מאמר שיטה

הדמיה מיטוכונדריאלית Ca2 + ספיגה אסטרוציטים ונוירונים באמצעות אינדיקטורים Ca2+ מקודדים גנטית (GECIs)

DOI:

10.3791/62917

⸱

22 בינואר 2022

 ,  ,  , 
1Dalton Cardiovascular Research Center, University of Missouri-Columbia, 2Department of Biomedical, Biological and Chemical Engineering, University of Missouri-Columbia

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוקטוקול זה נועד לספק שיטה במבחנה ובהדמיה של ויוו מיטוכונדריאלי Ca2+ באסטרוציטים ונוירונים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondrial Ca2+ ממלא תפקיד קריטי בשליטה על אגירה ציטסולית Ca2+ , חילוף חומרים של אנרגיה, טרנסדוקציה של אותות הסלולר. עומס יתר של Ca2 + מיטוכונדריאלי תורם למצבים פתולוגיים שונים, כולל ניוון עצבי ומוות תאים אפופטוטיים במחלות נוירולוגיות. כאן אנו מציגים סוג תא ספציפי ומיטוכונדריה מיקוד גישה מולקולרית עבור הדמיה מיטוכונדריאלית Ca2 + אסטרוציטים נוירונים במבחנה ו in vivo. בנינו פלסמידים DNA קידוד מיטוכונדריה מיקוד גנטית מקודדים גנטית Ca2 + אינדיקטורים (GECIs) GCaMP5G או GCaMP6s (GCaMP5G/6s) עם אסטרוציטים- נוירון ספציפיים ליזמים gfaABC1D ו- CaMKII ורצף מיקוד mitochondria (mito-). עבור הדמיה מיטוכונדריאלית במבחנה Ca2+ , הפלסמידים הועברו לאסטרוציטים ונוירונים מתורבתים כדי לבטא GCaMP5G/6s. עבור הדמיה מיטוכונדריאלית Ca2+ ב- vivo, וקטורים ויראליים הקשורים לאדנו (AAVs) הוכנו והוזרקו למוחות העכבר כדי לבטא GCaMP5G/6s במיטוכונדריה באסטרוציטים ונוירונים. הגישה שלנו מספקת אמצעי שימושי כדי לדמיין דינמיקה מיטוכונדריאלית Ca2+ אסטרוציטים נוירונים כדי ללמוד את הקשר בין איתות ציטוטוסולי ומיטוכונדריאלי Ca2 + , כמו גם אינטראקציות אסטרוציטים-נוירונים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המיטוכונדריה הם אברונים תת-תאיים דינמיים ונחשבים למוקדי הכוח של התא לייצור אנרגיה. מצד שני, המיטוכונדריה יכולה לקחת את Ca2+ למטריקס בתגובה מקומי או ציטוסולי Ca2 + עולה. ספיגת ספיגת Ca2+ מיטוכונדריאלית משפיעה על תפקוד מיטוכונדריאלי, כולל תהליכים מטבוליים כגון תגובות במחזור חומצה טריקרבוקסילית (TCA) וזרחן חמצוני, ומסדירה Ca2 +חלבונים רגישים בתנאים פיזיולוגיים1,2,3,4. מיטוכונדריאלי Ca2 + עומס יתר הוא גם דטרמיננטה למוות תאים, כולל נמק ואפופטוזיס בהפרעות מוחיות שונות5,6,7. זה גורם לפתיחה של נקבוביות מעבר חדורות מיטוכונדריאליות (mPTPs) ושחרור של קופקטור caspase, אשר ליזום מוות תא אפופטוטי. לכן, חשוב ללמוד דינמיקה מיטוכונדריאלית Ca2+ וטיפול בתאים חיים כדי להבין טוב יותר את הפיזיולוגיה והפתולוגיה התאית.

המיטוכונדריה שומרת על מטריצה Ca2+ הומאוסטזיס באמצעות איזון בין ספיגת Ca2+ לשפכים. ספיגת קיקיון מיטוכונדריאלי Ca2+ מיושר בעיקר על ידי uniporters מיטוכונדריאלי2 + (MCUs), בעוד Ca2 + שפכים מיטוכונדריאליים הוא בתיווך Na+-Ca2 +- Li+ מחליפים (NCLXs) ואת H+/ Ca2 + מחליפים (mHCXs)8. האיזון יכול להיות מוטרד באמצעות גירוי של קולטנים מצמידים חלבון G (GPCRs)9. מיטוכונדריאלי Ca2 + הומאוסטזיס מושפע גם על ידי אגירה מיטוכונדריאלית על ידי היווצרות של xCaמסיס 2 +-xPO4x-xOH מתחמים8.

שינויים תאיים ומיטוכונדריאליים בריכוז Ca2+ ([Ca2+]) ניתן להעריך על ידי אינדיקטורים פלורסנט או זוהר Ca2+ . Ca2+ איגוד אינדיקטורים גורם לשינויים ספקטרליים, המאפשר הקלטה של תאים חינם [Ca2+] בזמן אמת בתאים חיים. שני סוגים של בדיקות זמינים כעת לניטור שינויים Ca2+ בתאים: אינדיקטורים כימיים אורגניים ומחווני Ca2+ מקודדים גנטית (GECIs). בדרך כלל, גרסאות שונות עם זיקות שונות של Ca2+ (בהתבסס על Kd),תכונות ספקטרליות (עירור ואורכי גל פליטה), טווחים דינמיים ורגישויות זמינים לשאלות הביולוגיות הנחקרות. למרות אינדיקטורים אורגניים סינתטיים רבים Ca2 + שימשו עבור הדמיה ציטוטוסולי Ca2 + , רק כמה ניתן לטעון באופן סלקטיבי במטריצה המיטוכונדריאלית עבור הדמיה מיטוכונדריאלית Ca2 + , עם רוד-2 להיות הנפוץ ביותר (עבור ביקורות לראות10,11). עם זאת, לרוד-2 יש חיסרון גדול של דליפה במהלך ניסויים ארוכים; בנוסף, הוא מחולק בין המיטוכונדריה, אברונים אחרים ואת cytosol, מה שהופך מדידות מוחלטות subcompartments שונים קשה. לעומת זאת, באמצעות מקדמים ספציפיים מסוג תא ורצפי פילוח תאים תת-תאיים, GECIs יכולים לבוא לידי ביטוי בסוגי תאים ותאים תת-תאיים שונים להדמיית Ca2+ ספציפי לתאים ולאדר במבחנה או ב- vivo. מדדי GCaMP Ca2+ מבוססי עוצמת פלואורסצנטיות באורך גל אחד התגלו לאחרונה כמדדי GECIs גדולים12,13,14,15,16. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול עבור מיטוכונדריה-פילוח וביטוי ספציפי סוג התא של GCaMP5G ו- GCaMP6s (GCaMP5G/6s) אסטרוציטים נוירונים, הדמיה ספיגת Ca2+ מיטוכונדריאלי בסוגי תאים אלה. באמצעות פרוטוקול זה, הביטוי של GCaMP6G/6s במיטוכונדריה בודדת ניתן לגלות, ו ספיגת Ca2 + ברזולוציה מיטוכונדריאלית אחת ניתן להשיג אסטרוציטים נוירונים במבחנה ו in vivo.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נהלים הנוגעים לבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) באוניברסיטת מיזורי-קולומביה.

1. בניית פלסמידים DNA

הערה: עבור דימות במבחנה ובהדמיית ויוו, נבנים פלסמידים DNA המקודדים GCaMP5G/6s עם מקדמים ספציפיים לאסטרוציטים ונוירונים ורצפי פילוח מיטוכונדריאליים.

  1. Insert מטריצה מיטוכונדריאלית (MM)-targeting sequence (mito-) ATGT CCGTCCTGAC GCCGCTGCTG CTGCGGGGCT TGACAGGCTC GGCCCGGCGG CTCCCAGTGC CGCGCGCCAA GATCCATTCG TTG17 לתוך אתרי שיבוט EcoRI ו BamHI בעמוד השדרה של וירוס הקשורים אדנו (AAV) plasmid pZac2.1 כדי להשיג plasmids המכילים מקדם אסטרוציטי gfaABC1D או מקדם CaMKII עצבי18,19,20.
  2. תת-קלון GCaMP5G/6s לאתרי השיבוט BamH I ולא 1 ב plasmids לעיל כדי להשיג פלסמידים חדשים pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G/6s ו pZac-CaMKII-mito-GCaMP5G/6s המתמקדים בביטוי טרנסג'נדריה במיטוכונדריה באסטרוציטים ונוירונים20,21 (איור 1A).
  3. הכן pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G ו pZac-CaMKII-mito-GCaMP6s DNA plasmids עבור transfection למחקר במבחנה (סעיף 2). הפיקו וקטורים AAV עם סרוטיפ 5 עבור אסטרוציטים וסרוטיפ 9 עבור נוירונים למחקר ויוו 18 (סעיף 3).

2. אין ויטרו מיטוכונדריאלי Ca2+ הדמיה אסטרוציטים ונוירונים

  1. הכן אסטרוציטים ראשוניים מקליפת המוח של עכברי יילודים P1 ונוירונים ראשוניים מקליפת המוח של עוברים E15-1618,22,23,24, ותרבות אותם על כיסויי זכוכית בקוטר 12 מ"מ בצלחות 24-well באמצעות מדיום הנשר המותנה של Dulbecco (DMEM) המכיל 10% סרום בקר עוברי (FBS), ובינוני בזאלי עצבי (NBM) המכיל 2% B27, בהתאמה.
  2. תות-תולה אסטרוציטים בוגרים ונוירונים עם pZac-gfaABC1D-GCaMP6s ו pZac-CaMKII-GCaMP5G plasmids באמצעות ריאגנט טרנספקטציה על בסיס שומנים בדם כדי לבטא GCaMP6s במיטוכונדריה של אסטרוציטים ו- GCaMP5G במיטוכונדריה של נוירונים18,20,21. מעבירים תאים בכל באר עם 0.5 מיקרוגרם של דנ"א, ומשנים את המדיום 6 שעות מאוחר יותר.
    הערה: האסטרוציטים והנוירונים מוכנים להדמיה 1-2 ימים לאחר ההדבקה.
  3. לבצע במבחנה מיטוכונדריאלי Ca2 + הדמיה 1-2 ימים לאחר transfection.
    1. העבר את כיסויי הזכוכית עם אסטרוציטים או נוירונים לתא זלוף PH-1 תחת אפיפלואורסצנטיות או שני מיקרוסקופ פוטון.
    2. לעורר ספיגת מיטוכונדריאלי אסטרוציטי Ca2+ עם 100 μM ATP ב- ACSF, או לעורר מיטוכונדריה עצבית עם 100 גלוטמט מיקרומטר / 10 μM גליצין20,25 (איור 2 ואיור 3).
      הערה: שינויי פתרון מ- ACSF ל- ATP- ו- ACSF המכיל גלוטמט / גליצין נשלטים על ידי מערכת זלוף ALA-VM821. המהירות של שינוי הפתרון נשלטת ב 1-2 מ"ל / דקה על ידי התאמת שסתום.

3. In vivo מיטוכונדריאלי Ca2+ הדמיה אסטרוציטים נוירונים

  1. הכנות AAV.
    1. הכן את הווקטורים הבאים הקשורים לאדנו (rAAV) באמצעות פלסמידים DNA שהוכנו בסעיף 1: rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G ו- rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s.
      הערה: בניסוי זה, וקטורים rAAV של סרוטיפ 5 היו מוכנים לבטא GCaMP5G במיטוכונדריה אסטרוציטים ו vectors rAAV של סרוטיפ 9 היו מוכנים לבטא GCaMP6s במיטוכונדריה בנוירונים.
  2. הזרקת AAV סטריאוטקסית.
    1. תירדים את העכבר עם 3% איזופלוריין.
      הערה: מאוחר יותר במהלך הניתוח, רמות איזופלוראן מופחתות ל 2%.
    2. לאחר שהעכבר מגיע לרמה כירורגית של הרדמה, כפי שנקבע על ידי צביטת זנב ובוהן, לגלח את השיער מעל אתר הניתוח, קליפת המוח המוטורית או הסומטו-סנסורית, עם גוזם שיער.
    3. מקם את העכבר בהתקן הסטריאוטקסי של העכבר ותקן את הראש באמצעות מוטות אוזניים. החל משחה עיניים על העיניים כדי להגן עליהם במהלך הניתוח. השתמש כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של העכבר ב 37 °C (50 °F) לאורך כל הניתוח.
      הערה: בצע ניתוח באמצעות הליכים אספטיים. כל הכלים הכירורגיים צריכים להיות מעוקרים או על ידי autoclaving או מחטא חרוז חם.
    4. לאחר העכבר מותקן על המכשיר סטריאוטקסי, לחטא את הקרקפת עם לשפשף על בסיס יוד לסירוגין ו 70% אתנול שלוש פעמים. לעשות חתוך בקו האמצע של הקרקפת כדי לחשוף את אתר ההזרקה.
    5. חותכים את העור בציר ברגמה-למדה ויוצרים חור בר בקוטר ~ 1 מ"מ עם מקדחה במהירות גבוהה במיקום ההזרקה המיועד של המנוע או קליפת המוח הסומטו-סנסורית.
    6. השתמש במזרק 33 G המילטון המכיל וירוס הקשור לאדנו (rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G וקטורים [1 x 1011 GC] או rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s [1 x 1011 GC]) כדי להזריק עד 1 μL של וירוס באזור היעד.
      הערה: לדוגמה, עבור משלוח ויראלי קליפת המוח, להזריק את פתרון הווירוס בשני עומקים בשלבים מרובים. ראשית, הכנס את המחט לעומק של 1 מ"מ מהדורה ואפשר 5 דקות למוח להתאושש. לאחר מכן, להזיז את המחט עד ~ 700 עומק מיקרומטר ולהזריק 500 nL של פתרון הנגיף במהירות הזרקה של 10 nL / s באמצעות מזרק המילטון נשלט על ידי בקר משאבת מיקרו מזרק. לאחר השלמת ההזרקה, המתן 5 דקות כדי לאפשר לווירוס לפזר לתוך המוח. לאחר מכן, להזיז את המחט עד למיקום הזריקה השנייה בעומק של 300 מיקרומטר. כאן, להזריק 500 nL נוספים של פתרון הווירוס. המתן 10 דקות כדי לאפשר לווירוס לפזר לתוך המוח.
    7. סגור את הקרקפת ואת העור באמצעות דבק רקמה. תן לעכברים להתאושש על כרית החימום. שלח עכברים בחזרה למתקן החיות לאחר ההחלמה.
  3. הדמיה של חלון גולגולתי והדמיה של שני פוטון (2-P) של אותות מיטוכונדריאליים Ca2+.
    הערה: השתלת חלון הגולגולת נעשית 3 שבועות לאחר הזרקת AAV מעל המנוע או קליפת המוח הסומטוסנסורית26,27,28,29. Carprofen (10 מ"ג/ק"ג) מוזרק תת עורית כדי לספק הקלה מכאב פוטנציאלי לפני הניתוח. הניתוחים הכירורגיים של חלון הגולגולת זהים להליכים כירורגיים בהזרקת AAV ומבוצעים בתנאים אספטיים.
    1. תירדים את העכבר עם 3% איזופלוריין.
      הערה: זוהי המינון הראשוני ולהפחית ל 2% עבור הניתוח מאוחר יותר. במהלך ההדמיה, הזרקה תוך-פריתוניאלית (IP) של 130 מ"ג קטמין/10 מ"ג קסילאצין/ק"ג משקל גוף מומס ב- ACSF משמשת להרדמה.
    2. מקם את העכבר בהתקן הסטריאוטקסי של העכבר ותקן את הראש באמצעות מוטות אוזניים. יש למרוח משחה עיניים על העיניים. השתמש כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של העכבר ב 37 °C (50 °F) לאורך כל הניתוח.
      הערה: כל הכלים הכירורגיים צריכים להיות מעוקרים.
    3. לעשות חתוך של 5-8 מ"מ אורך בקו האמצע של הקרקפת ולהסיר דש של העור באמצעות זוג מספריים.
    4. לאחר חשיפת הגולגולת, בצעו גולגולת בקוטר 2.0-3.0 מ"מ באמצעות מקדחה במהירות גבוהה מעל האזור המוזרק לווירוס (כלומר, קליפת המוח המוטורית או קליפת המוח הסומטו-סנסורית, איור 1B). ראשית, לעשות ארבעה חורים קטנים, ולאחר מכן לקדוח יחד במעגל המחבר את החורים. לאחר מכן, להרים ולהסיר את העצם עם מספריים חדים ולהסיר. ניתן להסיר או לשמור את דורה מאטר חשוף ללא פגע לתשין החלון הגולגולתי.
    5. מניחים כיסוי זכוכית בקוטר 3-5 מ"מ הנושא סיליקון שקוף מעל הגולגולת. השתמש בקיסם כדי לדחוף את חלון הגולגולת בעדינות על פני השטח של המוח. לאחר מכן, לאטום את הקצה עם כמות קטנה של דבק סיליקון.
      הערות: לחלופין, במקום דיסק סיליקון, 1.2% נקודת התכה נמוכה אגרוז ג'ל יכול לשמש בין זכוכית הכיסוי לבין רקמת המוח.
    6. לבסוף, לאטום את הקצוות של כיסוי עם מלט דנטלי. יש להצטמר להחיל מעט את הבטון בקצה חלון הגולגולת לצורך מליטה חזקה. חבר צלחת ראש מתכת בהתאמה אישית לגולגולת עם מלט דנטלי.
      הערה: לוח המתכת משמש לתיקון ראש העכבר לשלב של מיקרוסקופ 2-P במהלך מפגש ההדמיה (איור 1C).
    7. הוסף 0.5 מ"ל של פתרון ACSF מעל כיסוי על חלון הגולגולת לטבילת מים במהלך הדמיה.
    8. בצע זמן לשגות ב vivo 2-P הדמיה של מיטו-GCaMP5G אסטרוציטים ו mito-GCaMP6s בתאי עצב עם אורך גל 910 ננומטר דרך החלון הגולגולתי (איור 1C)18,20,27.
      הערה: במהלך ההדמיה, עכברים נמצאים על כרית החימום כדי לשמור על הטמפרטורה הפיזיולוגית. העכברים יוקרבו מיד לאחר סיום פגישת ההדמיה.
    9. תווית אסטרוציטים ב vivo עם גופריתודמין 101 (SR101) כאשר יש צורך לקבוע colocalization.
      1. בסוף שלב 3.3.4, להחיל 100 μL של 100 μM SR101 ב ACSF על פני קליפת המוח במשך 1-5 דקות.
      2. יש לשטוף את המשטח עם ACSF כדי לשטוף את ה-SR101 הלא מאוגד. באמצעות הדמיה 2-P, תיוג משותף של מיטו-GCaMP5G ו- SR101 באסטרוציטים ניתן לראות 45-60 דקות מאוחר יותר(איור 4A).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטרת מחקר זה הייתה לספק מתודולוגיה לדמות אותות מיטוכונדריאליים Ca2 + באמצעות GECIs באסטרוציטים ונוירונים במבחנה וב- in vivo. תוצאות של הדמיה במבחנה ו in vivo mitochondrial Ca2+ מוצגים כאן.

אין ויטרו מיטוכונדריאלי Ca2+ איתות אסטרוציטים ונוירונים מתורבתים
ספיגת Cyochondrial Ca2+ אסטרוציטים יכולה להיות מעוררת על ידי יישום ATP, וספיגת Ca<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במאמר זה, אנו מספקים שיטה ופרוטוקול להדמיה של אותות מיטוכונדריאליים Ca2+ באסטרוציטים ונוירונים. יישמנו אסטרטגיות מיטוכונדריה-פילוח וסוג תאים כדי לבטא GECI GCaMP5G/6s. כדי למקד GCaMP5G/6s במיטוכונדריה, כללנו רצף מיטוכונדריה מיקוד ב plasmids. כדי לבטא GCaMP5G/6s אסטרוציטים נוירונים ב vivo, הכנסנו מקדם ספציפי אסטרוציטים gfaABC1D ומקדם ספציפי נוירון CaMKII לתוך plasmids. ביטוי ספציפי מסוג התא של GCaMP5G/6s באסטרוציטים ונוירונים יכול להיות מאושר על ידי SR101 תיוג אסטרוציטים וחיסון של נוירונים עם NeuN. מהנת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות של הפרעות נוירולוגיות ושבץ (NINDS) מעניק R01NS069726 ו R01NS094539 ל- SD. אנו מודים לאריקה דמרש על הקלטת האודיו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
משחת דמעות מלאכותיותרוגביNDC-0536-6550-9183% פטרולאטום לבן
דבק ציאנואקרילטמכשירי דיוק3M דבק Vetbond
ניתוח סטריאומיקרוסקופניקוןSMZ 2Bניתוח
מלקחיים דומונט עם קצה עדיןFine Science Tools11255-20להסרת
החלקות כיסוי זכוכית dura, 0.13-0.17 מ"מ עוביפישר סיינטיפיק12-542Aלכיסוי חלון גולגולת
מקדחה מיקרו במהירות גבוההFine Science Tools18000-17עם מקדח ליטוש עצם
מזרק הזרקההמילטון2.5 מ"ללהזרקה ויראלית
קטמיןVEDCONDC-50989-996-06100 מ"ג/ק"ג משקל גוף
נקודת התכה נמוכה אגרוזסיגמא-אולדריץ'A9793חפצי תנועה מפחיתים
מסגרת מתכתבהתאמה אישיתראה איור 1לחיבור המוח לשלב המיקרוסקופ
בקר משאבת מיקרו-מזרק WorldPrecision InstrumentsUMP3בקר מהירות הזרקה
מכשיר סטריאוטקסי עכברStoelting51725להחזקת עכברים
תא זלוףוורנר אינסטרומנטס64-0284
מערכת פרספוזיהALA Scientific InstrumentsALA-VM8
כרית חימום עם ויסות עצמיFine ScienceTools 21061למניעת היפותרמיה של עכברים
Sulforhodamine 101InvitrogenS-359צבע פלואורסצנטי אדום לתיוג אסטרוציטים
מספריים כירורגיים, 12 ס"מFine Science Tools14002-12לדיסקציה
TrephineFine Science Tools18004-23לניקוי חומר
קסילזיןVEDCONDC-50989-234-1110 מ"ג/ק"ג משקל גוף
עולמיים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Griffiths, E. J., Rutter, G. A. Mitochondrial calcium as a key regulator of mitochondrial ATP production in mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1787 (11), 1324-1333 (2009).
  2. Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. Mitochondrial Ca2+ homeostasis: mechanism, role, and tissue specificities. Pflugers Archiv - European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).
  3. Llorente-Folch, I., et al. Calcium-regulation of mitochondrial respiration maintains ATP homeostasis and requires ARALAR/AGC1-malate aspartate shuttle in intact cortical neurons. The Journal of Neuroscience. 33 (35), 13957-13971 (2013).
  4. Burkeen, J. F., Womac, A. D., Earnest, D. J., Zoran, M. J. Mitochondrial calcium signaling mediates rhythmic extracellular ATP accumulation in suprachiasmatic nucleus astrocytes. The Journal of Neuroscience. 31 (23), 8432-8440 (2011).
  5. Duchen, M. Mitochondria, calcium-dependent neuronal death and neurodegenerative disease. Pflugers Archiv - European Journal of Physiology. 464 (1), 111-121 (2012).
  6. Gouriou, Y., Demaurex, N., Bijlenga, P., De Marchi, U. Mitochondrial calcium handling during ischemia-induced cell death in neurons. Biochimie. 93 (12), 2060-2067 (2011).
  7. Qiu, J., et al. Mitochondrial calcium uniporter Mcu controls excitotoxicity and is transcriptionally repressed by neuroprotective nuclear calcium signals. Nature Communications. 4, 2034(2013).
  8. Filadi, R., Greotti, E. The yin and yang of mitochondrial Ca2+ signaling in cell physiology and pathology. Cell Calcium. 93, 102321(2021).
  9. Finkel, T., et al. The ins and outs of mitochondrial calcium. Circulation Research. 116 (11), 1810-1819 (2015).
  10. Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
  11. Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. Mitochondria: The calcium connection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA. 1797 (6-7), 607-618 (2010).
  12. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  13. Yamada, Y., et al. Quantitative comparison of genetically encoded Ca2+ indicators in cortical pyramidal cells and cerebellar Purkinje cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 5, 18(2011).
  14. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
  15. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  16. Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
  17. Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells. Current Biology: CB. 5 (6), 635-642 (1995).
  18. Xie, Y., Wang, T., Sun, G. Y., Ding, S. Specific disruption of astrocytic Ca2+ signaling pathway in vivo by adeno-associated viral transduction. Neuroscience. 170 (4), 992-1003 (2010).
  19. Lee, Y., et al. GFAP promoter elements required for region-specific and astrocyte-specific expression. Glia. 56 (5), 481-493 (2008).
  20. Li, H., et al. Imaging of mitochondrial Ca2+ dynamics in astrocytes using cell-specific mitochondria-targeted GCaMP5G/6s: Mitochondrial Ca2+ uptake and cytosolic Ca2+ availability via the endoplasmic reticulum store. Cell Calcium. 56 (6), 457-466 (2014).
  21. Zhang, N., Ding, S. Imaging of mitochondrial and cytosolic Ca2+ signals in cultured astrocytes. Current Protocols in Neuroscience. 82, 1-11 (2018).
  22. Bi, J., Li, H., Ye, S. Q., Ding, S. Pre-B-cell colony-enhancing factor exerts a neuronal protection through its enzymatic activity and the reduction of mitochondrial dysfunction in in vitro ischemic models. Journal of Neurochemistry. 120 (2), 334-346 (2012).
  23. Wang, X., Li, H., Ding, S. Pre-B-cell colony-enhancing factor protects against apoptotic neuronal death and mitochondrial damage in ischemia. Scientific Reports. 6, 32416(2016).
  24. Wang, X., et al. Subcellular NAMPT-mediated NAD+ salvage pathways and their roles in bioenergetics and neuronal protection after ischemic injury. Journal of Neurochemistry. 151 (6), 732-748 (2019).
  25. Xie, Y., Chen, S., Wu, Y., Murphy, T. H. Prolonged deficits in parvalbumin neuron stimulation-evoked network activity despite recovery of dendritic structure and excitability in the somatosensory cortex following global ischemia in mice. The Journal of Neuroscience. 34 (45), 14890-14900 (2014).
  26. Ding, S. In vivo imaging of Ca2+ signaling in astrocytes using two-photon laser scanning fluorescent microscopy in Astrocytes. Milner, R. , Humana Press. 545-554 (2012).
  27. Li, H., et al. Disruption of IP3R2-mediated Ca2+ signaling pathway in astrocytes ameliorates neuronal death and brain damage while reducing behavioral deficits after focal ischemic stroke. Cell Calcium. 58 (6), 565-576 (2015).
  28. Ding, S., et al. Photothrombosis ischemia stimulates a sustained astrocytic Ca2+ signaling in vivo. Glia. 57 (7), 767-776 (2009).
  29. Ding, S., et al. Enhanced astrocytic Ca2+ signals contribute to neuronal excitotoxicity after status epilepticus. The Journal of Neuroscience. 27 (40), 10674-10684 (2007).
  30. Gobel, J., et al. Mitochondria-endoplasmic reticulum contacts in reactive astrocytes promote vascular remodeling. Cell Metabolism. 31 (4), 791-808 (2020).
  31. Diaz-Garcia, C. M., et al. The distinct roles of calcium in rapid control of neuronal glycolysis and the tricarboxylic acid cycle. eLife. 10, 64821(2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

In VivoGCaMP5G GCaMP6s

מאמרים קשורים