הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניתוח וחיסון של בלוטות הרוק של Larval מ אנופלס גמביה יתושים

4.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62989

⸱

30 בספטמבר 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 2Tufts School of Medicine, 3Department of Biomedical Sciences, Idaho College of Osteopathic Medicine

במאמר זה

סיכום

בלוטת הרוק של היתושים הבוגרים (SG) נדרשת להעברת כל הפתוגנים המועברים על ידי יתושים למארחים האנושיים שלהם, כולל וירוסים וטפילים. וידאו זה מדגים בידוד יעיל של SGs מן הזחל (L4) שלב אנופלס גמביה יתושים והכנת L4 SGs לניתוח נוסף.

תקציר

בלוטות רוק יתושים (SGs) הן איבר שער נדרש להעברת פתוגנים המועברים על ידי חרקים. סוכנים הגורמים למחלות, כולל וירוסים וטפילי פלסמודיום הגורמים למלריה, מצטברים בחללי ההפרשה של תאי SG. כאן, הם מוכנים לשידור למארחים החולייתיים שלהם במהלך ארוחת דם לאחר מכן. כמו בלוטות למבוגרים טופס כמו פירוט של שאריות ניצן צינור SG זחלים הנמשכים מעבר היסטוליזה SG pupal מוקדם, זחל SG הוא יעד אידיאלי להתערבויות המגבילים את העברת המחלה. הבנת פיתוח הזחלים SG יכולה לעזור לפתח הבנה טובה יותר של המורפולוגיה וההתאמות התפקודיות שלה ולסייע בהערכת התערבויות חדשות המכוונות לאיבר זה. פרוטוקול וידאו זה מדגים טכניקה יעילה לבידוד, תיקון והכתמת SGs זחלים מיתושי אנופלס גמביה. בלוטות ניתחו מזחלים בתמיסת אתנול 25% קבועים בתערובת חומצה אצטית מתנול-קרחוני, ואחריה שטיפת אצטון קרה. לאחר כמה שטיפות מלוחות פוספט (PBS), SGs יכול להיות מוכתם עם מגוון רחב של צבעי סמן ו / או אנטיזרים נגד חלבונים מבוטאים SG. שיטה זו לבידוד זחל SG יכול לשמש גם כדי לאסוף רקמה עבור ניתוח הכלאה במקום, יישומים שעתוק אחרים, ומחקרים פרוטאומיים.

מבוא

מלריה היא איום גדול על בריאות הציבור הגורמת לכמעט 230 מיליון זיהומים וכ -409,000 מקרי מוות בשנת 20191. רוב מקרי המוות הם באפריקה שמדרום לסהרה והם נגרמים על ידי הטפיל פלסמודיום פאלציפארום, אשר וקטור החרקים שלו הוא אנופלס גמביה, הנושא של הדגמת וידאו זו. למרות שהמספרים מצביעים על ירידה משמעותית בשיעור התמותה השנתי מאז תחילת המאה (>300,000 פחות מקרי מוות שנתיים), הירידה המבטיחה בשיעורי המחלות שנצפו בין השנים 2000 ל -2015 מתחדדת, מה שמצביע על הצורך בגישות חדשות להגבלת העברת המחלה2. בין אסטרטגיות נוספות מבטיחות לשליטה ואולי חיסול מלריה הוא מיקוד קיבולת וקטור יתושים באמצעות CRISPR / Cas9 מבוסס עריכת גנים וכונןגנים 3,4,5. ואכן, זה מיקוד של וקטור יתוש (באמצעות שימוש מורחב של כילות הקשורות קוטלי חרקים לאורך זמן) כי יש את ההשפעה הגדולה ביותר על הפחתת העברת המחלה6.

נקבות יתושים רוכשות גמטוציטים מפלסמודיום מאדם נגוע במהלך ארוחת דם. לאחר הפריה, התבגרות, חציית אפיתל midgut, התרחבות האוכלוסייה, וניווט hemocoel המארחים יתושים מחויב שלהם, מאות עד עשרות אלפי sporozoites פלסמודיום לפלוש SGs יתוש ולמלא את חללי הפרשה של תאי הפרשה המרכיבים. ברגע שהם בתוך חללי ההפרשה, לטפילים יש גישה ישירה לצינור הרוק ולכן הם צפויים להעביר למארח בעל חוליות חדש על ארוחת הדם הבאה. מכיוון ש-SGs הם קריטיים להעברת ספורוזויטים הגורמים למלריה למארחים האנושיים שלהם, ומחקרי מעבדה מראים כי SGs אינם חיוניים להאכלת דם, הישרדות יתושים או פוריות7,8,9, הם מייצגים יעד אידיאלי לאמצעי חסימת שידור. SGs יתוש מבוגר טופס כהרחבה של "ניצן צינור" שרידים SGs זחל הנמשכים מעבר מוקדם SG היסטוליזה10, מה שהופך את זחל SG יעד אידיאלי להתערבויות כדי להגביל את העברת המחלה בשלב למבוגרים.

אפיון השלב הזחלי של פיתוח SG יכול לעזור לפתח לא רק הבנה טובה יותר של המורפולוגיה שלה והתאמות פונקציונליות, אלא גם יכול לסייע בהערכת התערבויות חדשות המכוונות לאיבר זה באמצעות עריכת גנים של רגולטורים מרכזיים של SG. כי כל המחקרים הקודמים של ארכיטקטורת בלוטת הרוק זחל קדמו חיסוני וטכניקות הדמיה מודרניות10,11, פיתחנו פרוטוקול לבידוד והכתמת בלוטות רוק עם מגוון של נוגדנים וסמני תאים12. וידאו זה מדגים גישה זו להפקה, קיבעון, והכתמה של SGs זחל מ זחלי אנופלס גמביה L4 עבור הדמיה קונפוקלית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת פתרונות וכלים

  1. הכנת פתרון ניתוח
    1. כדי להכין פתרון לנתח, להוסיף 2.5 מ"ל של 100% אתנול ל 7.5 מ"ל של H2O מזוקק בצינור פלסטיק 15. הפוך את הצינור 3 פעמים לערבב.
      הערה: פתרון זה יכול להיות מאוחסן בטמפרטורת החדר במשך מספר שבועות.
  2. הכנת מלאי תמיסת מלח (PBS) עם 10x חוצץ פוספט
    1. להכנת מלאי PBS 10x, הוסף 17.8 גרם Na2HPO4• 2H2O, 2.4 גרם KH2PO4, 80 גרם NaCl, ו 2 גרם KCl ל 800 מ"ל של מים דה-יוניים. מערבבים עם מוט ערבוב על צלחת ערבוב עד שהמוצקים נמסים לחלוטין. כוונן את עוצמת הקול הסופית ל- 1 ליטר עם מים מטוהרים.
      הערה: פתרון זה יכול להיות מאוחסן בטמפרטורת החדר במשך מספר חודשים.
  3. הכנת 1x PBS
    1. הוסף 10 מ"ל של PBS 10x ל 90 מ"ל של H2O בבקבוק זכוכית סטרילי. סוגרים את המכסה בחוזקה והוותים 3x לערבוב.
      הערה: הפתרון יכול להיות מאוחסן ב 4 °C (75 °F) במשך מספר שבועות.
  4. הכנת קיבעון.
    1. הוסף 600 μL של מתנול ל 200 μL של חומצה אצטית קרחונית. הפוך את הפתרון טרי בכל פעם.
  5. בניית צלחת מרק (צלחת תרבית רקמות מלאה גומי סיליקון)
    1. מערבבים את הרכיבים (1:50) של אפוקסי (1 גרם) ומים (50 מ"ל) ויוצקים את התערובת לצלחת פטרי. המתן עד שהרכיבים יתייבשו לפני השימוש.
      הערה: לאחר שנבנה, צלחת מרק ניתן להשתמש במשך שנים.

2. ניתוח בלוטה (איור 1A)

  1. לאסוף זחלי L4 בשלב מאוחר (~ 10 ימים לאחר הפתח; איור 2) ממגשי האכלה באמצעות פיפטה להעברת פלסטיק.
    הערה: ראה מדריך מקוון מועיל זה עבור גידול יתושים סטנדרטי ותרבות זחל13.
    1. מניחים צלחת מרק על הבמה של מיקרוסקופ מנתח ומעבירים זחלים על צלחת מרק.
      הערה: בעת aliquoting זחלים עבור ניתוח ראשוני, זה מועיל להעביר ~ 10 זחלים על השקופית בבת אחת באמצעות pipette העברת פלסטיק.
  2. הניחו טיפה של פתרון ביתור (1:3 EtOH:H2O) על צלחת מרק, בנפרד מ 10 זחלים.
  3. השתמש פיפטה העברת פלסטיק או פיפטה זכוכית חד פעמית למקם זחל L4 אחד לתוך 25% EtOH טיפה.
  4. קח מלקחיים (#5), אחד בכל יד, ועם היד הלא דומיננטית, לאחוז בראש הזחל. באמצעות היד הדומיננטית, לתפוס את הזחל עם מלקחיים ממש מתחת לראש ולמשוך בעדינות עם כוח קבוע מינימלי, כך שהראש מתנתק משאר הגוף ואת הבלוטות להישאר מחובר לראש. השליכו את חלק הגוף של פגר הזחל.
    הערה: בעת הניתוח, הגדר מגבת נייר בקרבת מקום כדי לאסוף את פגרי הזחלים.
  5. לאסוף את הראש / בלוטות לתוך 1 מ"ל של 1x PBS בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל. השתמש 1 מ"ל של PBS עבור ~ 40 בלוטות ניתחו עם הראשים המצורפים שלהם. המתן שהראשים/אס.ג'י יטבעו לתחתית המאגר.

3. קיבעון להכתמת נוגדנים (איור 1B)

  1. לנקז את PBS החל מהחלק העליון של צינור microcentrifuge באמצעות pipette העברת זכוכית, הימנעות רקמות יתוש דביק והסרת כמה שיותר של פתרון PBS מבלי לפגוע ברקמות. החלף את הפתרון עם 800 μL של תערובת 3:1 של מתנול לחומצה אצטית קרחונית. מניחים את הצינור ב 4 °C (12-24 שעות מומלץ; 19 שעות מועדף).
  2. למחרת, לנקז את הפתרון ולהחליף אותו עם 1 מ"ל של קר 100% אצטון. עזוב ל-90.
  3. הסר את האצטון בעדינות לשטוף את הרקמות שלוש פעמים עם 1 מ"ל של 1x PBS בכל פעם.
    הערה: הדגימות צריכות לצוף לאט למעלה עם הזרימה, ואז ליפול בחזרה לתחתית הצינור עד שכל תוספת PBS תושלם.

4. חיסונים (איור 1B)

  1. הוסף נוגדן ראשוני (למשל, Rab11) בדילול המתאים (1:100) ב 200 μL של הנפח הכולל של 1x PBS. מערבבים בעדינות את תכולת הצינור עם קצה פיפטה. דגירה לילה ב 4 °C (5 °F).
  2. הסר את פתרון הנוגדנים העיקרי ושטוף שלוש פעמים עם 1 מ"ל של 1x PBS (בעדינות pipetting את הפתרון פנימה והחוצה של pipette).
  3. הוסף נוגדן משני (אלכס פלור 488 עז אנטי ארנב) בדילול המתאים (1:200) ב 200 μL של נפח כולל. מערבבים בעדינות את תכולת הצינור עם קצה פיפטה. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 90 דקות.
  4. הוסף צבעים, כגון אדום הנילוס (שומנים, 5 μL של 1 מיקרוגרם / μL) ו / או Hoechst (DNA, 3 μL של 1 מיקרוגרם / μL), לתוך 200 μL של PBS בשלב זה. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 60 דקות נוספות. יש לשטוף בעדינות שלוש פעמים עם PBS 1x.

5. הרכבה של בלוטות מוכתמות למיקרוסקופיה (איור 1C)

  1. Pipette 200 μL של 100% גליסול על שקופית מיקרוסקופ.
    הערה: כמו גליצרל הוא צמיג, להשאיר את קצה pipette בנוזל עד שהוא מגיע לנפח המתאים. לא התכווצות רקמות נצפתה כאשר הולכים ישר לתוך 100% גליסול. עם זאת, חוקרים יכולים לעבור 30% ו 50% גליסrol שוטף בצינורות לפני העברת הדגימות לתוך 100% גליסול.
  2. העבר את הראשים המוכתמים (עד 20 לשקופית) עם הבלוטות המצורפות (יחד עם מבנים פנימיים אחרים) לשקופית המיקרוסקופ באמצעות מברשת רכה (איור 3A). פזירו את הדגימות כך שהן יופצו באופן שווה לאורך מגלשת הזכוכית.
    הערה: בעת הפקדת בלוטות על שקופית כיסוי עם מברשת, מלקחיים יכולים לשמש בעדינות לכוון את SGs, כך שהם כולם מכוונים באותו כיוון.
  3. צפייה תחת מיקרוסקופ מנתח, להפריד את ראש הזחל מן הבלוטות באמצעות שני זוגות של מלקחיים בזהירות מושך את שתי הרקמות בכיוונים מנוגדים.
    הערה: כפי שהוא מאתגר לבודד לחלוטין את SGs, פשוט להסיר את הראשים, עוזב את SGs ומבנים פנימיים הקשורים. גם אם ה-SGs יישארו קשורים לרקמות אחרות, הם מזוהים בקלות כאשר הם מוכתמים בהוכשט וסמנים אחרים(איור 3B,C).
  4. הסר והשלך את הראשים וחזר על תהליך ההפרדה עבור כל ס"ג.
    הערה: בעת הסרת ראשים, הגדר מגבת נייר בקרבת מקום כדי לאסוף אותם.
  5. מניחים בעדינות כיסוי בעובי 1.5 מ"מ בחלק העליון (הימנעות מבועות אוויר) וחותמים עם לק ברור.
  6. יש לאחסן ב-4 °C (75°F) במיכל חסין אור.
    הערה: שקופיות מוכנות של בלוטות מוכתמות ניתן לשמור על 4 °C (5 °F) בחושך עד שישה חודשים עד שנה ללא כל שינויים בולטים באיכות. אם גליצריל מתחיל לדלוף ככל שהחודשים עוברים, הרם בעדינות את כיסוי ואת pipette בגליצריל יותר כדי למלא חורים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בלוטות הרוק קלות יחסית לניתוח מכל הזחלים בשלב 4. ניתן להבחין בין זחלים זכרים ונקביים בשלב הזחל L4 המאוחר על ידי פס אדום לאורך בית החזה בגב של נקבות אך לא זכרים(איור 2). אנו גם מבחינים כי מורפולוגיה אנטנה היא הרבה יותר משוכללת אצל זכר מאשר זחלי L4 נקבה(איור 2),בדומה להבדלים שנצפו במבנה זה יתושים בוגרים. יחד עם הצמיחה הכוללת ניכרת במהלך שלב L4, בלוטות הרוק גם ליצור לומן במהלך L412. בלוטות הרוק המבודדות מזחלי שלב L4 מוקדמים מוכתמים בהוכסט חו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול המתואר כאן הותאם מפרוטוקול ניתוח Drosophila SG ופרוטוקול ניתוח יתושיםלמבוגרים 14,15,16. עם זאת, רוב הסמנים לא חדרו את קרום המרתף (נתונים לא הראו) בעת שימוש בשיטות הניתוח למבוגרים והכתמת SG. התאמות של הפרוטוקול למבוגרים כללו לנתח את הבלוטות בתמיסת EtOH של 25%, שטיפת הבלוטות בשילוב של MeOH וחומצה אצטית קרחונית, ושטיפת אצטון של 90. בפרוטוקול המבוגר המקורי, SGs למבוגרים נותחו ב 1x PBS14,<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

ברצוננו להודות למכון ג'ונס הופקינס לחקר המלריה על הגישה והגידול של זחלי א. גמביה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
  KH2PO4Millipore SigmaP9791
  Na2HPO4 • 2<תת>2OMillipore Sigma71643
  NaClMillipore SigmaS7653
179124אצטוןMillipore Sigma
עם זיפים רכיםאמזון (SN NJDF) סט מברשות צבע מפורטB08LH63D89
החלקות כיסוי (22 x 50 מ"מ)VWR48393-195
DAPI (DNA)ThermoFisher ScientificD1306
אלכוהול אתילי 200 הוכחהMillipore SigmaEX0276
Gilson Pipetman P200 פיפטהGilsonP200
Glacial Acetic AcidSigma Aldrich 695092
Jewelers מלקחיים, Dumont No. 5Millipore SigmaF6521
KClMillipore Sigma58221
מתנולMillipore Sigma1414209
לקאמזון (סאלי הנסן)B08148YH9M
נילוס אדום (שומנים)ThermoFisherScientificN1142
מגבות/מגבוני ניירULINES-7128
צלחת פטרי (להכנת צלחת שפכטל)ThermoFisher ScientificFB0875712
טיפים לפיפטהטיפים גילסוןE200ST
העברת פלסטיק פיפטהפישר נוגדנים ראשונייםS304671
(למשל, Crb, Rab11)מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה (DSHB); Andrew LabMouse anti-Crb (Cq4) או Rabbit anti-Rab11
נוגדנים משניים עם תגים פלואורסצנטיים (למשל, Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit)ThermoFisher ScientificA11008
שרף סיליקון וחומר ריפוי לצלחת שפכטלDow Chemicals - Ximeter סיליקוןPMX-200
שקופיות, חלביות בקצה אחד לתיוגVWR  20 X 50 מ"מ48393-195
נבט חיטה אגלוטיניןThermoFisher ScientificW834
מברשת מדעיים

מקורות

  1. World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization. , Available from: https://apps.who.int/iris/handle/10665/337660 (2020).
  2. Feachem, R. G. A., et al. Malaria eradication within a generation: ambitious, achievable, and necessary. Lancet. 394 (10203), 1056-1112 (2019).
  3. Adolfi, A., et al. Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature Communications. 11, 5553(2020).
  4. Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
  5. Rostami, M. N. CRISPR/Cas9 gene drive technology to control transmission of vector-borne parasitic infections. Parasite Immunology. 42 (9), 12762(2020).
  6. Bhatt, S., et al. Coverage and system efficiencies of insecticide-treated nets in Africa from 2000 to 2017. Elife. 4, 09672(2015).
  7. Mellink, J. J., Vanden Bovenkamp, W. Functional aspects of mosquito salivation in blood feeding of Aedes aegypti. Mosquito News. 41 (1), 115(1981).
  8. Ribeiro, J. M., Rossignol, P. A., Spielman, A. Role of mosquito saliva in blood vessel location. Journal of Experimental Biology. 108, 1-7 (1984).
  9. Yamamoto, D. S., Sumitani, M., Kasashima, K., Sezutsu, H., Matsuoka, H. Inhibition of malaria infection in transgenic Anopheline mosquitoes lacking salivary gland cells. PLoS Pathogens. 12 (9), 1005872(2016).
  10. Rishikesh, N. Morphology and development of the salivary glands and their chromosomes in the larvae of Anopheles stephensi sensu stricto. Bulletin of the World Health Organization. 20 (1), 47-61 (1959).
  11. Jensen, D. V., Jones, J. C. The development of the salivary glands in Anopheles albimanus Wiedemann (Diptera, Culicidae). Annals of the Entomological Society of America. 50 (5), 40824(1957).
  12. Chiu, M., Trigg, B., Taracena, M., Wells, M. Diverse cellular morphologies during lumen maturation in Anopheles gambiae larval salivary glands. Insect Molecular Biology. 30 (2), 210-230 (2021).
  13. Benedict, M. Q. MR4. Methods in Anopheles research. Center for Disease Control. , Available from: https://www.beiresources.org/Portals/2/ VectorResources/2016%20Methods%20in%20Anopheles%20Research%20full%20manual.pdf (2015).
  14. Wells, M. B., Andrew, D. J. Salivary gland cellular architecture in the Asian malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Parasites & Vectors. 8, 617(2015).
  15. Wells, M. B., Villamor, J., Andrew, D. J. Salivary gland maturation and duct formation in the African malaria mosquito Anopheles gambiae. Scientific Reports. 7 (1), 601(2017).
  16. Wells, M. B., Andrew, D. J. Anopheles salivary gland architecture shapes plasmodium sporozoite availability for transmission. mBio. 10 (4), 01238(2019).
  17. Clements, A. N. The physiology of mosquitoes. , Pergamon Press. Paris. (1963).
  18. Imms, A. D. On the larval and pupal stages of Anopheles maculipennis, meigen. Parasitology. 1 (2), 103-133 (1908).
  19. Favia, G., et al. Bacteria of the genus Asaia stably associate with Anopheles stephensi, an Asian malarial mosquito vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (21), 9047-9051 (2007).
  20. Neira Oviedo, M., et al. The salivary transcriptome of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) larvae: A microarray-based analysis. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 39 (5-6), 382-394 (2009).
  21. Linser, P. J., Smith, K. E., Seron, T. J., Neira Oviedo, M. Carbonic anhydrases and anion transport in mosquito midgut pH regulation. Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1662-1671 (2009).
  22. Linser, P. J., et al. Slc4-like anion transporters of the larval mosquito alimentary canal. Journal of Insect Physiology. 58 (4), 551-562 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

buffered
ניתוח וחיסון של בלוטות הרוק של Larval מ אנופלס גמביה יתושים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.