G.
   11. חבר את הצד האחרון של שסתום צומת T השני למנגנון ניטור החמצן.
   12. חבר צינור מנותק לצד השני של מנגנון ניטור החמצן שישמש כשחרור גז במהלך הניטור.
       אזהרה: בעת בדיקה/שימוש במערכת שפיצול החמצן, שים לב היטב למיקום צמתי ה- T והבטח שהוא תואם את הנתיב המיועד דרך המערכת. כישלון לעשות זאת יגרום להצטברות לחץ בתוך המערכת ולגרום לרכיבים להיכשל ולפרק .
   13. לתחזוקת המערכת ולשומר על ביצועים מיטביים, הפרקטיקות הבאות מועילות.
       1. לחזק את הקשרים עם כמויות ליברליות של סרט טפלון כדי לשפר מאוד את החותם שלהם ולהפחית את הסיכוי של רכיבים מתפרקים מהלחץ הפנימי.
       2. שמור על קצב זרימה משולב מתחת ל-10 ליטר לדקה כדי למתן לחץ מרבי ולמנוע כשלים.
       3. אם יש חשד לדליפה, השתמש בתמיסת חומר ניקוי כגון גלאי דליפות נוזלים זמינים מסחרית כדי לזהות את מיקומה בקלות, מכיוון שהוא יבעבע מעל כל דליפות גז. תיקון דליפות באמצעות סרט פוליטרפלואורואתילן (למשל, טפלון).
       4. החלף את מסנני המזרק בקוטר 25 מ"מ במערכת שפיצול החמצן דו-שבועי, אך זה משתנה בהתאם לתדירות השימוש. עם הזמן, חלקיקים שנתפסו במסנן מפחיתים את קצב זרימת הגז וגורמים להצטברות לחץ.
       5. כייל את צג החמצן ל-21% חמצן דחוס לפני ביצוע מדידות.
       6. עם השלמת השימוש במערכת, לכבות את המיכלים ולדמם את הגז העודף מן הרגולטורים עד הזרימה מפסיקה לחלוטין.
2. תרבית בקבוק סרום
   1. תווית 500 מ"ל בקבוקי סרום אוטומטית עם מזהים מדגם, תאריך / שעה של חיסון, ואחוז חמצן היעד.
   2. בברדס ביולוגי, הוסיפו 24 מ"ל של מדיום הכיח המלאכותי לכל בקבוק סרום שמוקם.
   3. הוסף 1 מ"ל של כיח החולה הומוגני עם מחט 18-G (מדולל עם תמיסת מלח סטרילית במידת הצורך כדי להשיג נפח מספיק של מדגם עבור כל מצב תרבית) לכל בקבוק סרום.
   4. בעזרת פינצטה סטרילית, הניחו את פקקי הגומי האוטומטיים על החלק העליון של כל בקבוק סרום.
   5. לחץ על פקקי הגומי, הדאג לא לגעת בחלק התחתון של פקק הידיים.
   6. מוציאים את הבקבוקים מהמכסה המנוע, מורחים ומכווצים את אטמי האלומיניום. מוציאים את החלק המרכזי מהחותמים.
   7. נגב את החלק העליון של הבקבוקים עם לנגב אלכוהול ולהעביר אותם דרך להבת מבער Bunsen.
   8. הדביק מחט סטרילית 18-G למזרק ללא בוכנה עם מסנן. הכנס את שחרור הגז לבקבוק תחילה.
   9. הצמד מחט סטרילית 18-G לפלט הגז מהמערכת ולהכניס את מחט פלט הגז לתוך הבקבוק גם כן.
   10. לנתב את הצמתים מהמיכלים דרך צג החמצן. ודא שריכוז החמצן של המטרה זורם במערכת. כוון כ-5 ליטר לדקה של זרימת גז.
   11. לנתב מחדש את צמתי T מהמיכלים עד לתפוקת הגז. הגז מתחיל לזרום דרך בקבוק הנסיוב.
       זהירות: שים לב למד הלחץ במהלך התזת חמצן. אם הלחץ עולה באופן בלתי צפוי, כבה את המערכת באופן מיידי.
   12. הפעל חמצן sparge דרך בקבוק הסרום במשך 1 דקות. ב 5 L / min, זה מאפשר 10 חילופי אוויר ומבטיח את האטמוספירה הפנימית מגיע ללחץ החלקי הרצוי.
   13. הסר את גז שחרור מחט 18-G.
   14. אפשר ללחץ בבקבוק הסרום לבנות לאטמוספירה +1 (2 אטמוספרות בגובה פני הים) ולאחר מכן הסר מיד את מחט פלט הגז.
       הערה: שמירה על לחץ מסייעת שמירה על תנאים היפרוקסיים לאורך זמן.
   15. מניחים את בקבוק הסרום בשייקר אינקובטור 37 מעלות צלזיוס במהירות של 150 סל"ד. לדגור את הדגימות במשך שלושה מרווחי זמן של 24 שעות. בכל מרווח של 24 שעות, קחו aliquot לניתוח במורד הזרם, סובבו מחדש את הדגימות והחזירו אותן לדגירה לזמן דגירה כולל של 72 שעות.
3. מדידת חמצן תזרים
   1. כייל את מד החמצן ל-21% אוויר דחוס, ואז כבה את המיכל.
   2. לנתב את צריכת בקבוק הסרום דרך צג החמצן ולהדביק מחט סטרילית עד הסוף.
   3. הכנס את המחט דרך פקק הגומי לתוך בקבוק הסרום.
   4. המתן עד שקריאת היציאה תתייצב. קצב זרימה נמוך מבקבוקי הסרום אומר שזה עשוי לקחת עד 2 דקות. דווח על הפרש השיא מאוויר החדר (מספר הרחוק ביותר מ-21%).
   5. אם מבצע קריאות מרובות, לשטוף את המערכת עם אוויר דחוס בין קריאות.

Results

פרוטוקולים אלה הוחלו על 50 דגימות כיח צפויות מ pwCF המציגות לטיפול שגרתי במרפאת סיסטיק פיברוזיס באשפוז בבית החולים הכללי של מסצ'וסטס בבוסטון, מסצ'וסטס. הכיח של כל מטופל היה בתרבית מתחת ל-21%, 50% ו-100% בתנאי חמצן באמצעות מדיום הכיח המלאכותי, עם 0.5 מ"ל עליקוטים שנלקחו מכל תרבית ב-24 שעות, 48 שעות ו-72 שעות של זמן תרבות לבדיקה. תרבויות צולמו כאשר החילוצים נעשו כדי לעקוב אחר שינויים חזותיים. בנוסף, 0.5 מ"ל aliquot של כל דגימת כיח ראשוני נלקח לפני culturing. התוצאה הייתה 10 דגימות נפרדות לכל מטופל ו- N סופי של 500 דגימות. ...

Discussion

במחקר זה פותח מודל במבחנה כדי לחקור את ההשפעה של היפרוקסיה על קהילות חיידקי ריאות. מודל זה, המבוסס על כיח מלאכותי בינוני ויומיומי של בקבוקי סרום, שומר על ריכוזי חמצן גבוהים ותומך בצמיחת חיידקים המזוהים בליחה מ- pwCF.

ישנם מספר שלבים קריטיים של גישה זו. הראשון הוא הבחירה להשתמש סינון עיקור ולא עיקור חום של מדיום כיח מלאכותי. עיקור מסנן מונע דנטורינג של מוצין ורכיבים רגישים אחרים לחום של המדיום ומניב מדיום ברור שניתן להשתמש בו לאמצעים אופטיים של צמיחה מיקרוביאלית. בעוד סינון-עיקור הוצע ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
תמיסת ויטמינים BME (100x)	MilliporeSigma	B6891	תמיסה מרוכזת של ויטמינים משלימים.
Crimper, 30 מ"מ	DWK Life Sciences	224307	Crimper להצמדת אטמי אלומיניום לבקבוקי סרום.
D-(+)-גלוקוז	MilliporeSigma	G7021	אבקת גלוקוז מוצק (איזומר דקסטרורוטטורי).
משאבת דיאפרגמה ME 2 NT	VACUUBRAND	20730003	משאבת ואקום לסינון ואקום.
תחליב חלמון ביצה	HiMedia	FD045	תחליב סטרילי של 30% חלמון במי מלח.
פריטין, מופק מתמיסת	חלבון אחסון ברזל)	MilliporeSigma	F7879
מבער FIREBOY plus Safety Bunsen	Integra Biosciences	144000	Bunsen עם ממשק משתמש ותכונות בטיחות.
נייר pH הידריון (1.0– 14.0)	מעבדה מיקרו חיונית	94	נייר בדיקת pH לטווח של 1.0 – 14.0.
נייר pH הידריון (4.0– 9.0)	מעבדה חיונית	מיקרו 55	נייר בדיקת pH לטווח של 4.0 – 9.0.
נייר pH הידריון (6.0– 8.0)	מעבדה חיונית	מיקרו 345	נייר בדיקת pH לטווח של 6.0 – 8.0.
מכשיר בטיחות Hypodermic Needle-Pro EDGE, 18 G	Smiths Medical	401815	18 G מחטים עם מכסי בטיחות.
מד לחץ בשורה	MilliporeSigma	20469	מד לחץ גז לניטור לחץ הבקבוק.
Innova 42 Incubated Shaker	Eppendorf	2231000756	משולב אינקובטור/שייקר מסלולי.
מזרק Luer-Lok עם מחט מחוברת	Becton Dickinson	309580	שילוב מזרק 3 מ"ל ומחט 18 גרם.
מבחר שסתומי Luer	Precision Instruments	14011	שסתומים לצינורות זרימת גז.
LSE Orbital Shaker	ThermoFisher Scientific	6780-NP	שייקר אורביטלי לתסיסה של מדיה במהלך הסינון.
מגנזיום גופרתי Heptahydrate	MilliporeSigma	M2773	מלח אנגלי מוצק (מגנזיום גופרתי הפטהידרט).
ווסת אוויר רפואי חד שלבי עם מד זרימה	Western Enterprises	M1-346-15FM	ווסת קצב זרימת אוויר עם מד 15 ליטר לדקה.
תמיסת חומצות אמינו MEM (50x)	MilliporeSigma	M5550	תמיסה מרוכזת של חומצות אמינו חיוניות.
תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100x) MEM	MilliporeSigma	M7145	תמיסה מרוכזת של חומצות אמינו לא חיוניות.
מסנן Millex-GP, 0.22 ומיקרו; m	MilliporeSigma	SLMP25SS	0.22 ומיקרו; מ מסנן מזרק סטרילי ממברנה פוליאתרסולפון.
Milli-Q Academic	MilliporeSigma	ZMQS60E01	מערכת סינון מים סטרילית Milli-Q.
מוניטור חמצן MiniOX 3000	MSA	814365	ניטור אחוז חמצן בזרימת גז.
מאגר MOPS (1 מ', pH 9.0)	BBM-90	של Boston BioProducts	להתאמת pH של מדיה.
מוצין מאבקת	מוצין (חלבון מגליקוזיל היוצר ג'ל מגליקוזיל) של	קיבה חזיריתSigma	M2378
ערכת התאמה דוקרנית מפוליפרופילן טבעי	מכשיר הרווארד	72-1413	מחברים לצינורות זרימת גז.
ערכת הכנת ספריית ה-DNA Nextera XT	Illumina	FC-131-1096	הכנת ספרייה לזיהוי במהלך הרצף.
מערכת ריצוף NovaSeq 6000	Illumina	770-2016-025-N	פלטפורמת ריצוף רובה ציד ליצירת קריאות לדוגמה.
ווסת חמצן חד שלבי עם מד זרימה	Western Enterprises	M1-540-15FM	ווסת קצב זרימת חמצן עם מד 15 ליטר לדקה.
צינורות חמצן עם 2 מחברים סטנדרטיים	SunMed	2001-01	צינורות לחיבור רכיבי מערכת גז.
תמיסת מלח חוצצת פוספט, 10x, pH 7.4	Molecular Biologicals International	MRGF-6235	תמיסת מלח מרוכזת עם פוספט.
PC 420 פלטה חמה/בוחש	מרשל סיינטיפיק	CO-PC420	פלטה חמה/מערבל משולב.
אשלגן כלורי	MilliporeSigma	P9541	מלח אשלגן כלורי מוצק.
מוטות ערבוב חד פעמיים PTFE	ThermoFisher Scientific	14-513-95	מוטות ערבוב מגנטיים חד פעמיים.
PTFE חוט חוט אטם טפלון קלטת	VWR	470042-938	קלטת טפלון לחיזוק חיבורי מערכת גז.
מחסנית טיהור Q-Gard 2	MilliporeSigma	QGARD00D2	מחסנית טיהור למערכת Milli-Q.
בקבוקי אחסון מדיה לשימוש חוזר	בקבוקי ThermoFisher Scientific	06-423A	לערבוב ואחסון מדיה תרבית.
פקק גומי, 30 מ"מ, אפור ברומובוטיל	DWK מדעי החיים	224100-331	פקקי גומי לבקבוקי סרום.
בקבוק סרום עם סימונים יצוקים, 500 מ"ל	DWK Life Sciences	223952	בקבוקי סרום זכוכית לתרבית אטומה.
סט הארכת קדח קטן	Braun Medical	471960	הארכת צינורות עם מחברי נעילת לואר.
נתרן כלורי	MilliporeSigma	S3014	מלח נתרן כלורי מוצק.
בקרת ספייק אין I (עומס מיקרוביאלי גבוה)	ZymoBIOMICS	D6320	חיידקי ספייק אין (I. halotolerans ו- A. halotolerans) לחישובי עומס מיקרוביאלי מוחלט
מערכת סינון ואקום סטרילית לשחרור מהיר Stericup	MilliporeSigma	S2GPU02RE	250 מ"ל 0.22 ומיקרו; תא סינון ואקום M.
מגבונים חד פעמיים קוטל חיידקים Super Sani-Cloth	חד פעמיים מקצועיים בינלאומיים	H04082	מגבונים חד פעמיים לקוטלי חיידקים לעיקור.
תערובת מתכות קורט, 1000x	ThermoFisher Scientific	NC0112668	תמיסה מרוכזת של מתכות קורט פיזיולוגיות.
אטם אלומיניום לא מרופד, 30 מ"מ	DWK Life Sciences	224187-01	אטמי אלומיניום מכווצים על גבי פקקי גומי.
מיכל אוויר בדרגה רפואית USP	Airgas	AI USP200	מיכל אוויר דחוס לקלט למערכת הזילוף.
מיכל חמצן בדרגה רפואית USP	Airgas	OX USP200	מיכל חמצן דחוס לקלט למערכת הזילוף.