מאמר שיטה

ניתוח ציטומטרי זרימה לזיהוי תאי החיסון המולדים והמסתגלים של ריאות מורין

DOI:

10.3791/62985

⸱

16 בנובמבר 2021

 ,  ,  ,  , 
1Division of Hematology-Oncology, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 2Department of Medicine, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 3Harvard College

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול יעיל וניתן לשחזור כדי לבודד את האוכלוסיות החיסוניות של מערכת הנשימה murine. אנו מספקים גם שיטה לזיהוי של כל תאי החיסון המולדים והמסתגלים השוכנים בריאות של עכברים בריאים, באמצעות לוח ציטומטריית זרימה מבוסס 9 צבעים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת הנשימה נמצאת במגע ישיר עם הסביבה החיצונית ודורשת מערכת חיסונית מוסדרת במדויק כדי לספק הגנה תוך דיכוי תגובות לא רצויות לאנטיגנים סביבתיים. הריאות מארחות מספר אוכלוסיות של תאי חיסון מולדים ומסתגלים המספקים מעקב חיסוני אך גם מתווכים בתגובות חיסוניות מגנות. תאים אלה, השומרים על איזון מערכת החיסון הריאתית הבריאה, משתתפים גם במספר מצבים פתולוגיים כגון אסתמה, זיהומים, מחלות אוטואימוניות וסרטן. ביטוי סלקטיבי של חלבונים פנימיים ותאיים מספק תכונות חיסוניות ייחודיות לתאי החיסון של הריאה. כתוצאה מכך, לציטומטריית זרימה יש תפקיד אינסטרומנטלי בזיהוי אוכלוסיות תאים כאלה במהלך מצב יציב ותנאים פתולוגיים. מאמר זה מציג פרוטוקול המתאר שיטה עקבית וניתנת לשחזור לזיהוי תאי החיסון השוכנים בריאות של עכברים בריאים בתנאים יציבים. עם זאת, פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לזהות שינויים באוכלוסיות תאים אלה במודלים שונים של מחלות כדי לסייע בזיהוי שינויים ספציפיים למחלות בנוף מערכת החיסון של הריאות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דרכי הנשימה של מורין מכילות מערכת חיסונית ייחודית האחראית למלחמה בפתוגנים ולשמירה על הומאוסטזיס חיסוני. מערכת החיסון הריאתית מורכבת מאוכלוסיות תאיות עם הטרוגניות משמעותית בפנוטיפ, בתפקוד, במקור ובמיקום שלהן. מקרופאגים מכתשיים מקומיים (AMs), שמקורם בעיקר במונוציטים עובריים, שוכנים בלומן מכתשי1, בעוד שמקרופגים ביניים (IMs) שמקורם במח העצם שוכנים בפרנצ'ימה הריאה2. הודעות מיידיות יכולות להיות מסווגות עוד יותר על-ידי הביטוי של CD206. CD206+ IMs מאכלסים את אזור הפריברונכיאל והפריקולרי, בעוד ש- CD206- IMs ממוקמים באינטרסטיטיום מכתשי3. כמה מחלקות משנה של הודעות מיידיות הוצעו לאחרונה3,4,5,6. למרות IMs נחקרים פחות מאשר AMs, ראיות אחרונות תומכות בתפקיד המכריע שלהם בוויסות המערכת החיסונית של הריאה7. בנוסף, CD206 מתבטא גם ב- AMs8 המופעלים באופן חלופי.

תאי דנדריטי ריאתי (DCs) הם קבוצה הטרוגנית נוספת של תאי מערכת החיסון של הריאות ביחס למאפיינים התפקודיים שלהם, מיקומם ומוצאם. ארבע קטגוריות משנה של DCs תוארו בריאה: CD103 + DCs קונבנציונליים (הידועים גם בשם cDC1), CD11b + DCs קונבנציונליים (הידועים גם בשם cDC2), בקרי DC (MoDCs) שמקורם במונוציטים ו- DC של פלסמציטויד9,10,11,12,13. ניתן להגדיר את שלוש מחלקות המשנה הראשונות כתרכובת היסטו-תאימות מרכזית (MHC) II +CD11c+9,10,14,15. מחשבי DCs פלזמה מבטאים MHC II והם חיוביים באופן ביניים עבור CD11c אך מבטאים רמות גבוהות של B220 ו- PDCA-19,13,16. בריאות מורין נאיביות, CD103 DCs ו- CD11b DCs ממוקמים interstitium דרכי הנשימה, בעוד DCs plasmacytoid ממוקמים interstitium מכתשי17.

שתי אוכלוסיות עיקריות של מונוציטים שוכנות בריאה במצב יציב: מונוציטים קלאסיים ומונוציטים לא קלאסיים. מונוציטים קלאסיים הם Ly6C+ והם קריטיים לתגובה הדלקתית הראשונית. לעומת זאת, מונוציטים לא קלאסיים הם Ly6C- והם נתפסו באופן נרחב כתאים אנטי דלקתיים3,16,18. לאחרונה תוארה אוכלוסייה נוספת של מונוציטים CD64+CD16.2+CD16.2+, שמקורם ב- Ly6C- מונוציטים ומעוררים CD206 + IMs3.

אאוזינופילים מופיעים בעיקר בריאות במהלך זיהום הלמינת או תנאים אלרגיים. עם זאת, יש מספר קטן של אאוזינופילים בפרנצ'ימה ריאתית במהלך מצב יציב, המכונה אאוזינופילים תושב. בניגוד לאאוזינופילים המקומיים, אאוזינופילים דלקתיים נמצאים באינטרסטיטיום הריאות ובשטיפה סימפונלבולרית (BAL). במודלים של עכבר של קרדית אבק הבית (HDM), אאוזינופילים דלקתיים מגויסים לריאה לאחר גירוי בתיווך אנטיגן. הוצע כי אאוזינופילים תושב עשוי להיות תפקיד רגולטורי באלרגיה על ידי עיכוב T helper 2 (Th2) רגישות HDM19.

בניגוד לשאר תאי המיאלואידים הריאתיים, נויטרופילים מבטאים Ly6G אך לא CD68 ומאופיינים בחתימה של ה- CD68-Ly6G + אימונופנוטיפ16,20,21. מחקרי הדמיה הראו כי במהלך מצב יציב, הריאה שומרת מאגר של נויטרופילים בתא התוך וסקולרי ומארחת מספר ניכר של נויטרופילים חוץ וסקולריים22. בדומה לאאוזינופילים, נויטרופילים אינם נמצאים ב- BAL במצב יציב; עם זאת, מספר צורות של גירוי חיסוני, כגון אתגר LPS, אסטמה, או דלקת ריאות, לנהוג נויטרופילים לתוך לומן מכתשי, וכתוצאה מכך נוכחותם BAL21,22,23.

מספר משמעותי של תאי CD45+ של הריאה מייצגים רוצח טבעי (NK), תאי T ותאי B והם שליליים עבור רוב סמני המיאלואידים24. בריאות של עכברים נאיביים, ניתן לזהות את שלושת סוגי התאים האלה בהתבסס על הביטוי של CD11b ו- MHC II18. כ-25% מתאי CD45+ הריאתיים הם תאי B, בעוד שאחוז תאי ה-NK גבוה יותר בריאה מאשר רקמות לימפואידיות ולא לימפואידיות אחרות24,25,26. בקרב תאי T ריאתיים, שבר ניכר הוא CD4-CD8- וממלא תפקיד חשוב בזיהומים בדרכי הנשימה26.

מכיוון שהריאה מארחת מערכת חיסונית מורכבת וייחודית מאוד, פותחו מספר אסטרטגיות gating לזיהוי תאי מערכת החיסון של הריאות ודווחו על 16,18,20,27. אסטרטגיית ההמצאה המתוארת במסמך זה מספקת דרך מקיפה וניתנת לשחזור לזהות עד 12 אוכלוסיות מיאלואידיות ריאתיות שונות ומערכת חיסונית לא מיאלואידית באמצעות 9 סמנים. סמנים נוספים שימשו לאימות התוצאות. יתר על כן, שיטה מפורטת מסופקת להכנת השעיה של תא יחיד הממזערת את מוות התאים ומאפשרת זיהוי של הפרופיל השלם ביותר של תא התא החיסוני של הריאה. יש לציין כי זיהוי של תאים שאינם חיסוניים של הריאה, כגון תאי אפיתל (CD45-CD326 +CD31-), תאי אנדותל (CD45-CD326-CD31+), ופיברובלסטים דורש גישה שונה 28,29. זיהוי אוכלוסיות כאלה אינו כלול בפרוטוקול ובשיטה המתוארים כאן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל המחקרים והניסויים המתוארים בפרוטוקול זה נערכו תחת הנחיות על פי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) של המרכז הרפואי בית ישראל דיקונס. עכברי C57BL/6 בני שישה עד עשרה שבועות משני המינים שימשו לפיתוח פרוטוקול זה.

1. כריתה כירורגית והכנת רקמות

  1. המתת חסד לעכבר על ידי הזרקה תוך-אפריקאית של 1 מ"ל של tribromoethanol (מוכן על פי פרוטוקול סטנדרטי; טבלת חומרים).
    הערה: יש להימנע מחנק CO2 במחקרי ריאות מכיוון שהוא עלול לגרום לפגיעה בריאה ולשנות את התכונות והמאפיינים של תאי מערכת החיסון של הריאות. יש להימנע גם מפריקת צוואר הרחם מכיוון שהיא עלולה לגרום לפגיעה מכנית בריאה.
  2. מעבירים את העכבר לאזור נקי וייעודי לניתוח.
  3. לייצב את הצד הגבי של העכבר כלפי מטה באמצעות מחטים או סרט הדבקה על ארבע הגפיים. השתמש 70% אתנול כדי לחטא את העור של אזור הגחון.
  4. בצע חתך בעור, מהצוואר ועד הבטן. הסר בזהירות את העור מאזור בית החזה.
  5. הסר בזהירות את עצם החזה והצלעות.
  6. לשטוף את הריאות על ידי הזרקת 10 מ"ל של PBS קר ישירות בחדר הימני, באמצעות מחט 18-21 G, עד הריאות להיות לבן לחלוטין.
  7. בזהירות להסיר את התימוס והלב מבלי לגעת בריאות.
  8. נתק בעדינות את הריאות מהרקמות שמסביב והעבר אותן לצינור עם מאגר BSA קר (טבלה 1).
    הערה: יש לעשות מאמץ כדי להסיר את כל השומן הסמוך מן הריאות לפני המשך הכנת ההשעיה של תא יחיד, כמו זה יכול להטות את הקריאות.

2. הכנת השעיה של תא יחיד

  1. מעבירים את הריאות לצלחת פטרי ריקה וטחונים אותן עם שני אזמלים עדינים. מעבירים את כל חלקי הריאה הטחונה לצינור חרוטי חדש של 50 מ"ל. השתמש 5 מ"ל של מאגר עיכול כדי לשטוף את הצלחת ולהוסיף אותו צינור 50 מ"ל המכיל את הריאה הטחונה (טבלה 1).
    הערה: יש להכין את מאגר העיכול מיד לפני השימוש. יש להשתמש ב-5 מ"ג/מ"ל קולגנאז28. שילוב של 1 או 5 מ"ג קולגנאז עם מאגר BSA או PBS ללא חלבון לא שיפר את התוצאות (איור S1 משלים).
  2. מאבטחים את מכסה הצינור ומעכלים את הריאה במשך 30 דקות על שייקר מסלולית במהירות של 150 סל"ד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. עצור את התגובה על ידי הוספת 10 מ"ל של מאגר BSA קר.
  3. לאחר העיכול, השתמש במחט 18 גרם כדי לערבב ולהמיס את חתיכות הריאה. מניחים מסננת מסננת 70 מיקרומטר בחלק העליון של צינור חרוטי חדש 50 מ"ל.
    הערה: שימוש במסנן מיקרון קטן יותר עלול לגרום לאובדן אוכלוסיות מיאלואידיות עיקריות.
  4. מעבירים באיטיות את תערובת הריאות המעוכלת ישירות על המסננת. השתמש בצד הגומי של בוכנה מזרק 10 מ"ל כדי לרסק את חתיכות הריאה הנותרות על המסנן. לשטוף את החומר המעובד על המסנן עם מאגר BSA.
  5. צנטריפוגה ההשעיה של תא יחיד ב 350 × גרם במשך 8 דקות ב 4 °C (4 °F ).
  6. בזהירות להשליך את supernatant ו resuspend התאים ב 1 מ"ל של מאגר תמוגה ACK. מערבבים היטב באמצעות צנרת 1 מ"ל, ודגור במשך 90 שניות בטמפרטורת החדר.
  7. הוסף 10 מ"ל של חיץ BSA קר כדי לעצור את התגובה ואת הצנטריפוגה ב 350 × גרם במשך 7 דקות ב 4 °C .בזהירות להשליך את supernatant ו resuspend את הכדור במאגר כתמים לספור את התאים באמצעות hemocytometer.
  8. לשפץ את התאים בריכוז של 5 × 106 תאים / מ"ל ולהשתמש בהם להכתמת פני השטח (ראה סעיף 3).
    הערה: למטרה זו, צלחת התאים בצלחת עגולה 96 היטב למטה ואחריו כתמי נוגדנים ושטיפת. אם צנטריפוגת צלחת אינה זמינה, השתמש בצינורות זרימה במקום בלוחות. עם פרוטוקול זה, ~ 15-20 × 106 תאים לריאה ניתן להשיג מעכבר C57BL / 6 בן 6-10 שבועות בגודל ממוצע.

3. כתמי נוגדנים על פני השטח

  1. העבר 1 × 106 תאים ב 200 μL לבאר בלוח 96-well. צנטריפוגה הצלחת ב 350 × גרם במשך 7 דקות ב 4 °C (4 °F). בינתיים, להכין את הפתרון בלוק Fc על ידי דילול נוגדן נגד 16/32 (1:100) במאגר כתמים (טבלה 1).
  2. Resuspend התאים ב 50 μL של פתרון חסימת Fc מוכן מראש (טבלת חומרים) ודגור במשך 15-20 דקות ב 4 °C (4 °F) או על קרח.
  3. מוסיפים 150 μL של חיץ כתמים וצנטריפוגה הצלחת ב 350 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (4 °F). בינתיים, להכין את קוקטייל נוגדנים פני השטח על ידי דילול נוגדנים פני השטח (1:100; טבלה 2) במאגר מכתים.
    הערה: (i) נוגדן נגד 16/32 לחסימת Fc ניתן להשתמש עם נוגדני פני השטח באותה תערובת. (ii) אם נעשה שימוש בצבע כדאיות לתיקון, הוסיפו אותו לקוקטייל הנוגדנים על פני השטח בדילול של 1:1,000.
  4. Resuspend התאים ב 50 μL של קוקטייל נוגדני משטח מוכן מראש ודגור במשך 30-40 דקות ב 4 °C (60 °F) בחושך. לשטוף את התאים עם חיץ כתמים פעמיים.
    הערה: אם אין צורך בהכתמה תאית, תחבר מחדש את התאים ב-200 μL של מאגר כתמים ותמשיך ישירות לרכישת נתונים על ציטומטר הזרימה. לחלופין, תאים עשויים להיות קבועים ומאוחסנים ב 4 °C °C (65 °F) לרכישה מאוחר יותר. אנו ממליצים להשתמש בתאים עבור cytometry זרימה בתוך 24 שעות.

4. קיבוע תאים וכתמים תאיים

  1. הכן את מאגר הקיבעון /permeabilization (תיקון / מאגר פרם) על ידי ערבוב שלושה חלקים של קיבעון / תרכיז permeabilization וחלק אחד של קיבעון / permeabilization דילול של FoxP3 / מאגר כתמים גורם שעתוק (טבלה 1).
  2. Resuspend התאים ב 50 μL של תיקון מוכן מראש / פרם חוצץ לכל באר של צלחת 96-well, שבו תאים היו מצופים כמתואר בסעיף 3, ודגור אותם במשך 20-25 דקות ב 4 °C (4 °F) בחושך.
  3. לדלל את מאגר 10x permeabilization כמו 1: 10 במים דה-יוניזציה מטוהרים כדי להכין 1x מאגר permeabilization.
  4. לשטוף את התאים פעם אחת עם מאגר 1x permeabilization. בינתיים, להכין את קוקטייל נוגדנים תאיים על ידי דילול נוגדנים תאיים (1:100) ב 1 מ"ל של חיץ permeabilization.
  5. resuspend התאים באמצעות 50 μL של קוקטייל נוגדני משטח מוכן מראש לכל תא של צלחת 96-well ודגור במשך 40 דקות ב 4 °C (4 °F) בחושך.
  6. לשטוף את התאים פעם אחת עם מאגר permeabilization ופעם אחת עם חיץ כתמים. לאחר הכביסה הסופית, resuspend התאים ב 200 μL של חיץ כתמים.
    הערה: אם אין ציטומטר זרימה עם קורא לוחות זמין, העבר את התאים לצינורות ציטומטריית זרימה.
  7. לרכוש מינימום של 1.5 × 106 תאים לכל מדגם על cytometer הזרימה.
    הערה: עבור צבעים בודדים ודגימות בקרה לא מוכתמות, 0.5-1 × 106 תאים לדגימה יספיקו. מומלץ לסמן את הנוגדנים הבודדים המשמשים להשגת כתמים אופטימליים ולהקטנת עלויות. הפרוטוקול הנוכחי עבר מיטוב באמצעות מאגר Fix/Perm שהוכן באמצעות ערכת מאגרי הכתמים של FoxP3. מכיוון ש- CD68 הוא ציטופלסמי ולא סמן גרעיני, פתרונות פרמביליזציה אחרים כגון ריכוז נמוך של ערכות paraformaldehyde או ציטופיקס / cytoperm מספקים שונים עשויים להספיק.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אסטרטגיית גינג
הצעד הראשון באסטרטגיית ההזדווגות שלנו הוא הדרת הפסולת והכפילויות (איור 1A). הדרה זהירה של כפילויות היא קריטית כדי למנוע אוכלוסיות חיוביות כוזבות (איור S2 משלים). לאחר מכן, תאי מערכת החיסון מזוהים באמצעות CD45+, סמן לתאי המטופויטיקה (איור 1B). ניתן להוסיף את הכתם החי-מת כדי לא לכלול תאים מתים. עם זאת, פרוטוקול זה גורם למותם של <5% מתאי CD45+ (איור 1C), בעוד ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהוי של תאי מערכת החיסון הריאתית יכול להיות מאתגר בגלל סוגי תאי החיסון המרובים המתגוררים בריאה ומאפייניהם החיסוניים הייחודיים בהשוואה למקביליהם המתגוררים ברקמות אחרות. במספר מצבים פתולוגיים, תאים עם תכונות פנוטיפיות ברורות מופיעים בריאות. לדוגמה, פגיעה ריאות הנגרמת על ידי בלומיצין גורמת לגיוס של מקרופאגים שמקורם במונוציטים במחזור בחלל המכתשי, שם הם יכולים להישאר במשך שנה אחת ואפילו להתמיד לאחר פיברוזיס המושרה על ידי בלומיצין. בניגוד ל- AMs התושבים ברקמות, המקרופאגים המונוציטים במחזור הם Siglec FlowCD11b ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

V.A.B. יש פטנטים על מסלול PD-1 מורשה על ידי בריסטול-מאיירס סקוויב, רוש, Merck, EMD-סרונו, Boehringer Ingelheim, אסטרהזנקה, נוברטיס, ודאקו. המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים אחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH R01CA238263 ו R01CA229784 (VAB).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
בוכנה מזרק 10 מ"לEXELINT26265
18 גרם מחטיםBD מחט גלישה מדויקת305165
21 גרם מחטיםBD מחט גלישה מדויקת305195
50 מ"ל צינורות חרוטייםFalcon3520
70 μ מסננת תאים mThermoFisher22363548
צלחות 96 בארותFalcon/corning3799
ACK Lysing BufferThermoFisherA10492-01
נגד עכבר CD11bBiolegend101215לפרטים ראה טבלה 2
נגד עכבר CD11cBiolegend117339 / 117337לפרטים ראה טבלה 2
נגד עכבר CD45Biolegend103115לפרטים ראה טבלה 2
נגד עכבר CD64Biolegend139319לפרטים ראה טבלה 2
נגד עכבר CD68Biolegend137009לפרטים ראה טבלה 2
נגד עכבר GR-1Biolegend108433לפרטים ראה טבלה 2
נגד עכבר Siglec FBiolegend155503
AVERTINSigma-Aldrich240486
B220Biolegend103228לפרטים ראה טבלה 2
סרום בקר אלבומין (BSA)Sigma-Aldrich9048-46-8
CD103Biolegend121405 / 121419לפרטים ראה טבלה 2
CD24Biolegend138503לפרטים ראה טבלה 2
CD3Biolegend100205לפרטים ראה טבלה 2
צנטריפוגה
קולגנאז סוג 1Worthington Biochemical CorpLS004196
CX3CR1Biolegend149005לפרטים ראה טבלה 2
DNase IMillipore Sigma10104159001
אתנול
F4/80Biolegend123133לפרטים ראה טבלה 2
FcBlock (CD16/32)Biolegend101301לפרטים ראה טבלה 2
סרום בקר עובריR& D Systems
מלקחיים משוננים עדיניםRoboz מכשיר כירורגי Co
Foxp3 / סט מאגר צביעת גורם שעתוקThermoFisher00-5523-00
Futura Safety אזמלMerit Medical SystemsSMS210
חי/מת ניתן לתיקון לקריאה רחוקה ערכת כתמי תאים מתיםThermoFisherL34973לפרטים ראה טבלה 2
MERTKBiolegend151505לפרטים ראה טבלה 2
MHC-IIBiolegend107621לפרטים ראה טבלה 2
NK1.1Biolegend108705לפרטים ראה טבלה 2
שייקר אורביטליVWRדגם 200
צלחת פטריFalcon351029
צנטריפוגה ספסל מקוררתSORVAL ST 16R
מספריים מעוקלים קטניםRoboz מכשיר כירורגי ושות
'

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. Journal of Experimental Medicine. 210 (10), 1977-1992 (2013).
  2. Tan, S. Y., Krasnow, M. A. Developmental origin of lung macrophage diversity. Development. 143 (8), 1318-1327 (2016).
  3. Schyns, J., et al. Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung. Nature Communications. 10 (1), 3964(2019).
  4. Gibbings, S. L., et al. Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).
  5. Ural, B. B., et al. Identification of a nerve-associated, lung-resident interstitial macrophage subset with distinct localization and immunoregulatory properties. Science Immunology. 5 (45), 8756(2020).
  6. Chakarov, S., et al. Two distinct interstitial macrophage populations coexist across tissues in specific subtissular niches. Science. 363 (6432), (2019).
  7. Liegeois, M., Legrand, C., Desmet, C. J., Marichal, T., Bureau, F. The interstitial macrophage: A long-neglected piece in the puzzle of lung immunity. Cellular Immunology. 330, 91-96 (2018).
  8. Stouch, A. N., et al. IkappaB kinase activity drives fetal lung macrophage maturation along a non-M1/M2 paradigm. Journal of Immunology. 193 (3), 1184-1193 (2014).
  9. Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nature Immunology. 16 (1), 36-44 (2015).
  10. Plantinga, M., et al. Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen. Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).
  11. Liu, H., et al. Dendritic cell trafficking and function in rare lung diseases. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (4), 393-402 (2017).
  12. Cook, P. C., MacDonald, A. S. Dendritic cells in lung immunopathology. Seminars in Immunopathology. 38, 449-460 (2016).
  13. Guilliams, M., Lambrecht, B. N., Hammad, H. Division of labor between lung dendritic cells and macrophages in the defense against pulmonary infections. Mucosal Immunology. 6 (3), 464-473 (2013).
  14. Nobs, S. P., et al. PPARγ in dendritic cells and T cells drives pathogenic type-2 effector responses in lung inflammation. Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 3015-3035 (2017).
  15. Aegerter, H., et al. Influenza-induced monocyte-derived alveolar macrophages confer prolonged antibacterial protection. Nature Immunology. 21 (2), 145-157 (2020).
  16. Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (4), 503-510 (2013).
  17. Hoffmann, F. M., et al. Distribution and interaction of murine pulmonary phagocytes in the naive and allergic lung. Frontiers in Immunology. 9, 1046(2018).
  18. Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606(2016).
  19. Mesnil, C., et al. Lung-resident eosinophils represent a distinct regulatory eosinophil subset. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3279-3295 (2016).
  20. Zaynagetdinov, R., et al. Identification of myeloid cell subsets in murine lungs using flow cytometry. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (2), 180-189 (2013).
  21. Tavares, A. H., Colby, J. K., Levy, B. D., Abdulnour, R. E. A model of self-limited acute lung injury by unilateral intra-bronchial acid instillation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60024(2019).
  22. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  23. Krishnamoorthy, N., et al. Neutrophil cytoplasts induce TH17 differentiation and skew inflammation toward neutrophilia in severe asthma. Science Immunology. 3 (26), (2018).
  24. Ascon, D. B., et al. Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire. Journal of Leukocyte Biology. 84 (6), 1400-1409 (2008).
  25. Wang, J., et al. Lung natural killer cells in mice: phenotype and response to respiratory infection. Immunology. 137 (1), 37-47 (2012).
  26. Cowley, S. C., Meierovics, A. I., Frelinger, J. A., Iwakura, Y., Elkins, K. L. Lung CD4-CD8- double-negative T cells are prominent producers of IL-17A and IFN-gamma during primary respiratory murine infection with Francisella tularensis live vaccine strain. Journal of Immunology. 184 (10), 5791-5801 (2010).
  27. Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. Isolation and characterization of mononuclear phagocytes in the mouse lung and lymph nodes. In Lung innate immunity and inflammation. Methods in Molecular Biology. Alper, S., Janssen, W. 1809, Humana Press. New York, NY. (2018).
  28. Singer, B. D., et al. Flow-cytometric method for simultaneous analysis of mouse lung epithelial, endothelial, and hematopoietic lineage cells. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (9), 796-801 (2016).
  29. Matsushima, S., et al. CD248 and integrin alpha-8 are candidate markers for differentiating lung fibroblast subtypes. BMC Pulmonary Medicine. 20 (1), 21(2020).
  30. Cong, J., Wei, H. Natural killer cells in the lungs. Frontiers in Immunology. 10, 1416(2019).
  31. Daubeuf, F., et al. A fast, easy, and customizable eight-color flow cytometric method for analysis of the cellular content of bronchoalveolar lavage fluid in the mouse. Current Protocols in Mouse Biology. 7 (2), 88-99 (2017).
  32. Yi, S., et al. Eosinophil recruitment is dynamically regulated by interplay among lung dendritic cell subsets after allergen challenge. Nature Communications. 9 (1), 3879(2018).
  33. Langlet, C., et al. CD64 expression distinguishes monocyte-derived and conventional dendritic cells and reveals their distinct role during intramuscular immunization. Journal of Immunology. 188 (4), 1751-1760 (2012).
  34. Moran, T. P., Nakano, H., Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A., Cook, D. N. Epigenetic control of Ccr7 expression in distinct lineages of lung dendritic cells. Journal of Immunology. 193 (10), 4904-4913 (2014).
  35. Schyns, J., Bureau, F., Marichal, T. Lung interstitial macrophages: past, present, and future. Journal of Immunology Research. 2018, 5160794(2018).
  36. Krljanac, B., et al. RELMalpha-expressing macrophages protect against fatal lung damage and reduce parasite burden during helminth infection. Science Immunology. 4 (35), (2019).
  37. Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
  38. Svedberg, F. R., et al. The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation. Nature Immunology. 20 (5), 571-580 (2019).
  39. Yona, S., et al. Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis. Immunity. 38 (1), 79-91 (2013).
  40. Misharin, A. V., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span. Journal of Experimental Medicine. 214 (8), 2387-2404 (2017).
  41. Koch, C. M., Chiu, S. F., Misharin, A. V., Ridge, K. M. Lung Interstitial Macrophages: Establishing Identity and Uncovering Heterogeneity. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 7-9 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

gating

מאמרים קשורים