Method Article

שימוש בתצוגת Phage לפיתוח אפננים משתנים של אוביקוויטין עבור ליגות E3

DOI:

10.3791/62950

⸱

August 27th, 2021

 , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, College of Biological Science, University of Guelph

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בכל מקום הוא שינוי חלבון קריטי לאחר התרגום, dysregulation אשר היה מעורב במחלות אנושיות רבות. פרוטוקול זה מפרט כיצד ניתן להשתמש בתצוגת פאג ' כדי לבודד וריאנטים חדשניים בכל מקום שיכולים לאגד ולווסת את הפעילות של רצועות E3 השולטות על הספציפיות, היעילות והדפוסים של כל מקום.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אוביקיטין הוא חלבון קטן 8.6 kDa המהווה מרכיב הליבה של מערכת ubiquitin-proteasome. כתוצאה מכך, זה יכול להיקשר למגוון רחב של חלבונים עם ספציפיות גבוהה אבל זיקה נמוכה. באמצעות תצוגת פאג', ניתן להנדס גרסאות אוביקוויטין (UbVs) כך שהן מציגות זיקה משופרת לכלוביקוויטין של סוג בר ושומרות על ייחודיות מחייבת לחלבונים ממוקדים. תצוגת Phage משתמשת בספריית phagemid, לפיה חלבון מעיל pIII של בקטריופאג M13 חוטי (נבחר מכיוון שהוא מוצג חיצונית על פני הפאג ') מותך עם UbVs. שאריות ספציפיות של אוביקוויטין wildtype אנושי הם רכים ואקראיים (כלומר, יש הטיה כלפי רצף wildtype מקומי) כדי ליצור UbVs, כך שינויים מזיקים קונפורמציה חלבון נמנעים תוך הצגת המגוון הדרוש לקידום אינטראקציות חדשניות עם חלבון היעד. במהלך תהליך תצוגת הפאג', UbVs אלה באים לידי ביטוי ומוצגים על חלבוני מעיל פאג' ומוצמדים לחלבון בעל עניין. UbVs המציגים אינטראקציות מחייבות חיוביות עם חלבון היעד נשמרים, ואילו קלסרים עניים נשטפים ומוסרים ממאגר הספרייה. ה-UbVs השמורים, המחוברים לחלקיק הפאג' המכיל את הפאגמיד המקביל של ה-UbV, הם מנוטרלים, מוגברים ומרוכזים, כך שניתן יהיה להצמיד אותם לחלבון היעד בסבב נוסף של תצוגת פאג'. בדרך כלל, עד חמישה סיבובים של תצוגת פאג', שבמהלכם מופעל לחץ בחירה חזק על UbVs שנקשרים בצורה חלשה ו/או מופקרת, כך שאלו עם זיקה גבוהה יותר מרוכזים ומועשרים. בסופו של דבר, UbVs המדגימים ספציפיות גבוהה יותר ו/או זיקה לחלבון היעד מאשר עמיתיהם בסוג הבר מבודדים וניתן לאפייןם באמצעות ניסויים נוספים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבנת הפרטים המולקולריים של אינטראקציות חלבון-חלבון היא קריטית לתיווג מנגנוני התמרת האות של תהליכים ביולוגיים, במיוחד אלה התורמים למחלות חשובות מבחינה קלינית. בשנים האחרונות, תצוגת פאג' נוצלה כשיטה מעשית ונגישה לבידוד חלבונים/פפטידים עם קשירה משופרת בהרבה לחלבון היעד הרצוי1,2,3,4, אשר בתורו יכול לשמש כגשושיות תאיות של אינטראקציות חלבון-חלבון.

בכל מקום הוא מפל של פעילויות אנזימטיות (E1 הפעלת אנזים → E2 ההטיה אנזים → E3 ליגות) כי covalenting ubiquitin (Ub) כדי למקד אותם עבור השפלה או לתווך שינויים איתות התא. בנוסף, deubiquitinases לזרז את הסרת אוביקיטין חלבונים. לכן, בתאים, יש אלפי אינטראקציות חלבון תלויות Ub, שרובן המכריע מזהות משטח משותף עם זיקה נמוכה אך ספציפיות גבוהה כדי לאפשר אינטראקציות חלשות דרך משטחים גדולים ומגוונים.

ארנסט ואח ' הציג מוטציות לתוך אזורים מחייבים ידועים של Ub על מנת לראות אם הם יכולים לשפר את הזיקה מחייבת עבור חלבון של עניין תוך שמירה על סלקטיביות גבוהה5. פותחה ספרייה קומבינטורית של יותר מ-10 מיליארד (7.5 x 1010) גרסאות Ub (UbVs) עם מוטציות בעמדות על פני השטח של Ub המתווכות את האינטראקציות הידועות של חלבון Ub. ספרייה זו כללה פאגמידים המבטאים את חלבון מעיל ה-M13 pIII הותוך ל-UbVs מגוונים. לכן, UbVs בודדים ניתן להציג על משטח phage באמצעות חלבון המעיל על הביטוי. במהלך תהליך הבחירה, פאג' המציג UbVs עם אינטראקציות מחייבות ניכרות עם חלבון היעד יישמר ויועשר בסבבים הבאים של תצוגת פאג', בעוד ש-UbVs המציגים UbVs שנקשרים בצורה גרועה לחלבון היעד נשטפים ומוסרים ממאגר הפאג'. חלקיקי הפאג' השמורים מכילים את הפאגמיד המתאים ל-UbV המוצג שלהם, ומאפשרים להם להיות רצפים ומאופיין עוד יותר לאחר בידודם.

באמצעות אסטרטגיה זו הנדסת חלבונים, מעכבי UbV פותחו עבור deubiquitinases אנושי5 ופרוטאזים ויראליים6. חשוב לציין, יצרנו UbVs מעכב עבור 3 רצועות E3 משפחתי HECT אנושי באמצעות חטיפת אתר כריכת E2 והפעלת UbVs שתופסים אקסוסיט מחייב Ub בתחום HECT7. אנחנו יכולים גם לעכב E3s מונומרי RING-המשפחה על ידי מיקוד אתר כריכת E2 ולעורר דימרציה UbV להפעיל הומודימרי RING E3s8. עבור RING E3s מרובת תת-יחידות, UbVs יכולים להשיג עיכוב על-ידי מיקוד של subunit RING (לדוגמה, עבור קומפלקס APC/C9) או שיבוש היווצרות מורכבת (לדוגמה, עבור SCF E3s10). באופן קולקטיבי, ניתן למנף UbVs כדי לחקור באופן שיטתי אינטראקציות חלבון-חלבון במערכת Ub-proteasome (UPS) כדי שנוכל לפענח טוב יותר מנגנונים ביוכימיים של אנזימי UPS ולזהות ולאמת אתרים פונקציונליים להתערבות טיפולית.

הפרוטוקול הבא מתאר כיצד להשתמש בספריית UbV שהוצגה בעבר כדי למקד חלבון מעניין וכיצד להעשיר את קלסרי UbV שמתקשרים עם חלבון היעד באמצעות סיבובים רצופים של תצוגת פאג '.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת ריאגנט

  1. PBS (תמיסת מלח חוצצת פוספט): יש לערבב 50 מ"ל של תמיסת PBS 10x עם 450 מ"ל של H2O אולטרה-סבר. מחטאים לפי סינון ומאחסנים בטמפרטורה של 4 °C (4 °F) או בטמפרטורת החדר (~20-25 °C (20°F).
  2. 10% BSA (אלבומין בסרום בקר): הוסיפו לאט לאט 1 גרם של BSA ל-7 מ"ל של H2O אולטרה-תיבול וערבבו עד להמסה מלאה (ללא גושים). למעלה עם H2O אולטרה-pure עד הנפח הסופי הוא 10 מ"ל. לחטא על ידי סינון ולאחסן ב 4 °C (5 °F).
  3. חוצץ PB (PBS בתוספת 1% BSA): הוסף לאט 5 גרם של BSA ל-400 מ"ל של H2O אולטרה-תיבול ו-50 מ"ל של PBS ומערבבים עד להמסה מלאה (ללא גושים). למעלה עם H2O אולטרה-pure עד הנפח הסופי הוא 500 מ"ל. לחטא על ידי סינון ולאחסן ב 4 °C (5 °F).
  4. חוצץ PBT (PBS בתוספת 1% BSA ו-0.05% Tween 20): הוסיפו באיטיות 5 גרם של BSA ל-400 מ"ל של H2O אולטרה-תיבול ו-50 מ"ל של PBS וערבבו עד להמסה מלאה (ללא גושים). הוסף 250 μL של Tween 20. למעלה עם H2O אולטרה-pure עד הנפח הסופי הוא 500 מ"ל. לחטא על ידי סינון ולאחסן ב 4 °C (5 °F).
  5. חיץ PT (PBS בתוספת 0.05% Tween 20): לערבב 1 מ"ל של טווין 20 עם 400 מ"ל של PBS. למעלה עם H2O אולטרה-אמין עד שהנפח הסופי הוא 2 ליטר. לחטא על ידי סינון ולאחסן בטמפרטורה של 4 °C (5 °F) או בטמפרטורת החדר (~20-25 °C (20 °F).
  6. ציר 2YT: מוסיפים 16 גרם טריפטון, 10 גרם של תמצית שמרים, ו-5 גרם של NaCl עד 800 מ"ל של H2O אולטרה-תיבול ומערבבים עד להמסה מלאה (ללא גושים). למעלה עם H2O אולטרה-אמין עד שהנפח הסופי הוא 1 ליטר. לחטא על ידי autoclaving ולאחסן בטמפרטורת החדר (~ 20-25 °C (25 °F).
  7. צלחות LB/carb: הוסיפו 12.5 גרם לתערובת LB מוכנה מראש ו-7.5 גרם אגר ל-400 מ"ל של H2O. הוסיפו את ה-H2O האולטרה-פרופי עד שהנפח הסופי יהיה 500 מ"ל וחטאו על ידי ריסוק אוטומטי. ודא אגר הוא מומס לחלוטין ולחכות לו להתקרר אל מתחת 60 °C (60 °F). מוסיפים 500 μL של 100 מ"ג קרבניצילין מ"ל, מערבבים היטב ויוצקים לצלחת. יש לאחסן ב-4 °C (75°F).
  8. לוחות LB/tet: הוסיפו 12.5 גרם של תערובת LB מוכנה מראש ו-7.5 גרם אגר ל-400 מ"ל של H2O אולטרה-תפו"א. תוסיפו למעלה H2O אולטרה-תפו"א עד שהנפח הסופי יהיה 500 מ"ל ותחטאו על ידי ריסוק אוטומטי. ודא אגר הוא מומס לחלוטין ולחכות לו להתקרר אל מתחת 60 °C (60 °F). מוסיפים 500 μL של 10 מ"ג טטרציקלין מ"ל, מערבבים היטב ויוצקים לצלחת. יש לאחסן ב-4 °C (75°F).
  9. 20% PEG (פוליאתילן גליקול)/2.5 M NaCl: הוסף 50 גרם של PEG-8000 ו-36.5 גרם של NaCl ל-200 מ"ל של H2O אולטרה-סבר. יש לערבב עד להמסה מלאה.
    הערה: פעולה זו עשויה להימשך זמן מה; חימום יכול לעזור. למעלה עם H2O אולטרה-pure עד הנפח הסופי הוא 250 מ"ל. לחטא על ידי סינון או עבדות אוטומטית.
  10. 0.1 M HCl: לערבב 20 מ"ל של 1 M HCl עם 180 מ"ל של H2O אולטרה-אמין. לחטא על ידי סינון ולאחסן בטמפרטורת החדר (~ 20-25 °C (20 °C (25 °F).
  11. 1 M Tris (pH 11.0): יש להוסיף 6.1 גרם בסיס טריס ל-40 מ"ל של H2O אולטרה-תיבול. כווננו את רמת ה-pH ל-11.0 עם HCl וערבבו עד שטריס יתמוסס לחלוטין. למעלה עם H2O אולטרה-pure עד הנפח הסופי הוא 50 מ"ל. לחטא על ידי סינון ולאחסן בטמפרטורת החדר (~ 20-25 °C (20 °F).
  12. 100 מ"ג/מ"ל (1000x) קרבניצילין: יש להוסיף 2 גרם של מלח דיסודיום קרבניצילין ל-20 מ"ל של H2O אולטרה-תערובת. יש לערבב עד להמסה מלאה. לחטא על ידי סינון ולאחסן ב -20 °C (70 °F).
  13. 50 מ"ג/מ"ל (1000x) קנאמיצין: הוסיפו 1 גרם של קנאמיצין סולפט ל-20 מ"ל של H2O אולטרה-פרופ. מערבבים עד להמסה מלאה. לחטא על ידי סינון ולאחסן ב -20 °C (70 °F).
  14. 10 מ"ג/מ"ל (1000x) טטרציקלין: הוסיפו 0.2 גרם טטרציקלין הידרוכלוריד ל-20 מ"ל של 70% אתנול. מערבבים עד להמסה מלאה. לחטא על ידי סינון ולאחסן ב -20 °C (70 °F).

2. הכנת חלבונים

  1. לקבוע את הריכוז של מלאי חלבון היעד ב- μM. הדרך הנוחה ביותר להעריך ריכוז חלבון היא למדוד את הספיגה של מלאי החלבון ב 280 ננומטר. אם הריכוז ידוע mg/mL, להמיר אותו μM באמצעות המשקל המולקולרי של חלבון היעד. מגוון שיטות ניתן להשתמש בהתאם לחלבון של עניין; עיין בסעיף דיון לקבלת פרטים.
    הערה: אם החלבון נחתך (תחום חלבון ספציפי / מוטיב) או מתויג, זכור להסביר את השינויים האלה במשקל מולקולרי בעת המרה מ mg/mL ל- μM.
  2. הכן שלושה צינורות microcentrifuge שכותרתו "סיבוב 1", "עגול 2/3", ו "עגול 4/5".
    1. חשב את נפח החלבון הדרוש כדי לדלל אותו ל 1 μM ב 800 μL PBS aliquot נפח זה לתוך הצינורות מבלי להוסיף PBS.
      הערה: אם כמות חלבון היעד הזמינה נמוכה, ניתן להוריד את הריכוז ל- 0.25 מיקרומטר.

3. הכנה לסיבוב הראשון של הבחירה

  1. הכן תרבות זרעים לפולחן קלט הפאג ' לסיבוב השני של הבחירה.
    1. לחסן 5 מ"ל של 2YT / tet עם מושבת קולי Escherichia מבודדת היטב ודגורה לילה ב 37 °C (55 °F) עם 200 סל"ד רעד מסלולי.
  2. מצפים את הצלחת לסיבוב הבחירה הראשון.
    1. לדלל את חלבון היעד בצינור "עגול 1" עם הכמות המתאימה של PBS aliquot 100 μL לתוך שמונה בארות של צלחת כריכה 96 היטב (כלומר, צלחת היעד).
      הערה: תצוגת פאג' יכולה להיעשות עבור ארבעה חלבונים שונים בו זמנית על צלחת אחת על ידי ציפוי בארות בפינות הצלחת.
    2. שליטה אופציונלית: אם חלבון היעד מתויג, כגון עם GST או MBP (חלבון מחייב מלטוז), יש לכסות שמונה בארות בצלחת כריכה נוספת של 96 באר עם 100 μL של תמיסת 1 מיקרומטר המכילה את תג האפיטופ המתאים. פעולה זו תשמש להסרת פאג' לא רצוי שנקשר לתג באופן לא ספציפי.
    3. לנער את הלוחות בלילה ב 4 °C (75 °F) עם 200 סל"ד רעד מסלולית.

4. סיבוב אחד של בחירה

  1. הכן את הקלט השני העגול.
    1. לחסן 30 מ"ל של 2YT / tet עם 200 μL של תרבות הזרעים בשלב 3.1.
    2. דגירה ב 37 °C (37 °F) עם 200 סל"ד רעד מסלולית עד החיידקים נמצאים בשלב אמצע היומן (OD600figure-protocol-1 0.6 - 0.8). זה לוקח בערך שלוש שעות.
  2. לחסום את לוחית המטרה.
    1. הסר את פתרון הציפוי מהצלחת, או את שתי הצלחות אם צלחת בקרה נעשתה, על ידי היפוך ורעד מעל כיור. ייבשו את הטפיחות על מגבות נייר.
    2. הוסף 300 μL של חוצץ PB לכל באר מצופה.
    3. הסר את מאגר PB כמו בשלב 4.2.1 והוסף עוד 200 μL של מאגר PB.
    4. דגירה בטמפרטורת החדר (~ 20-25 °C (20 °F) עבור 1 שעה עם 300 סל"ד רעד מסלולית.
  3. הכן ספריית פאג'.
    1. להפשיר את ספריית הפאג ' על הקרח ותדלל אותה עד פי 100 מהמגוון בספרייה ב- PBS. לדוגמה, אם מגוון הספרייה הוא 1 x 1010 וריכוז הספרייה הוא 1 x 1013, לדלל את הספרייה כך הריכוז הוא 1 x 1012. עבור הספריות המשמשות כאן, לדלל אותם פי 10 PBS על ידי שילוב 1 מ"ל של הספרייה עם 9 מ"ל של PBS.
      הערה: גיוון הספרייה היה צריך להיקבע במהלך יצירת הספריה ולא ניתן להעריך אותו בקלות אחרת. ריכוז הספרייה יכול להיקבע על ידי חנק תאי E. coli בשלב אמצע יומן (OD600figure-protocol-2 0.6 - 0.8) ו ציפוי על LB / פחמימות.
    2. הוסף 1/5 נפח של PEG /NaCl. לדוגמה, עבור 10 מ"ל מהספריה מדוללת בעבר, הוסף 2 מ"ל של PEG/NaCl.
    3. דגירה על קרח במשך 30 דקות.
    4. צנטריפוגה ב 11,000 x g במשך 30 דקות ב 4 °C (70 °F), להשליך supernatant, ולאחר מכן ל-2 דקות כדי למשוך את הסופר-טבעי הנותר.
      הערה: שים את הצינור ברוטור באותו כיוון בפעם השנייה כפי שהיה הראשון לשמור על הכדור באותו מקום, ולכן, מה שהופך אותו קל יותר לראות.
    5. יש להצמיד בעדינות את גלולה הפאג' ל-1 מ"ל של PBT לחלבון. עבור ארבעה חלבונים, resuspend הכדור ב 4 מ"ל של PBT.
      הערה: נסה לא לגעת בכדור ולא להציג בועות אוויר.
  4. הצג פאג' לחלבוני היעד.
    1. בקרה אופציונלית: הוסף 100 μL של ספריית פאג' לכל באר מצופה בלוח הבקרה. דגירה בטמפרטורת החדר (~ 20-25 °C (20 °F) עבור 1 שעה עם 300 סל"ד רעד מסלולי ולהעביר את הספרייה מצלחת הבקרה ללוח היעד. דלג על שלב 4.4.2.
    2. הסר את מאגר PB מצלחת היעד כמו בשלב 4.2.1 והוסף 100 μL של ספריית הפאג 'לכל באר מצופה.
    3. דגירה בטמפרטורת החדר (~ 20-25 °C (20 °F) עבור 1 שעה עם 300 סל"ד רעד מסלולית.
  5. תתחמקי בסיבוב הראשון.
    1. הסר ספריית פאג ' ולשטוף את בארות מצופות ארבע פעמים עם חוצץ PT. הפוך את הצלחת והקש על מגבת נייר כדי להסיר את הטיפות האחרונות.
      הערה: אם חלבוני יעד מרובים מצופים על צלחת אחת, נסה למזער את הזרימה של כל הפתרונות הבאים בין הבארות.
    2. הוסיפו 100 מיקרו-אל של 0.1 מ' HCl לכל באר מצופה ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות עם רעידות מסלוליות של 300 סל"ד.
    3. לנטרל את ה- pH על ידי הוספת 12.5 μL של 1 M Tris-HCl (pH 11) לכל באר מצופה.
    4. בריכה את הפאג ' הנלהב מכל 8 בארות לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה יחיד 1.5 מ"ל. פיפטה למעלה ולמטה במהלך ההעברה כדי להפוך פתרונות הומוגניים ושאיפה כל נוזל מן בארות.
    5. הוסף 10% BSA ל phage eluted מאוחסן לריכוז סופי של 1%. עבור נפח elution עגול אחד טיפוסי של 950 μL, להוסיף 95 μL של 10% BSA. יש לאחסן ב-4 °C (75°F). זהו הפלט העגול הראשון.

5. הכנה לסיבובי הבחירה הבאים

  1. הכן תרבות זרעים לפולחן קלט הפאג' לסיבוב הבחירה הבא כמו בשלב 3.1.
  2. מצפים את הצלחת לסיבוב הבחירה השלישי כמו בשלב 3.2 עם השינויים שצוינו להלן.
    1. יש לכסות רק ארבע בארות לחלבון בצלחת כריכה של 96 באר. השתמש במחצית התוכן של "עגול 2/3" או "עגול 4/5" צינורות לסיבוב המתאים. לדלל את התוכן של צינורות אלה לפי הצורך, על מנת למנוע חלבונים להתיישב מחוץ לפתרון.
  3. הכן את קלט הפאג' לסיבוב הבחירה הבא.
    1. השתמש במחצית מהפלט העגול אחד משלב 4.5.5 כדי לחסן 3 מ"ל של תאי פאזה באמצע יומן הרישום משלב 4.1. עבור פלט סיבוב אחד טיפוסי, לחסן עם 500 μL של הפלט.
    2. דגירה ב 37 °C (30 °F) במשך 30 דקות עם 200 סל"ד רעד מסלולית.
    3. הוסף M13K07 עוזר פאג לריכוז סופי של 1 x 1010 PFU / mL.
    4. דגירה ב 37 °C (50 °F) עבור 1 שעה עם 200 סל"ד רעד מסלולית.
    5. העבר את כל 3 מ"ל של תרבות ל 30 מ"ל של 2YT / פחמימות / kan. לגדול לילה ב 37 °C (50 °F) עם 200 סל"ד רעד מסלולית.
    6. למחרת, להעביר את התרבות לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ"ל צנטריפוגה בצנטריפוגה ב 11,000 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (70 °F) כדי לזרז תאים.
    7. תקעו את הסופרנט לצינור צנטריפוגה חדש של 50 מ"ל וערבבו עם 8 מ"ל של PEG/NaCl ודגרה על קרח במשך 10 דקות.
    8. צנטריפוגה ב 11,000 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (60 °F), להשליך את supernatant, וצנטריפוגה שוב במשך 2 דקות.
      הערה: שים את הצינור ברוטור באותו כיוון בפעם השנייה כפי שהיה הראשון לשמור על הכדור באותו מקום, ולכן, מה שהופך אותו קל יותר לראות.
    9. Resuspend גלולה פאג ב 800 μL של PBT, כך שהוא הומוגני לחלוטין ולא גושים נראים.
    10. העבר את פתרון הפאג ' לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל וצנטריפוגה ב 16,200 x גרם במשך 4 דקות ב 4 °C לפסולת גלולה.
    11. העבר את supernatant לצינור microcentrifuge חדש. זהו הקלט לסיבוב הבחירה הבא.
  4. אופציונלי: Titer פתרונות הקלט והפלט.
    1. השתמש 500 μL של תרבות זרעי E. coli כדי לחסן 5 מ"ל של 2YT / tet ודגרה ב 37 °C (500 סל"ד רעד מסלולית עד חיידקים הוא בשלב אמצע היומן (OD600figure-protocol-3 0.6 - 0.8). זה לוקח בערך שעה.
    2. לדלל פתרונות קלט / פלט פאג '10-3 - 10-5 ב- PBS ולהוסיף 10 μL של כל דילול ל 90 μL של תאים בתרבית.
      הערה: השתמש בפתרונות פאג' מדוללים מיד מכיוון שפאג' יספוג לצינור לאורך זמן, ושינויים עשויים לייצר תשלילים כוזבים.
    3. דגירה ב 37 °C (50 °F) במשך 20 דקות עם 200 סל"ד רעד מסלולית.
    4. צלחת 5 μL על צלחות נפרדות LB / פחמימות.
      הערה: כמות מצופה משתנה תלויה בתוצאות קודמות/העדפה אישית.

6. סבבי הבחירה הבאים

  1. בצע את כל הסיבובים הבאים יחד עם ההכנה כפי שנעשה בשלבים 3 ו -4, בהתאמה, עם הבדלים שצוינו להלן.
    1. השתמש בקלט שהופק בסיבוב הקודם כמקור הפאג' במקום כספרייה. מעיל 4 בארות לכל חלבון יעד עם 100 μL של קלט פאג 'שנרכש מהסיבוב הקודם. יש לאחסן את תשומות הפאג' הנותרות ב-4 °C (70 °F).
    2. הפוך את שלב הכביסה ב 4.5.1 מחמיר יותר עם כל סיבוב של בחירה. סיבוב ראשון דורש כביסה 4 פעמים, סיבוב שני דורש 6 פעמים, סיבוב שלישי דורש 8 פעמים, וסבבים ארבע וחמש שניהם דורשים כביסה 10 פעמים.
    3. הפחיתו נפחים מסוימים בהשוואה לאלו המשמשים בסיבוב הראשון מכיוון שהכדורים הבאים מצפים רק ארבע בארות במקום שמונה. לדוגמה, בשלב 4.5.5 רק 45 μL של 10% BSA מתווסף לפלט הפאג ', ובצעד 5.3.1 רק 250 μL של פלט הפאג משמש לחסן תאים.

7. לאחר עיבוד בחירה ובידוד פאג'

  1. Titer פתרונות הקלט והפלט לסיבובים 4 ו -5.
    1. אם לא נעשה כבר בשלב 5.4, בצע את אותם שלבים כדי titer סיבובים ארבע וחמש יציאות פאג ', באופן אידיאלי לייצר מגוון של 30-300 מושבות על פני כמה לוחות.
  2. תרבות ולבודד פאג'.
    1. Aliquot 450 μL של 2YT / פחמימות / M13K07 לתוך כל שפופרת של תיבת תרבות צינור מיני 96.
    2. בחר מושבות מבודדות היטב מכל אחת מהצלחות החל בשלב 7.1 כדי לחסן כל צינור.
      הערה: השתמש במחצית העליונה של התיבה עבור יציאות עגולות ארבע ואת החצי התחתון עבור חמש יציאות עגולות.
    3. דגירה לילה ב 37 °C (50 °F) עם 200 סל"ד רעד מסלולית.
    4. צנטריפוגה ב 1,200 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (70 °F).
    5. העבר כמה שיותר supernatant לתיבת תרבות צינור 96 מיני חדשה מבלי להפריע לכדור התא ולהשליך את הישן. יש לאחסן ב-4 °C (75°F).
    6. מהקופסה החדשה, להעביר 100 μL מכל צינור ללוח 96 היטב לא מחייב המכיל 100 μL של 50% גליסול בכל בארות. מערבבים היטב ומאחסנים ב -80 מעלות צלזיוס כמלאי גיבוי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קלסרים המיוצרים מתצוגת פאג' ניתנים לאימות וניתוח בדרכים רבות. מומלץ תחילה להמשיך ברצף הפאג' בפריימרים המאגפים את התוספת המגוונת בספריית הפאגמיד. ניסוי אידיאלי בתצוגת פאג' יציג הטיה ברורה כלפי מספר רצפים (איור 1). רצפים אחרים יהיו גם נוכחים אך עם ספירה נמוכה יותר, המופיעים יותר כרעש רקע. בדוגמה שסופקה, כאשר תצוגת פאג' בוצעה בין גרסאות אוביקוויטין (UbVs) ו- UBE4B של סוג בר, יש הטיה מסוימת כלפי רצפים #1-4. קובץ Script לדוגמה של Python לארגון וניתוח קבצי רצף סופק ("phageDisplaySeqAnalysis.py"). ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כפי שצוין בשלב 2.1 (הכנת חלבון), ניתן להשתמש במגוון שיטות להערכת ריכוז החלבון, ולכל אחת מהן יהיו יתרונות וחסרונות ייחודיים המבוססים על חלבון היעד הספציפי המשמש לתצוגת פאג'. בעבר סופק מקור לתיאורים ופרוטוקולים מפורטים עבור שיטות פופולריות.

השימוש בפאג' שנשמר על ידי סיבוב קודם של תצוגת פאג' כאשר הקלט לסיבוב הבא מעשיר את הקלסרים הטובים על ידי הסרה הדרגתית של קלסרים שנקשרו בצורה חלשה, ארעית או במקרה. בסיבובים 4 ו-5 תהיה באופן אידיאלי הטיה ברורה כלפי קבוצה קטנה וספציפית של ר...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אינם מצהירים על ניגוד אינטרסים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכנולוגיית וריאנט אוביקוויטין הומצאה במעבדה של ד"ר סצ'דב סידו (אוניברסיטת טורונטו). WZ הוא כיום חוקרת גלובלית של CIFAR עזריאלי בתוכנית בני האדם והמיקרוביום. מחקר זה מומן על ידי מענקי דיסקברי NSERC שהוענקו ל- WZ (RGPIN-2019-05721).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
מערכת צינורות מיני Axygen (0.65 מ"ל, סטרילית, 96/מתלה, 10 מתלים/חבילה)Fisher Scientific14-222-198גידול יציאות פאג'ים לאחר תצוגת פאג'ים.
BD Difco מדיה לתרבית מיובשת: מרק LB, מילר (לוריא-ברטני)פישר סיינטיפיקDF0446-17-3הכנת צלחות לטיטרציה.
אלבומין סרום בקר (BSA),רכיב מאגרBioShop CanadaALB001
מלח דיסודיום קרבניצילין 89.0-100.5% נטול מיםMillipore-SigmaC1389-5Gתרבית תאים נגועים בפאגמיד.
שייקר מיקרופלייט דיגיטלי קומפקטיפישר סיינטיפיק11-676-337טלטול צלחות במהלך הדגירה עם ספריית הפאג'ים.
סרט איטום אלומיניום קורנינג מיקרופלייטפישר סיינטיפיק07-200-684איטום מלאי גליצרול פאג'ים.
פישרמיובשDF0140-01-0הכנת צלחות לטיטרציה.
DS-11 ספקטרופוטומטר/פלואורומטרDeNovixDS-11 FX+מדידת ריכוז חלבון.
Greiner Bio-One CellStar 96-well, ללא טיפול, בצורת U-Bottom MicroplateFisher Scientific7000133אחסון מלאי גליצרול פאג'ים.
חומצה הידרוכלוריתפישר מדעיA144-500פליטת פאג'ים.
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R מוכשר כימית E. coliFisher ScientificC854003זן חיידקי לזיהום בפאג'ים.
Kanamycin SulfateFisher ScientificAAJ1792406Culturing M13K07 עוזר תאים נגועים בפאג'ים.
M13KO7 עוזר פאגניו אינגלנד Biolabs  N0315Sהיתר אריזה והפרשה של פגמיד.
MaxQ 4000 שייקר אורביטלי ספסלפישר סיינטיפיק11-676-076תרבית תאי חיידקים.
Nunc MaxiSorp 96 באר מיקרופלייט, תחתית שטוחהLife Technologies44-2404-21חלבונים משתקעים.
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) 10X תמיסתפישר סיינטיפיקBP3994רכיב חיץ/מדיום השעיית פאג'ים.
סרטי פוליאסטר ל-ELISA ודגירהVWR60941-120כיסוי המיקרו-לוחות במהלך הדגירה.
פוליאתילן גליקול 8000 (PEG)Fisher ScientificBP233-1משקעי פאג'ים.
נתרן כלוריMillipore-SigmaS3014משקעי פאג'ים.
צינורות תרבית פלסטיק סטריליים: פוליפרופילן פישר פישר שקוף14-956-1Dתשומות פאג'ים תרבותיות.
טטרציקלין הידרוכלורידפישר מדעיBP912-100תרבית E. coli תאי OmniMax.
Tris BaseFisher ScientificBP1525תמיסת פאג'ים מנטרלת.
אבקת טריפטוןפישר סיינטיפיקBP1421-2רכיב אמצעי גידול תאים.
Tween 20Fisher ScientificBP337500רכיב Buffer
תמצית שמריםפישר מדעיBP1422-2רכיב מדיה לגידול תאים.
Fraction V .אגר מדעי ' .

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Karlsson, O. A., et al. Design of a PDZbody, a bivalent binder of the E6 protein from human papillomavirus. Scientific Reports. 5 (1), 9382(2015).
  2. Veggiani, G., et al. Engineered SH2 domains with tailored specificities and enhanced affinities for phosphoproteome analysis. Protein Science. 28 (2), 403-413 (2019).
  3. Kaneko, T., et al. Superbinder SH2 domains act as antagonists of cell signaling. Science Signaling. 5 (243), (2012).
  4. Wiechmann, S., et al. Site-specific inhibition of the small ubiquitin-like modifier (SUMO)-conjugating enzyme Ubc9 selectively impairs SUMO chain formation. Journal of Biological Chemistry. 292 (37), 15340-15351 (2017).
  5. Ernst, A., et al. A strategy for modulation of enzymes in the ubiquitin system. Science. 339 (6119), 590-595 (2013).
  6. Zhang, W., et al. Potent and selective inhibition of pathogenic viruses by engineered ubiquitin variants. PLOS Pathogens. 13 (5), 1006372(2017).
  7. Zhang, W., et al. System-wide modulation of HECT E3 ligases with selective ubiquitin variant probes. Molecular Cell. 62 (1), 121-136 (2016).
  8. Gabrielsen, M., et al. A general strategy for discovery of inhibitors and activators of RING and U-box E3 ligases with ubiquitin variants. Molecular Cell. 68 (2), 456-470 (2017).
  9. Brown, N. G., et al. Dual RING E3 architectures regulate multiubiquitination and ubiquitin chain elongation by APC/C. Cell. 165 (6), 1440-1453 (2016).
  10. Gorelik, M., et al. Inhibition of SCF ubiquitin ligases by engineered ubiquitin variants that target the Cul1 binding site on the Skp1-F-box interface. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (13), 3527-3532 (2016).
  11. Goldring, J. P. D. Protein quantification methods to determine protein concentration prior to electrophoresis. Protein Electrophoresis. 869, 29-35 (2012).
  12. Zhang, W., Sidhu, S. S. Generating intracellular modulators of E3 ligases and deubiquitinases from phage-displayed ubiquitin variant libraries. The Ubiquitin Proteasome System: Methods and Protocols. 1844, 101-119 (2018).
  13. Sheehan, J., Marasco, W. A. Phage and yeast display. Microbiology Spectrum. 3 (1), 1-17 (2015).
  14. Lowman, H. B., Wells, J. A. Monovalent phage display: A method for selecting variant proteins from random libraries. Methods. 3 (3), 205-216 (1991).
  15. Lowman, H. B., Bass, S. H., Simpson, N., Wells, J. A. Selecting high-affinity binding proteins by monovalent phage display. Biochemistry. 30 (45), 1-7 (1991).
  16. Beaber, J. W., Tam, E. M., Lao, L. S., Rondon, I. J. A new helper phage for improved monovalent display of Fab molecules. Journal of Immunological Methods. 376 (1-2), 46-54 (2012).
  17. Galán, A., et al. Library-based display technologies: where do we stand. Molecular BioSystems. 12 (8), 2342-2358 (2016).
  18. Huang, S., et al. Ribosome display and selection of single-chain variable fragments effectively inhibit growth and progression of microspheres in vitro and in vivo. Cancer Science. 109 (5), 1503-1512 (2018).
  19. Yamaguchi, J., et al. cDNA display: a novel screening method for functional disulfide-rich peptides by solid-phase synthesis and stabilization of mRNA-protein fusions. Nucleic Acids Research. 37 (16), 1-13 (2009).
  20. Mochizuki, Y., Kumachi, S., Nishigaki, K., Nemoto, N. Increasing the library size in cDNA display by optimizing purification procedures. Biological Procedures Online. 15 (1), 1-5 (2013).
  21. Odegrip, R., et al. CIS display: In vitro selection of peptides from libraries of protein-DNA complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (9), 2806-2810 (2004).
  22. Reiersen, H., et al. Covalent antibody display--an in vitro antibody-DNA library selection system. Nucleic Acids Research. 33 (1), 1-9 (2005).
  23. Houlihan, G., Gatti-Lafranconi, P., Lowe, D., Hollfelder, F. Directed evolution of anti-HER2 DARPins by SNAP display reveals stability/function trade-offs in the selection process. Protein Engineering Design and Selection. 28 (9), 269-279 (2015).
  24. Zhang, W., et al. Generation and validation of intracellular ubiquitin variant inhibitors for USP7 and USP10. Journal of Molecular Biology. 429 (22), 3546-3560 (2017).
  25. Teyra, J., et al. Structural and functional characterization of ubiquitin variant inhibitors of USP15. Structure. 27 (4), 590-605 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Phage DisplayUbiquitin VariantsE3 LigasesProtein ModulatorsBinding AffinityProtein EngineeringEnzyme Linked ImmunosorbentELISA AssayProtein Protein InteractionLibrary Screening

Related Articles