בלוטת הרוק של היתושים הבוגרים (SG) נדרשת להעברת כל הפתוגנים המועברים על ידי יתושים למארחים האנושיים שלהם, כולל וירוסים וטפילים. וידאו זה מדגים בידוד יעיל של SGs מן הזחל (L4) שלב אנופלס גמביה יתושים והכנת L4 SGs לניתוח נוסף.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ניתוח וחיסון של בלוטות הרוק של Larval מ אנופלס גמביה יתושים
במאמר זה
סיכום
תקציר
בלוטות רוק יתושים (SGs) הן איבר שער נדרש להעברת פתוגנים המועברים על ידי חרקים. סוכנים הגורמים למחלות, כולל וירוסים וטפילי פלסמודיום הגורמים למלריה, מצטברים בחללי ההפרשה של תאי SG. כאן, הם מוכנים לשידור למארחים החולייתיים שלהם במהלך ארוחת דם לאחר מכן. כמו בלוטות למבוגרים טופס כמו פירוט של שאריות ניצן צינור SG זחלים הנמשכים מעבר היסטוליזה SG pupal מוקדם, זחל SG הוא יעד אידיאלי להתערבויות המגבילים את העברת המחלה. הבנת פיתוח הזחלים SG יכולה לעזור לפתח הבנה טובה יותר של המורפולוגיה וההתאמות התפקודיות שלה ולסייע בהערכת התערבויות חדשות המכוונות לאיבר זה. פרוטוקול וידאו זה מדגים טכניקה יעילה לבידוד, תיקון והכתמת SGs זחלים מיתושי אנופלס גמביה. בלוטות ניתחו מזחלים בתמיסת אתנול 25% קבועים בתערובת חומצה אצטית מתנול-קרחוני, ואחריה שטיפת אצטון קרה. לאחר כמה שטיפות מלוחות פוספט (PBS), SGs יכול להיות מוכתם עם מגוון רחב של צבעי סמן ו / או אנטיזרים נגד חלבונים מבוטאים SG. שיטה זו לבידוד זחל SG יכול לשמש גם כדי לאסוף רקמה עבור ניתוח הכלאה במקום, יישומים שעתוק אחרים, ומחקרים פרוטאומיים.
מבוא
מלריה היא איום גדול על בריאות הציבור הגורמת לכמעט 230 מיליון זיהומים וכ -409,000 מקרי מוות בשנת 20191. רוב מקרי המוות הם באפריקה שמדרום לסהרה והם נגרמים על ידי הטפיל פלסמודיום פאלציפארום, אשר וקטור החרקים שלו הוא אנופלס גמביה, הנושא של הדגמת וידאו זו. למרות שהמספרים מצביעים על ירידה משמעותית בשיעור התמותה השנתי מאז תחילת המאה (>300,000 פחות מקרי מוות שנתיים), הירידה המבטיחה בשיעורי המחלות שנצפו בין השנים 2000 ל -2015 מתחדדת, מה שמצביע על הצורך בגישות חדשות להגבלת העברת המחלה2. בין אסטרטגיות נוספות מבטיחות לשליטה ואולי חיסול מלריה הוא מיקוד קיבולת וקטור יתושים באמצעות CRISPR / Cas9 מבוסס עריכת גנים וכונן....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת פתרונות וכלים
- הכנת פתרון ניתוח
- כדי להכין פתרון לנתח, להוסיף 2.5 מ"ל של 100% אתנול ל 7.5 מ"ל של H2O מזוקק בצינור פלסטיק 15. הפוך את הצינור 3 פעמים לערבב.
הערה: פתרון זה יכול להיות מאוחסן בטמפרטורת החדר במשך מספר שבועות.
- כדי להכין פתרון לנתח, להוסיף 2.5 מ"ל של 100% אתנול ל 7.5 מ"ל של H2O מזוקק בצינור פלסטיק 15. הפוך את הצינור 3 פעמים לערבב.
- הכנת מלאי תמיסת מלח (PBS) עם 10x חוצץ פוספט
- להכנת מלאי PBS 10x, הוסף 17.8 גרם Na2HPO4• 2H2O, 2.4 גרם KH2PO4, 80 גרם NaCl, ו 2 גרם KCl ל 800 מ"ל של מים דה-יוניים. מערבבים עם מוט ערבוב על צלחת ערבוב עד שהמוצקים נמסים לחלוטין. כוונן את עוצמת הקול הסופית ל- 1 ליטר עם מים מטוהרים.
הערה: פתרון זה יכול להיות מאוחסן ב....
- להכנת מלאי PBS 10x, הוסף 17.8 גרם Na2HPO4• 2H2O, 2.4 גרם KH2PO4, 80 גרם NaCl, ו 2 גרם KCl ל 800 מ"ל של מים דה-יוניים. מערבבים עם מוט ערבוב על צלחת ערבוב עד שהמוצקים נמסים לחלוטין. כוונן את עוצמת הקול הסופית ל- 1 ליטר עם מים מטוהרים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בלוטות הרוק קלות יחסית לניתוח מכל הזחלים בשלב 4. ניתן להבחין בין זחלים זכרים ונקביים בשלב הזחל L4 המאוחר על ידי פס אדום לאורך בית החזה בגב של נקבות אך לא זכרים(איור 2). אנו גם מבחינים כי מורפולוגיה אנטנה היא הרבה יותר משוכללת אצל זכר מאשר זחלי L4 נקבה(איור 2),בדומה להבדלים שנצפו במבנה זה יתושים בוגרים. יחד עם הצמיחה הכוללת ניכרת במהלך שלב L4, בלוטות הרוק גם ליצור לומן במהלך L412. בלוטות הרוק המבודדות מזחלי שלב L4 מוקדמים מוכתמים בהוכסט חו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקול המתואר כאן הותאם מפרוטוקול ניתוח Drosophila SG ופרוטוקול ניתוח יתושיםלמבוגרים 14,15,16. עם זאת, רוב הסמנים לא חדרו את קרום המרתף (נתונים לא הראו) בעת שימוש בשיטות הניתוח למבוגרים והכתמת SG. התאמות של הפרוטוקול למבוגרים כללו לנתח את הבלוטות בתמיסת EtOH של 25%, שטיפת הבלוטות בשילוב של MeOH וחומצה אצטית קרחונית, ושטיפת אצטון של 90. בפרוטוקול המבוגר המקורי, SGs למבוגרים נותחו ב 1x PBS14,<.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
תודות
ברצוננו להודות למכון ג'ונס הופקינס לחקר המלריה על הגישה והגידול של זחלי א. גמביה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| KH2PO4 | Millipore Sigma | P9791 | |
| Na2HPO4 • 2<תת>2O | Millipore Sigma | 71643 | |
| NaCl | Millipore Sigma | S7653 | |
| 179124 | אצטון | Millipore Sigma | |
| עם זיפים רכים | אמזון (SN NJDF) סט מברשות צבע מפורט | B08LH63D89 | |
| החלקות כיסוי (22 x 50 מ"מ) | VWR | 48393-195 | |
| DAPI (DNA) | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| אלכוהול אתילי 200 הוכחה | Millipore Sigma | EX0276 | |
| Gilson Pipetman P200 פיפטה | Gilson | P200 | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma Aldrich 695092 | ||
| Jewelers מלקחיים, Dumont No. 5 | Millipore Sigma | F6521 | |
| KCl | Millipore Sigma | 58221 | |
| מתנול | Millipore Sigma | 1414209 | |
| לק | אמזון (סאלי הנסן) | B08148YH9M | |
| נילוס אדום (שומנים)ThermoFisher | Scientific | N1142 | |
| מגבות/מגבוני נייר | ULINE | S-7128 | |
| צלחת פטרי (להכנת צלחת שפכטל) | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | |
| טיפים לפיפטה | טיפים גילסון | E200ST | |
| העברת פלסטיק פיפטה | פישר נוגדנים ראשוניים | S304671 | |
| (למשל, Crb, Rab11) | מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה (DSHB); Andrew Lab | Mouse anti-Crb (Cq4) או Rabbit anti-Rab11 | |
| נוגדנים משניים עם תגים פלואורסצנטיים (למשל, Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit) | ThermoFisher Scientific | A11008 | |
| שרף סיליקון וחומר ריפוי לצלחת שפכטל | Dow Chemicals - Ximeter סיליקון | PMX-200 | |
| שקופיות, חלביות בקצה אחד לתיוג | VWR 20 X 50 מ"מ | 48393-195 | |
| נבט חיטה אגלוטינין | ThermoFisher Scientific | W834 |
מקורות
- World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization. , Available from: https://apps.who.int/iris/handle/10665/337660 (2020).
- Feachem, R. G. A., et al. Malaria eradication within a generation: ambitious, achievable, and necessary. Lancet. 394 (10203), 1056-1112 (2019).
- Adolfi, A., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
