במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול יעיל וניתן לשחזור כדי לבודד את האוכלוסיות החיסוניות של מערכת הנשימה murine. אנו מספקים גם שיטה לזיהוי של כל תאי החיסון המולדים והמסתגלים השוכנים בריאות של עכברים בריאים, באמצעות לוח ציטומטריית זרימה מבוסס 9 צבעים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ניתוח ציטומטרי זרימה לזיהוי תאי החיסון המולדים והמסתגלים של ריאות מורין
במאמר זה
סיכום
תקציר
מערכת הנשימה נמצאת במגע ישיר עם הסביבה החיצונית ודורשת מערכת חיסונית מוסדרת במדויק כדי לספק הגנה תוך דיכוי תגובות לא רצויות לאנטיגנים סביבתיים. הריאות מארחות מספר אוכלוסיות של תאי חיסון מולדים ומסתגלים המספקים מעקב חיסוני אך גם מתווכים בתגובות חיסוניות מגנות. תאים אלה, השומרים על איזון מערכת החיסון הריאתית הבריאה, משתתפים גם במספר מצבים פתולוגיים כגון אסתמה, זיהומים, מחלות אוטואימוניות וסרטן. ביטוי סלקטיבי של חלבונים פנימיים ותאיים מספק תכונות חיסוניות ייחודיות לתאי החיסון של הריאה. כתוצאה מכך, לציטומטריית זרימה יש תפקיד אינסטרומנטלי בזיהוי אוכלוסיות תאים כאלה במהלך מצב יציב ותנאים פתולוגיים. מאמר זה מציג פרוטוקול המתאר שיטה עקבית וניתנת לשחזור לזיהוי תאי החיסון השוכנים בריאות של עכברים בריאים בתנאים יציבים. עם זאת, פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לזהות שינויים באוכלוסיות תאים אלה במודלים שונים של מחלות כדי לסייע בזיהוי שינויים ספציפיים למחלות בנוף מערכת החיסון של הריאות.
מבוא
דרכי הנשימה של מורין מכילות מערכת חיסונית ייחודית האחראית למלחמה בפתוגנים ולשמירה על הומאוסטזיס חיסוני. מערכת החיסון הריאתית מורכבת מאוכלוסיות תאיות עם הטרוגניות משמעותית בפנוטיפ, בתפקוד, במקור ובמיקום שלהן. מקרופאגים מכתשיים מקומיים (AMs), שמקורם בעיקר במונוציטים עובריים, שוכנים בלומן מכתשי1, בעוד שמקרופגים ביניים (IMs) שמקורם במח העצם שוכנים בפרנצ'ימה הריאה2. הודעות מיידיות יכולות להיות מסווגות עוד יותר על-ידי הביטוי של CD206. CD206+ IMs מאכלסים את אזור הפריברונכיאל והפריקולרי, בעוד ש- CD206- IMs ממוקמים באינטרסטיטיום מכתשי3. כמה מחלקות משנה של הודעות מיידיות הוצעו לאח....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל המחקרים והניסויים המתוארים בפרוטוקול זה נערכו תחת הנחיות על פי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) של המרכז הרפואי בית ישראל דיקונס. עכברי C57BL/6 בני שישה עד עשרה שבועות משני המינים שימשו לפיתוח פרוטוקול זה.
1. כריתה כירורגית והכנת רקמות
- המתת חסד לעכבר על ידי הזרקה תוך-אפריקאית של 1 מ"ל של tribromoethanol (מוכן על פי פרוטוקול סטנדרטי; טבלת חומרים).
הערה: יש להימנע מחנק CO2 במחקרי ריאות מכיוון שהוא עלול לגרום לפגיעה בריאה ולשנות את התכונות והמאפיינים של תאי מערכת החיסון של הריאות. יש להימנע גם מפריקת צוואר הרחם מכיוון שהיא עלולה לגרום לפגיעה מכנית בריאה. - מעבירים את העכבר לאזו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
אסטרטגיית גינג
הצעד הראשון באסטרטגיית ההזדווגות שלנו הוא הדרת הפסולת והכפילויות (איור 1A). הדרה זהירה של כפילויות היא קריטית כדי למנוע אוכלוסיות חיוביות כוזבות (איור S2 משלים). לאחר מכן, תאי מערכת החיסון מזוהים באמצעות CD45+, סמן לתאי המטופויטיקה (איור 1B). ניתן להוסיף את הכתם החי-מת כדי לא לכלול תאים מתים. עם זאת, פרוטוקול זה גורם למותם של <5% מתאי CD45+ (איור 1C), בעוד .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
זיהוי של תאי מערכת החיסון הריאתית יכול להיות מאתגר בגלל סוגי תאי החיסון המרובים המתגוררים בריאה ומאפייניהם החיסוניים הייחודיים בהשוואה למקביליהם המתגוררים ברקמות אחרות. במספר מצבים פתולוגיים, תאים עם תכונות פנוטיפיות ברורות מופיעים בריאות. לדוגמה, פגיעה ריאות הנגרמת על ידי בלומיצין גורמת לגיוס של מקרופאגים שמקורם במונוציטים במחזור בחלל המכתשי, שם הם יכולים להישאר במשך שנה אחת ואפילו להתמיד לאחר פיברוזיס המושרה על ידי בלומיצין. בניגוד ל- AMs התושבים ברקמות, המקרופאגים המונוציטים במחזור הם Siglec FlowCD11b .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
V.A.B. יש פטנטים על מסלול PD-1 מורשה על ידי בריסטול-מאיירס סקוויב, רוש, Merck, EMD-סרונו, Boehringer Ingelheim, אסטרהזנקה, נוברטיס, ודאקו. המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים אחרים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH R01CA238263 ו R01CA229784 (VAB).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| בוכנה מזרק 10 מ"ל | EXELINT | 26265 | |
| 18 גרם מחטים | BD מחט גלישה מדויקת | 305165 | |
| 21 גרם מחטים | BD מחט גלישה מדויקת | 305195 | |
| 50 מ"ל צינורות חרוטיים | Falcon | 3520 | |
| 70 μ מסננת תאים m | ThermoFisher | 22363548 | |
| צלחות 96 בארות | Falcon/corning | 3799 | |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher | A10492-01 | |
| נגד עכבר CD11b | Biolegend | 101215 | לפרטים ראה טבלה 2 |
| נגד עכבר CD11c | Biolegend | 117339 / 117337 | לפרטים ראה טבלה 2 |
| נגד עכבר CD45 | Biolegend | 103115 | לפרטים ראה טבלה 2 |
| נגד עכבר CD64 | Biolegend | 139319 | לפרטים ראה טבלה 2 |
| נגד עכבר CD68 | Biolegend | 137009 | לפרטים ראה טבלה 2 |
| נגד עכבר GR-1 | Biolegend | 108433 | לפרטים ראה טבלה 2 |
| נגד עכבר Siglec F | Biolegend | 155503 | |
| AVERTIN | Sigma-Aldrich | 240486 | |
| B220 | Biolegend | 103228 | לפרטים ראה טבלה 2 |
| סרום בקר אלבומין (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | |
| CD103 | Biolegend | 121405 / 121419 | לפרטים ראה טבלה 2 |
| CD24 | Biolegend | 138503 | לפרטים ראה טבלה 2 |
| CD3 | Biolegend | 100205 | לפרטים ראה טבלה 2 |
| צנטריפוגה | |||
| קולגנאז סוג 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| CX3CR1 | Biolegend | 149005 | לפרטים ראה טבלה 2 |
| DNase I | Millipore Sigma | 10104159001 | |
| אתנול | |||
| F4/80 | Biolegend | 123133 | לפרטים ראה טבלה 2 |
| FcBlock (CD16/32)Biolegend | 101301 | לפרטים ראה טבלה 2 | |
| סרום בקר עוברי | R& D Systems | ||
| מלקחיים משוננים עדינים | Roboz מכשיר כירורגי Co | ||
| Foxp3 / סט מאגר צביעת גורם שעתוק | ThermoFisher | 00-5523-00 | |
| Futura Safety אזמל | Merit Medical Systems | SMS210 | |
| חי/מת ניתן לתיקון לקריאה רחוקה ערכת כתמי תאים מתים | ThermoFisher | L34973 | לפרטים ראה טבלה 2 |
| MERTK | Biolegend | 151505 | לפרטים ראה טבלה 2 |
| MHC-II | Biolegend | 107621 | לפרטים ראה טבלה 2 |
| NK1.1 | Biolegend | 108705 | לפרטים ראה טבלה 2 |
| שייקר אורביטלי | VWR | דגם 200 | |
| צלחת פטרי | Falcon | 351029 | |
| צנטריפוגה ספסל מקוררת | SORVAL ST 16R | ||
| מספריים מעוקלים קטנים | Roboz מכשיר כירורגי ושות |
מקורות
- Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. Journal of Experimental Medicine. 210 (10), 1977-1992 (2013).
- Tan, S. Y., Krasnow, M. A.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
