הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

זיהוי של ביטוי קולטן מצמיד חלבון G בנוירונים Afferent עכבר Vagal באמצעות מולטיפלקס בהכלאה במקום

3.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62945

⸱

20 בספטמבר 2021

 , 
1Center for Hypothalamic Research and Department of Internal Medicine, UTSouthwestern Medical Center at Dallas

במאמר זה

סיכום

מולטיפלקס בהכלאה במקום (ISH) הועסק כדי לדמיין בו זמנית את התמלילים עבור שני קולטנים מצמידי חלבון G וגורם שעתוק אחד בכל הקומפלקס הגנגליוני של העכבר הבוגר. פרוטוקול זה יכול לשמש ליצירת מפות מדויקות של פרופילי התמלול של נוירונים vagal afferent.

תקציר

מחקר זה מתאר פרוטוקול עבור מולטיפלקס בהכלאה במקום (ISH) של הגרעינים וריד הצוואר-לולאה העכבר, עם דגש מיוחד על זיהוי הביטוי של קולטנים חלבון G (GPCRs). גרעיני וריד הצוואר-לולאה קבועים בפורמלין עובדו עם טכנולוגיית RNAscope כדי לזהות בו זמנית את הביטוי של שני GPCRs מייצגים (קולטני cholecystokinin ו ghrelin) בשילוב עם גן סמן אחד של או לולאה (תיבת הומיאוbox דמוית זיווג 2b, Phox2b) או נוירונים מושבעים ורידיים (חלבון אצבע אבץ יחסי ציבור 12, Prdm12). גרעינים מסומנים צולמו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לקבוע את דפוסי ההפצה והביטוי של התעתיקים הנ"ל. בקצרה, נוירונים afferent Phox2b נמצאו לבטא בשפע את קולטן cholecystokinin (Cck1r) אבל לא את קולטן גרלין (Ghsr). תת-קבוצה קטנה של נוירונים afferent Prdm12 נמצא גם להביע Ghsr ו / או Cck1r. אזהרות טכניות פוטנציאליות בעיצוב, עיבוד, ופרשנות של מולטיפלקס ISH נדונים. הגישה המתוארת במאמר זה עשויה לסייע למדענים ביצירת מפות מדויקות של פרופילי התמלול של נוירונים זרים vagal.

מבוא

גופי התאים של זרים vagal כלולים בגרעפי הצוואר, פטרוסאל ונודים1,2,3. האקסונים שלהם נוסעים יחד דרך כמה ענפים של עצב הוואגוס לשטחים קרניוקרוויים, בית החזה והבטן4,5,6,7. מן סופם הקרבי, afferents vagal יכול להגיב למגוון רחב של גירויים פיזיולוגיים ומזיקים8,9,10. עם זאת, ההתפלגות של מולקולות איתות וקולטנים המעורבים חישת vagal נשאר מאופיין בצורה גרועה. הסיבה לכך היא שגרעי הוואגל, למרות גודלם הקטן, מבטאים קשת רחבה של קולטנים, כולל מספר גדול של GPCRs8,11,12,13. יתר על כן, נוירונים afferent vagal הם הטרוגניים מטבעם ולהציג פרופילים מולקולריים ברורים14. כדי לסבך את העניין, הגרעינים הצוואריים, הפטרוסאליים והנודים מחוברים לעכבר, ובכך יוצרים מסה גנגליונית אחת. לבסוף, בתת קבוצה של בעלי חיים, גנגליון הנודים מחובר לגנגליון צוואר הרחם העליון האוהד15.

בעבר, חוקרים פנו אימונוהיסטוכימיה ללמוד את האיפור הנוירוכימי של נוירונים afferent vagal16,17,18. בעוד אימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדנים מאומתים היא שימושית, התוצאות של מחקרים אימונוהיסטוכימיים חייבים להתפרש בזהירות. לדוגמה, מאמצים רבים לזהות נוגדנים ספציפיים נגד GPCRs נכשלו19,20,21,22,23,24,25, מוביל חוקרים למסקנה כי רוב הנוגדנים נגד GPCRs אינם אמינים. כדי לעקוף בעיות אלה, PCR כמותי (qPCR) שימש נרחב להערכת ביטוי גנים במסה גנגל גנגליוני מכרסם26,27,28,29. עם זאת, בחינת ביטוי גנים באמצעות qPCR מתרחשת במחיר של אובדן מידע מרחבי. בפרט, לא ניתן לחזות כמה תאים או אילו סוגי תאים מבטאים גן מסוים של עניין (למשל, לולאה לעומת תאי הצוואר). בעיות חוזרות ונשנות כוללות גם את הזיהום עם רקמות סמוכות ואת הכללת אורכים משתנים של עצב vagus, גרעיני צוואר הרחם מעולה, וגרעיני הצוואר במהלך ניתוח15. כתוצאה מהקשיים הנ"ל, המחלוקת מקיפה את הביטוי וההפצה של מספר GPCRs בנוירונים זרים vagal. דוגמה תמוהה במיוחד מתייחסת לקולטן הגרלין (Ghsr). בעוד כמה מחקרים מצאו ביטוי נרחב של קולטן זה נוירונים afferent vagal30,31,32, אחרים מצאו Ghsr mRNA להיות כמעט בלתי ניתן לגילוי בגנגליון הנודים11,14. מיפוי מפורט של Ghsr mRNA במסה גנגליוני הוא אפוא מוצדק.

בהכלאה במקום (ISH) שימש גם להערכת דפוסי ביטוי גנים במסה הגנגלית הוואגליונית7,11,12,33,34,35. מכיוון שטכניקות מבוססות RNA נשארות אמינות וספציפיות יותר מאשר טכניקות מבוססות נוגדנים ברובהנסיבות 36,37, מחקרי ISH הוכיחו ערך להבנה טובה יותר של הקידוד הנוירוכימי של נוירונים עבים. עם זאת, טכניקות ISH המסורתיות עצמן אינן נטולות אזהרות. ISH רדיואקטיבי הוא רגיש אבל מייצר רקע ונשאר מסורבל38. ISH לא רדיואקטיבי הוא פחות מסובך אבל גם פחות רגיש38. לעומת זאת, שיטת RNAscope ISH שפותחה לאחרונה רגישה מאוד ומייצרת רקע מינימלי39. המחקר הנוכחי יישם מולטיפלקס פלואורסצנטי RNAscope לגילוי של GPCRs נוירונים afferent vagal של העכבר. התמקדנו במיפוי ההתפלגות של Ghsr והשווינו את תפוצתו לזו של קולטן cholecystokinin (Cck1r), GPCR אחר ידוע לבוא לידי ביטוי גנגליון הנודים34. לבסוף, שני גורמי שעתוק, הומיאובוקס 2b (Phox2b) וחלבון אצבע אבץ 12 (Prdm12), שימשו כסמנים סלקטיביים לנוירונים נודים ורידים, בהתאמה14. מבלי לדמיין Phox2b או Prdm12, זה יהיה מאתגר לזהות וריד לעומת נודים afferents בוודאות. מלכודות טכניות פוטנציאליות נדונות גם לאורך המאמר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: עכברים המשמשים במחקר זה היו זכרים מסוג בר על רקע C57BL / 6J טהור. בסך הכל 4 עכברים שימשו מולטיפלקס ISH. כל העכברים היו בערך בני 8 שבועות בזמן ההקרבה. עכבר זכר אחד (בערך בן שנה) שימש גם להדגמת פלואורסצנטיות אנדוגני הקשורה להזדקנות. בעלי חיים שוכנו בכלובים מאווררים בתוך מתקן מחסום עם גישה למזון ומים. הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים במרכז הרפואי UT Southwestern בחנה ואישרה את הנהלים המתוארים להלן. פרטים על ריאגנטים וכלים ניתן למצוא בטבלת החומרים.

1. אוסף דוגמאות

  1. ביום ההקרבה, לתת מנת יתר של הידרציה כלורל (500 מ"ג/ק"ג, i.p.) לעכברים. לחדיר את העכברים מרדים עמוק באופן transcardially באמצעות משאבה peristaltic עם 5 מ"ל של 1x תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS) ואחריו 50 מ"ל של 10% פורמלין בטמפרטורת החדר.
    הערה: זה נעשה במכסה אדים כדי למנוע שאיפת פורמלין.
  2. כמו להנהון, פטרוסאלי, הגרעינים הצוואר מותכים ליצור מסה גנגליונית אחת בעכבר15, בזהירות לאסוף את כל המסה הגנגליונית vagal מכל צד (שמאל וימין) בעזרת היקף ניתוח ומספריים קפיציים עדינים ומלקחיים (ראה טבלת החומרים).
  3. בעת עריפת ראש העכבר עם זוג מספריים גדולים (ראה טבלת החומרים),הימנעו מריסוק גזע המוח.
  4. בעקבות גישת ניתוח שתוארה בעבר בחולדה40, להסיר את שרירי עצם החזה ו omohyoid לרוחב קנה הנשימה עם מלקחיים קטנים (שולחן החומרים) כדי לחשוף את עצם העורף. נקה את כל האזור של שריר, רקמת שומן, ורקמת הלחמית עד העורק הראשי, עצב vagus, העצב hypoglossal, מגנום foramen נראים. חותכים את כל העצב ההיפוגלוסאלי עם מספריים קפיציים קטנים(שולחן החומרים).
  5. חפשו את גנגליון הנודן כמסה שקופה קרוב למגנוםפורם 15. באמצעות מספריים קטנים (שולחן החומרים),בזהירות לשבור את העצם העורפית כדי לחשוף עוד יותר את גנגליון הצוואר. חפש מלנוציטים שחורים על פני השטח של וריד הצוואר כציון דרך חזותי.
  6. לחתוך חיבורים עצביים בין המסה הגנגלית vagal ולחלץ את כל המסה הגנגליונית על ידי משיכה בעדינות על הקצה ההיקפי של עצב vagus ובו זמנית חיתוך גנגליון הצוואר לכיוון גזע המוח עם מספריים קפיץ קטן(שולחן החומרים).
  7. הסר את רקמת הלחמית ואת השומן דבק עצב vagus ומסה גנגליונית ככל האפשר.
  8. כפי שקל לאבד גנגליון אחד במהלך ההעברה מצינור אחד לשני, לשמור ~ 0.5 ס"מ של עצב vagus כדי להקל על טיפול ולוקליזציה של דגימות.
  9. מניחים גרעינים בעזרת מלקחיים עדינים בצינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל ודגרה ב 4 °C (5 °F) בפורמלין במשך 24 שעות ועם 30% סוכרוז עוד 24 שעות.
  10. מקם גרעינים בתוך טיפה קטנה (~ 4 מ"מ Ø) של טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) בינוני על פיסת רדיד אלומיניום. לאחר מכן, להקפיא את הדגימה על מצע של קרח יבש.
  11. לחתוך את הדגימות עם cryostat ב -20 °C לחלקים של עובי 14 מיקרומטר ולאסוף על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית כמו 3 סדרה 42 מיקרומטר זה מזה.
    הערה: הימנעו מהצבת מקטעים קרובים לשולי השקופית. כדי להציל ריאגנטים, לשמור על קטעי הרקמה ארוזים היטב ככל האפשר, אך ללא חפיפה.
  12. לאחסן את הדגימות במקפיא -80 °C עד הצורך עבור ISH במשך 6 חודשים לפחות.
    הערה: עיין באיור 1 לפתרון בעיות עבור פלואורסצנטיות אנדוגנית.

2. טיפול מקדים ו-ISH

  1. לפני יום הניסויים, כלי זכוכית מעבדה autoclave לשמש ISH, כולל כלים מכתימים וצנצנות חוצץ כביסה.
    הערה: בעוד עבודה בתנאים ללא RNase אינה קריטית, ללבוש כפפות בכל עת. שמור RNase בקבוקי פתרון טיהור (שולחן החומרים) בהישג יד במקרה זיהום חשוד.
  2. ביום הראשון, להביא את השקופיות לטמפרטורת החדר על ספסל המוקדש במיוחד ISH. שוטפים את השקופיות ב-1x PBS ואופים אותן במשך 30 דקות ב-60 מעלות צלזיוס בתנור אפייה(שולחן חומרים).
  3. לאחר לתקן את השקופיות ב 4% פורמלין במשך 15 דקות ב 4 °C (70 °F).
  4. הביאו את ריאגנטים בערכת מולטיפלקס(שולחן החומרים)לטמפרטורת החדר.
  5. ייבשו את השקופיות ב-50%, 70% ו-100% אתנול למשך 5 דקות כל אחת. יש למרוח את תמיסת H2O2 על הדגימות למשך 10 דקות ולאחר מכן לשטוף במים מזוקקים כפולים (ddH2O).
  6. לטפל בדגימות עם ריאגנט אחזור היעד במשך 5 דקות, לשטוף ddH2O ואחריו 100% אתנול, ואוויר יבש. באמצעות עט הידרופובי, ליצור מחסום סביב הדגימות.
    הערה: אין להחיל את המחסום ההידרופובי קרוב מדי לחלקי הרקמה.
  7. החל פרוטאז במשך 30 דקות ב 40 °C (40 °C) בתנור הכלאה(שולחן החומרים).
  8. בינתיים, לפני המלחמה של הבדיקות ב 40 °C (50 °F) ולקרר אותם בטמפרטורת החדר לפני השימוש. לדגור את השקופיות עם השילוב הרצוי של בדיקות היעד (Cck1r-C3, Ghsr-C1, Phox2b-C2; או Cck1r-C3, Ghsr-C1, Prdm12-C2) למשך 2 שעות ב-40 מעלות צלזיוס בתנור הכלאה.
  9. דגירה רקמת שליטה שלילית עם דיהידרודיפיקולינט רדוקטאז (DapB) יעד C1 בדיקה עבור 2 שעות ב 40 °C (50 °F) בתנור הכלאה.
  10. יש לשטוף את השקופיות במאגר הכביסה ולאחסן למשך הלילה ב-5x תמיסת מלח נתרן סיטראט (SSC) בטמפרטורת החדר. לנוחות, לפצל את הניסוי ליומיים. למחרת, לשטוף את השקופיות עם חוצץ לשטוף ולדגירה אותם עם ריאגנטים הגברה המפורטים להלן (ראה מדריך למשתמש בטבלת החומרים).
  11. החל AMP1 (30 דקות ב 40 °C ),AMP2 (30 דקות ב 40 °C (70 °F), ו AMP 3 (15 דקות ב 40 °C (50 °F). יש לשטוף במאגר הכביסה בין כל שלב.
  12. להמיס כל צבע אופל (שולחן החומרים) דימתיל גופרתית ולאחסן את הפתרונות ב 4 °C (50 °F) עד הצורך.
  13. עבור ערוץ 1, לדגור את השקופיות עם HRP-C1 (15 דקות ב 40 °C) ואופל 520 (צבע ירוק; דילול 1/1,500; 30 דקות ב 40 °C). יש לשטוף במאגר הכביסה בין כל שלב.
  14. עבור ערוץ 2, לדגור את השקופיות עם HRP-C2 (15 דקות ב 40 °C (570° C) ואופל 570 (צבע צהוב; דילול 1/1,500; במשך 30 דקות ב 40 °C (50 °F). יש לשטוף במאגר הכביסה בין כל שלב.
  15. עבור ערוץ 3, לדגור על השקופיות עם HRP-C3 (15 דקות ב 40 °C (40 °C) ואופל 690 (צבע אדום רחוק; דילול 1/1,500; במשך 30 דקות ב 40 °C (40 °C). יש לשטוף במאגר הכביסה בין כל שלב.
  16. לשטוף את השקופיות ולחשוף אותם 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) עבור 30 s.
  17. יש למרוח מיד על כל שקופית ולהניח כיסוי על מקטע הרקמה.
  18. שמור את הרקמות אופקיות במחזיק שקופית ב 4 °C (5 °F) עד הדמיה.

3. מיקרוסקופיה וניתוח נתונים

הערה: ניתן לדמיין נתוני מולטיפלקס ISH עם מגוון רחב של מכשירים עם המסננים המתאימים. עם זאת, שיטת הדמיה מועדפת היא מיקרוסקופיה קונפוקלית עם מטרות 20x ו 63x (שמן); עיין בדיון מהסיבות. עיין באיור 2 לקביעת יחס האות לרעש האופטימלי.

  1. השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בקווי לייזר 488, 561 ו- 633 ננומטר. השתמש בפרמטרים הבאים רכישה (ראה טבלה 1): אופל 690 (HeNe 633 ננומטר, טווח זיהוי 668-696 ננומטר, כוח 2.0, רווח 724); אופל 570 (לייזר DPSS 561 ננומטר, טווח זיהוי 579-627 ננומטר, <כוח 15.0, <גיין 450); אופל 520 (לייזר ארגון 488 ננומטר, טווח זיהוי 499-535 ננומטר, <כוח 6.0, <גיין 830); DAPI (לייזר דיודה 405, טווח זיהוי 415-502 ננומטר, < כוח 12.0, <גיין 532).
  2. כדי לשפר את איכות התמונות, רכש עם קו בממוצע של 4 וגודל פיקסלים של לפחות 1024 x 1024.
    הערה: הפרמטרים לעיל מסופקים רק כדוגמה, ושינויים מומלצים בהתאם למכשיר אחד, הגדלה (20x או 63x), רמות ביטוי ורמות אנדוגניות של פלואורסצנטיות עבור כל רקמה נתונה.
  3. לאחר סיפוק הפרמטרים הרכישה, לאסוף תמונות באמצעות אותן הגדרות. ייחס צבעים כוזבים לכל ערוץ כדי להקל על הפריט החזותי.
    הערה: לדוגמה, אדום (Phox2b או Prdm12), ציאן (Cck1r), צהוב (Ghsr) ואפור (DAPI).
  4. בצע ספירת תאים באמצעות התמונות הדיגיטליות על-ידי זיהוי קווי המתאר של פרופילים חיוביים ל- RNAscope עם גרעין אחד מוכתם קלות ב- DAPI. חשב את אחוז הפרופילים החיוביים ל- RNAscope המבטאים כל תעתיק [איור 3A-C].
  5. כדי לשפר את ההקפדה והדיוק של האומדנים, לספור לפחות 2,000 פרופילים עצביים מלפחות 4 בעלי חיים שונים. בצע ספירה מגנעים שמאל וימין בנפרד.
  6. הזן את הנתונים בתרשים עוגה עם המספר הכולל של פרופילים שנספרו.
  7. השתמש בתוכנת הדמיה כדי להשיג תמונות ולתפור יחד תמונות 20x. השתמש ImageJ-פיג'י ותוכנה אחרת תמונה ועיצוב כדי ליצור את הלוחות הסופיים. יש למרוח התאמות על ניגודיות וקלילות באופן אחיד על כל התמונות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בעוד RNAScope יכול להיות מיושם על בעלי חיים בכל גיל, מין, או רקע גנטי, מומלץ לעבוד עם מבוגרים צעירים (<3 חודשים). הסיבה לכך היא כי ממצאים פלואורסצנטיים (למשל, lipofuscin) הם ממצאים נפוצים נוירונים של בעלי חיים מבוגרים41. הגרעינים הקבועים בפורמלין מעכברים מבוגרים מכילים לעתים קרובות פלואורסצנטיות אנדוגנית אינטנסיבית באופן מפתיע, שניתן לטעות בה בקלות בהכתמה אמיתית(איור 1A,B). בכל מקרה, מומלץ לאמת את רמות הפלואורסצנטיות האנדוגנית ברקמה לפני העיבוד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הטכניקה של ISH הומצאה בסוף שנות ה -6042. עם זאת, זה לא עד אמצע שנות השמונים כי זה הוחל על גילוי mRNAs במערכות העצבים המרכזיות והיקפות43,44. בהתחשב בהטרוגניות של מערכת העצבים ובעיות חוזרות ונשנות בנוגדנים, לוקליזציה של תעתיק מסוים ברמה התאית נותרה כלי שלא יסולא בפז. עם זאת, שיטות ISH המסורתיות נותרו מייגעות ורגישות במידה ניכרת. למרבה המזל, מחקר זה השתמש בהליך ISH רגיש מאוד בשם RNAscope, אשר בדרך כלל אינו מייצר רקע ומאפשר זיהוי של מספר תמליל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי נוירואנטומיה / היסתולוגיה / הליבה הזרקת המוח במימון מענק NIH #5P01DK119130-02. המחברים רוצים להכיר בסיוע של UT Southwestern Live Cell Imaging Facility (בראשות ד"ר פלפס) וצוותו (אבהיג'יט באגדה ומרסל מאטלן), הנתמכים בחלקם על ידי מענק NIH #1S10OD021684-01, משאב משותף של מרכז הסרטן הרולד סי סימונס, הנתמך בחלקו על ידי מענק תמיכה במרכז הסרטן של NCI, P30 CA142543.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10x PBSפישר סיינטיפיקBP399-4
20x SSCInvitrogenAM9763-80
° מקפיא CPHCBIMDF-DU901VHA-PA
Adobe Photoshop 2021תוכנת צילום ועיצובAdobe
תנור אפייהתרמו מדעידגם: 658
מיקרוסקופ קונפוקליZeissLSM880 כיסוי Airyscan
זכוכיתמעבדות לחקר המוח2460-1.5D
CryostatLeicaCM 3050 S
Dumont #5 מלקחייםFST11252-20
EcomountBiocare MedicalEM 897Lהרכבה בינונית
HybEZתנור היברידיזציה
עט הידרופובימעבדות וקטורH-4000
ImageJ-FijiNIH
מספריים גדולותהנרי שיין100-7561
צינורות מיקרו צנטריפוגהVWR20170-333
Minipump זרימה משתנהFisher Scientific13-876-1
Opal 520Akoya biosciencesFP1 1487001KTסמן ביולוגי פלואורסצנטי
Opal 570Akoya biosciencesFP1 1488001KTסמן ביולוגי פלואורסצנטי
Opal 690Akoya biosciencesFP1 1497001KTסמן ביולוגי פלואורסצנטי
ProLong זהב מדיום הרכבה Antifade Mountantלתאים עם תווית פלואורסצנטית
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2ACD / Bio-Techne323100ערכת מולטיפלקס
RNAscope עכבר Cck1r-C3ACD / Bio-Techne313751-C3
RNAscope בדיקה עכבר DapBACD / Bio-Techne310043
RNAscope בדיקה עכבר GhsrACD / Bio-Techne
RNAscope בדיקה עכבר Phox2b-C2ACD / Bio-Techne407861-C2
RNAscope בדיקה עכבר Prdm12-C2ACD / Bio-Techne524371-C2
RnaseZapSigmaR2020Rnase תמיסת טיהור
מספריים חיתוך קטנותMillipore SigmaZ265977
Superfrost Plus שקופיותFisherbrand1255015
Tissue Tek OCT בינוניSakura4583
מדריך למשתמשACD323100 USM
Vannas מספריים קפיצייםRobozRS 5620
ZEN Imaging SoftwareZeiss
תנור426141

מקורות

  1. Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system. Autonomic Neuroscience. 85 (1-3), 1-17 (2000).
  2. Kim, S. H., et al. Mapping of sensory nerve subsets within the vagal ganglia and the brainstem using reporter mice for Pirt, TRPV1, 5-HT3, and Tac1 expression. eNeuro. 7 (2), (2020).
  3. Atsumi, K., et al. Sensory neurons in the human jugular ganglion. Tissue and Cell. 64, 101344(2020).
  4. Mazzone, S. B., Undem, B. J. Vagal afferent innervation of the airways in health and disease. Physiological Reviews. 96 (3), 975-1024 (2016).
  5. Wang, F. B., Powley, T. L. Topographic inventories of vagal afferents in gastrointestinal muscle. Journal of Comparative Neurology. 421 (3), 302-324 (2000).
  6. Prechtl, J. C., Powley, T. L. The fiber composition of the abdominal vagus of the rat. Anatomy and Embryology. 181 (2), 101-115 (1990).
  7. Gautron, L., et al. Melanocortin-4 receptor expression in a vago-vagal circuitry involved in postprandial functions. Journal of Comparative Neurology. 518 (1), 6-24 (2010).
  8. Williams, E. K., et al. Sensory neurons that detect stretch and nutrients in the digestive system. Cell. 166 (1), 209-221 (2016).
  9. Chuaychoo, B., Hunter, D. D., Myers, A. C., Kollarik, M., Undem, B. J. Allergen-induced substance P synthesis in large-diameter sensory neurons innervating the lungs. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 116 (2), 325-331 (2005).
  10. Page, A. J., O'Donnell, T. A., Blackshaw, L. A. Opioid modulation of ferret vagal afferent mechanosensitivity. American Journal of Physiology and Gastrointestinal Liver Physiology. 294 (4), 963-970 (2008).
  11. Egerod, K. L., et al. Profiling of G protein-coupled receptors in vagal afferents reveals novel gut-to-brain sensing mechanisms. Molecular Metabolism. 12, 62-75 (2018).
  12. Wang, J., et al. Distinct and common expression of receptors for inflammatory mediators in vagal nodose versus jugular capsaicin-sensitive/TRPV1-positive neurons detected by low input RNA sequencing. PLoS One. 12 (10), 0185985(2017).
  13. Bai, L., et al. Genetic identification of vagal sensory neurons that control feeding. Cell. 179 (5), 1129-1143 (2019).
  14. Kupari, J., Haring, M., Agirre, E., Castelo-Branco, G., Ernfors, P. An atlas of vagal sensory neurons and their molecular specialization. Cell Reports. 27 (8), 2508-2523 (2019).
  15. Bookout, A. L., Gautron, L. Characterization of a cell bridge variant connecting the nodose and superior cervical ganglia in the mouse: Prevalence, anatomical features, and practical implications. Journal of Comparative Neurology. 529 (1), 111-128 (2021).
  16. Gautron, L., Lee, C. E., Lee, S., Elmquist, J. K. Melanocortin-4 receptor expression in different classes of spinal and vagal primary afferent neurons in the mouse. Journal of Comparative Neurology. 520 (17), 3933-3948 (2012).
  17. Broberger, C., Holmberg, K., Kuhar, M. J., Hokfelt, T. Cocaine- and amphetamine-regulated transcript in the rat vagus nerve: A putative mediator of cholecystokinin-induced satiety. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (23), 13506-13511 (1999).
  18. Yamamoto, Y., Henrich, M., Snipes, R. L., Kummer, W. Altered production of nitric oxide and reactive oxygen species in rat nodose ganglion neurons during acute hypoxia. Brain Research. 961 (1), 1-9 (2003).
  19. Grimsey, N. L., et al. Specific detection of CB1 receptors; cannabinoid CB1 receptor antibodies are not all created equal. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 78-86 (2008).
  20. Morozov, Y. M., et al. Antibodies to cannabinoid type 1 receptor co-react with stomatin-like protein 2 in mouse brain mitochondria. European Journal of Neuroscience. 38 (3), 2341-2348 (2013).
  21. Jelsing, J., Larsen, P. J., Vrang, N. Identification of cannabinoid type 1 receptor expressing cocaine amphetamine-regulated transcript neurons in the rat hypothalamus and brainstem using in situ hybridization and immunohistochemistry. Neuroscience. 154 (2), 641-652 (2008).
  22. Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).
  23. Hamdani, N., vander Velden, J. Lack of specificity of antibodies directed against human beta-adrenergic receptors. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 403-407 (2009).
  24. Michel, M. C., Wieland, T., Tsujimoto, G. How reliable are G-protein-coupled receptor antibodies. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 385-388 (2009).
  25. Goodman, S. L. The antibody horror show: an introductory guide for the perplexed. Nature Biotechnology. 45, 9-13 (2018).
  26. Liu, C., et al. PPARgamma in vagal neurons regulates high-fat diet induced thermogenesis. Cell Metabolism. 19 (4), 722-730 (2014).
  27. Zeeni, N., et al. A positive change in energy balance modulates TrkB expression in the hypothalamus and nodose ganglia of rats. Brain Research. 1289, 49-55 (2009).
  28. Kentish, S. J., Frisby, C. L., Kennaway, D. J., Wittert, G. A., Page, A. J. Circadian variation in gastric vagal afferent mechanosensitivity. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19238-19242 (2013).
  29. Peiser, C., et al. Dopamine D2 receptor mRNA expression is increased in the jugular-nodose ganglia of rats with nitrogen dioxide-induced chronic bronchitis. Neuroscience Letters. 465 (2), 143-146 (2009).
  30. Date, Y., et al. The role of the gastric afferent vagal nerve in ghrelin-induced feeding and growth hormone secretion in rats. Gastroenterology. 123 (4), 1120-1128 (2002).
  31. Meleine, M., et al. Ghrelin inhibits autonomic response to gastric distension in rats by acting on vagal pathway. Scientific Reports. 10 (1), 9986(2020).
  32. Zhang, W., et al. Functional interaction between Ghrelin and GLP-1 regulates feeding through the vagal afferent system. Scientific Reports. 10 (1), 18415(2020).
  33. Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal sensory neuron subtypes that differentially control breathing. Cell. 161 (3), 622-633 (2015).
  34. Broberger, C., Holmberg, K., Shi, T. J., Dockray, G., Hokfelt, T. Expression and regulation of cholecystokinin and cholecystokinin receptors in rat nodose and dorsal root ganglia. Brain Research. 903 (1-2), 128-140 (2001).
  35. Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Research. 1319, 60-69 (2010).
  36. Hankin, R. C. In situ hybridization: principles and applications. Laboratory Medicine. 23, 764-770 (1992).
  37. Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature. 521 (7552), 274-276 (2015).
  38. Dagerlind, A., Friberg, K., Bean, A. J., Hokfelt, T. Sensitive mRNA detection using unfixed tissue: combined radioactive and non-radioactive in situ hybridization histochemistry. Histochemistry. 98 (1), 39-49 (1992).
  39. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostic. 14 (1), 22-29 (2012).
  40. Norgren, R., Smith, G. P. A method for selective section of vagal afferent or efferent axons in the rat. American Journal of Physiology. 267 (4), Pt 2 1136-1141 (1994).
  41. Schnell, S. A., Staines, W. A., Wessendorf, M. W. Reduction of lipofuscin-like autofluorescence in fluorescently labeled tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 719-730 (1999).
  42. Pardue, M. L., Gall, J. G. Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 64 (2), 600-604 (1969).
  43. Villar, M. J., et al. Upregulation of nitric oxide synthase and galanin message-associated peptide in hypothalamic magnocellular neurons after hypophysectomy. Immunohistochemical and in situ hybridization studies. Brain Research. 650 (2), 219-228 (1994).
  44. McAllister, L. B., Scheller, R. H., Kandel, E. R., Axel, R. In situ hybridization to study the origin and fate of identified neurons. Science. 222 (4625), 800-808 (1983).
  45. Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. 8 (55), 93392-93403 (2017).
  46. Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
  47. D'Autreaux, F., Coppola, E., Hirsch, M. R., Birchmeier, C., Brunet, J. F. Homeoprotein Phox2b commands a somatic-to-visceral switch in cranial sensory pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20018-20023 (2011).
  48. Staib-Lasarzik, I., et al. Anesthesia for euthanasia influences mRNA expression in healthy mice and after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 31 (19), 1664-1671 (2014).
  49. Avau, B., et al. Ghrelin is involved in the paracrine communication between neurons and glial cells. Neurogastroenterology and Motility. 25 (9), 599-608 (2013).
  50. Settell, M. L., et al. Functional vagotopy in the cervical vagus nerve of the domestic pig: implications for the study of vagus nerve stimulation. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026022(2020).
  51. Nyborg, N. C. B., et al. Cholecystokinin-1 receptor agonist induced pathological findings in the exocrine pancreas of non-human primates. Toxicology and Applied Pharmacology. 399, 115035(2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

GISHRNAscopePhox2b
זיהוי של ביטוי קולטן מצמיד חלבון G בנוירונים Afferent עכבר Vagal באמצעות מולטיפלקס בהכלאה במקום
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.