הערכת זרחון חמצוני באמצעות מד נשימה ברזולוציה גבוהה הפכה לחלק בלתי נפרד מהניתוח הפונקציונלי של מיטוכונדריה ומטבוליזם של אנרגיה תאית. כאן אנו מציגים פרוטוקולים לניתוח חילוף החומרים של אנרגיה תאית באמצעות מדים מבוססי תאים ומיקרו-פלטות ברזולוציה גבוהה ודנים ביתרונות העיקריים של כל מכשיר.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Respirometry ברזולוציה גבוהה להערכת ביו-אנרגיה בתאים וברקמות באמצעות מדים מבוססי תאים ולוחות
במאמר זה
סיכום
תקציר
נשימה ברזולוציה גבוהה (HRR) מאפשרת ניטור של זרחון חמצוני בזמן אמת לניתוח מצבי אנרגיה תאיים בודדים ולהערכת קומפלקסים נשימתיים באמצעות פרוטוקולים מגוונים של טיטרציה מעכבי מצע-לא-מעכבי-קופלר (SUIT). כאן מודגם השימוש בשני מכשירי נשימה ברזולוציה גבוהה, ומוצג אוסף בסיסי של פרוטוקולים החלים על ניתוח תאים בתרבית, סיבי שרירי שלד ולב, ורקמות רכות כגון המוח והכבד. פרוטוקולים לתאים ורקמות בתרבית מסופקים עבור מד נשימה מבוסס תא ותאים בתרבית עבור מד נשימה מבוסס מיקרו-פלטה, שניהם מקיפים פרוטוקולי נשימה סטנדרטיים. למטרות השוואה, תאי HEK293 המהונדסים על ידי קריספר, החסרים בתרגום המיטוכונדריה הגורמים למחסור רב במערכת הנשימה, משמשים בשני המכשירים כדי להדגים פגמים תאיים בנשימה. שני ה-respirometers מאפשרים מדידה מקיפה של הנשימה התאית, כאשר היתרונות הטכניים וההתאמה שלהם תלויים בשאלת המחקר ובמודל הנחקר.
מבוא
המיטוכונדריה ממלאת את אספקת האנרגיה העיקרית ומהווה אברון ממודר התורם לתהליכים ביו-אנרגטיים ומטבוליים תאיים חיוניים כגון אנאבוליזם של נוקלאוטידים, ליפידים וחומצות אמינו, ביוגנזה של צבירי ברזל-גופרית והם מעורבים באיתות כגון מוות מבוקר של תאים 1,2,3 . ביו-אנרגיה מיטוכונדריאלית באמצעות זרחון חמצוני תורמת כמעט לכל התהליכים התאיים בתוך התא, וכתוצאה מכך, תפקודים מיטוכונדריאליים ממקור ראשוני או משני קשורים לספקטרום רחב של תנאי מחלה 4,5. תפקוד לקוי של המיטוכונדריה לא רק כרוך בשינויים במבנה או בצפיפות המיטוכונדרית אלא גם באיכות....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים בבעלי חיים מבוצעים בהתאם למועצה הלאומית לבדיקת ניסויים בבעלי חיים ולסוכנות המנהלית הממלכתית האזורית של דרום פינלנד. במחקר זה נעשה שימוש בעכברי C57BL/6JOlaHsd זכרים (בני 4-6 חודשים). הסכמה לשימוש בקווי תאים אנושיים התקבלה מוועדת האתיקה המוסדית של אוניברסיטת הלסינקי.
1. נשימה ברזולוציה גבוהה: מד נשימה מבוסס תא (cHRR)
הערה: הניסויים בחלק זה של הפרוטוקול בוצעו באמצעות Oroboros O2k-Core: Oxygraph-2k (טבלת חומרים)
- כיול חיישני חמצן
- קדם-הפעלה של מדים ב-37 מעלות צלזיוס ב-2.1 מ"ל של מדיום נשימה מיטוכונדריאלי (MiR05, טבלה 1, מקדם מסיסות: 0.92) ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כאן אנו מספקים פרוטוקולים לקביעת הביו-אנרגיה המיטוכונדרית בתאים אאוקריוטים, רקמה לא סיבית (למשל, המוח הקטן) ורקמה סיבית (למשל, שרירי השלד). עבור תאים אאוקריוטים, HEK293 עם נוקאאוט מהונדס קריספר של שני חלבונים שונים הקשורים לתרגום מיטוכונדריאלי וכתוצאה מכך מרובים (CRISPRKO1) ומחסור חמור/שלם ב-OXPHOS (CRISPRKO2) נמדדו באמצעות cHRR (איור 3A-C) או mHRR (איור 3A-D).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
באופן מסורתי, ביו-אנרגיה מיטוכונדריאלית נחקרה עם אלקטרודות חמצן מסוג קלארק. עם זאת, היעדר פתרון ותפוקה מוצדקים להתקדמות טכנולוגית. עד כה, O2k (המכונה cHRR) ו- Seahorse XF96 Flux Analyzer (המכונה mHRR) אומצו באופן נרחב בתחום הביו-אנרגיה התאית. כאן, אנו מציגים אוסף מובן של פרוטוקולים לניתוח חילוף החומרים של האנרגיה התאית באמצעות הערכה של נשימה מיטוכונדריאלית באמצעות cHRR או mHRR, דנים ביתרונות העיקריים של כל מכשיר ומספקים הדרכה מעשית. הפרוטוקולים המובאים כאן כוללים תאי יונקים, רקמות סיביות (קשות) כגון שרירי השלד והלב, ורקמ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגוד עניינים לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מימון מהאקדמיה של פינלנד (C.B.J), קרן מגנוס ארנרוט (C.B.J), ומלגת דוקטורט של בית הספר המשולב למדעי החיים (R.A.).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 2 מ"ל Potter-Elvehjem זכוכית/PTFE מטחנת רקמות/הומוגנייזר | Omni International | 07-358029 | |
| 95% O2, 5% CO2 תערובת | פוטר לטחינת רקמות | ||
| ADP | Sigma | A 4386 | |
| Antimycin A | Sigma | A 8674 | |
| Chemical Ascorbate | Merck | כימיקל PHR1279-1G | , מתמוסס באתנול |
| BSA (נטול דוכנים שומניים) | Sigma | A 6003 | כימי |
| CaCO3 | Sigma | C 4830 | כימי |
| ציטוכרום c | Sigma | C 7752 | כימי |
| דיגיטונין | סיגמא | D 5628 | כימי |
| דיתיותרייטול | סיגמא | D 0632 | כימי, להתמוסס ב-DMSO |
| D-Sucrose | Roth | 4621.1 | Chemical |
| Dulbecco' s שונה Eagle' s בינוני (גלוקוז גבוה) | Fisher Scientific | 41965-039 | Chemical |
| Dulbecco' s שונה Eagle' s בינוני (ללא גלוקוז) | פישר סיינטיפיק | A14430-01 | |
| EGTA | Sigma | E 4378 | |
| אטומוקסיר | סיגמא | E1905 | בז כימי |
| 15 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים | פישר סיינטיפיק | AM12500 | כימי |
| 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים | פישר סיינטיפיק | AM12501 | |
| FCCP | סיגמא | C 2920 | |
| גלוקוז | סיגמא | G7021 | כימי, מתמוסס באתנול |
| גלוטמט | סיגמא | G 1626 | כימיקל |
| GlutaMax ( פי 100) (200 ננומטרים L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Fisher Scientific | 35050061 | |
| תאי HEK293 כימיים | ATTC | CRL-1573 | |
| המוציטומטר | Fisher Scientific | 0267151B | מכשיר לספירת תאים |
| Hepes | Sigma | H 7523 | כימי |
| אימידזול | פלוקה | 56750 | כימי |
| KCl | Merck | 1.04936 | כימי |
| L-קרניטין | סיגמא | C0283 | כימי |
| מלאט | סיגמא | M 1000 | כימי |
| MES הידראט | סיגמא | M8250 | כימי |
| MgCl<תת>2 | סיגמא | M 9272 | כימי |
| Na2ATP | סיגמא | A 2383 | כימי |
| Na2פוספוקריאטין | סיגמא | P 7936 | כימי |
| Na-pyruvate ( 100 מ"מ) (פי 100) | פישר סיינטיפיק | 11360070 | |
| NEAA ( חומצות אמינו לא חיוניות) 100x | Fisher Scientific | 11140035 | |
| FBS רגיל ( 10x) | Fisher Scientific | 10500064 | |
| O2k-core: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | מכשיר רספירומטריה ברזולוציה גבוהה |
| O2k-טיטרציה סט | Oroboros Instruments | 20820-03 | מזרקי המילטון להזרקות כימיות |
| Oligomycin | Sigma | O 4876 | כימי, מתמוססים באתנול |
| פלמיטוילקרניטין | סיגמא | P 4509 | |
| כימי פניצילין-סטרפטומיצין | פישר סיינטיפיק | 15140122 | |
| ערכת בדיקת חלבון פירס BCA פישר | סיינטיפיק | 23227 | |
| פירובט | סיגמא | P 2256 | כימי |
| RIPA-Buffer | פישר סיינטיפיק | 89900 | רוטנון כימי |
| Sigma | R 8875 | כימיקלים, מתמוססים באתנול | |
| Saponin | Sigma | S7900 | Chemical |
Seahorse XF DMEM assay חבילה בינונית, pH 7.4 | Agilent, סנטה קלרה, CA | 103680-100 | |
| Seahorse XFe96 מנתח שטף חוץ-תאי< | br/> Agilent, סנטה קלרה, קליפורניה | מכשיר רספירומטריה בעל תפוקה גבוהה | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent, Santa Clara, CA | br/> כולל לוחות בדיקה, מחסניות, מדריכי טעינה להעברת תרכובות למחסנית הבדיקה ותמיסת קליברנט. | |
| מספריים קטנים | פישר סיינטיפיק | 08-951-20 | |
| נתרן אזיד | סיגמא | S2002 | כימי |
| סוקסינט | סיגמא | S 2378 | כימי |
| טאורין | סיגמא | T 8691 | כימי |
| TMPD | סיגמא | T 3134 | תמיסה כימית |
| טריפן כחול | Merck | 72-57-1 | כימי |
| טריפסין 0.25% EDTA | פישר סיינטיפיק | 25200056 | |
| שני מלקחיים דקים פישר | סיינטיפיק | 12-000-122 | |
| ציר אורידין (500x) | Sigma | U3750 | כימיקל |
מקורות
- McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: More than just a powerhouse. Current Biology. 16 (14), 551-560 (2006).
- Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. Mitochondrial control of immunity. Beyond ATP. Nature Reviews Immunology. 17 (10), 608-620 (2017).
- Spi....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
