פרוטוקול זה מפרט שיטה משופרת לסינתזה של תשואות גבוהות של חלבונים רקומביננטיים ממערכת תרגום שעתוק ללא תאים (TX-TL) של סטרפטומיצ'ס ונצואלה .
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ערכת כלים לתרגום תמלול סטרפטומיצ'ס בתפוקה גבוהה לביולוגיה סינתטית ויישומי מוצרים טבעיים
במאמר זה
סיכום
תקציר
סטרפטומיצ'ים spp. הם מקור עיקרי של אנטיביוטיקה קלינית וכימיקלים תעשייתיים. סטרפטומיצ'ס ונצואלה ATCC 10712 הוא זן הגדל במהירות ויצרן טבעי של כלורמפניקול, ג'דומיניצין ופיקרומיצין, מה שהופך אותו למועמד אטרקטיבי כשלדה ביולוגית סינתטית מהדור הבא. לכן, כלים גנטיים המאיצים את הפיתוח של S. ונצואלה ATCC 10712, כמו גם מודלים אחרים של סטרפטומיצ'ס spp. , רצויים מאוד להנדסת מוצר טבעי וגילוי. לשם כך, מערכת ייעודית S. venezuelae ATCC 10712 ללא תאים מסופקת בפרוטוקול זה כדי לאפשר ביטוי הטרולוגי בעל תפוקה גבוהה של גנים G+C גבוהים (%) פרוטוקול זה מתאים לתגובות אצווה בקנה מידה קטן (10-100 μL) בתבנית צלחת 96-well או 384-well, בעוד התגובות עשויות להיות מדרגיות. המערכת נטולת התאים חזקה ויכולה להשיג תשואות גבוהות (~5-10 μ M) עבור מגוון חלבונים רקומביננטיים במערך מינימלי. עבודה זו משלבת גם ערכת כלים פלסמידית רחבה למדידה בזמן אמת של mRNA וסינתזת חלבונים, כמו גם כתמי פלואורסצנטיות בג'ל של חלבונים מתויגים. פרוטוקול זה יכול להיות משולב גם עם זרימות עבודה אפיון ביטוי גנים תפוקה גבוהה או המחקר של מסלולי אנזים מ G + C גבוה (%) גנים נוכחים בגנום Actinomycetes.
מבוא
מערכות תרגום תמלול ללא תאים (TX-TL) מספקות פלטפורמת אב-טיפוס אידיאלית לביולוגיה סינתטית ליישום מחזורי תכנון-בנייה-למידה מהירים, מסגרת ההנדסה המושגית לביולוגיה סינתטית1. בנוסף, יש עניין גובר במערכות TX-TL לייצור חלבון רקומביננטי בעל ערך גבוה בסביבה של תגובה פתוחה2, למשל, לשלב חומצות אמינו לא סטנדרטיות בהצמדות נוגדנים-תרופתיות3. באופן ספציפי, TX-TL דורש תמצית תאים, פלסמיד או DNA ליניארי, ופתרון אנרגיה כדי לזרז את סינתזת החלבון בתגובות אצווה או חצי יבשתיות. בעוד Escherichia coli TX-TL היא המערכת הדומיננטית ללא תאים, מספר מערכות TX-TL שאינן מודל המתעוררות משכו תשומת לב עבור יישומים שונים....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: ראה טבלה 1 ושולחן 2 למתכונים עבור צלחת מדיום ואגר GYM ומאגרי S30A ו- S30B.
1. הכנת פתרונות והדרכה כללית
- שמור את כל הפתרונות, תאים (לאחר צמיחה), ותמציות תאים על קרח לאחר ההכנה, אלא אם כן נאמר חריג.
- מלאי חנות עבור 1 M Mg-גלוטמט, 4 M K-גלוטמט, 40% (w / v) PEG 6000, 1 g / mL חומצה פוליווינילסולונית בטמפרטורת החדר, וכל המניות האחרות ב -80 °C (80 °F). מזער את מספר מחזורי ההקפאה כדי למנוע השפלה כימית.
- להכנת מלאי פתרונות אנרגיה (ראה טבלה 3) כגון 3-PGA (דורש התאמת pH), בצע את ההנחיות המופיעות בפרוטוקול E. coli TX-TL41.
הערה: כל....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
פרוטוקול מפורט זה מסופק כדוגמה כדי לסייע למשתמש להקים מערכת Streptomyces TX-TL המבוססת על זן הדגם ATCC 10712 של S. ונצואלה (איור 1). המשתמש עשוי לבקש לחקור זנים אחרים סטרפטומיצ'ס; עם זאת, שלבי הצמיחה/קציר של זנים אחרים עם זמני הכפלה ארוכים יותר או העדפות צמיחה ברורות יצטרכו להיות מותאמים אישית כדי להשיג תוצאות שיא. לקבלת התוצאה הייצוגית, החלבון הפלואורסצנטי mScarlet-I מבית הפלסמיד הסטנדרטי pTU1-A-SP44-mScarlet-I (איור 2
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בכתב יד זה תואר פרוטוקול TX-TL של S. ונצואלה בעל תפוקה גבוהה עם צעדים מפורטים שהם פשוטים לניהול עבור משתמשים מנוסים וחדשים של מערכות TX-TL. מספר תכונות מפרוטוקולי Streptomyces45 ו- E. coli TX-TL41 הקיימים הוסרו כדי ליצור פרוטוקול מינימלי אך בעל תפוקה גבוהה עבור S. venezuelae TX-TL5,26. זרימת העבודה המומלצת כאן היא להבטיח כי S. ונצואלה גדל במהירות במדיום העשיר שנבחר, כדי ל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
המחברים רוצים להכיר בתמיכה המחקרית הבאה: EPSRC [EP/K038648/1] עבור SJM כ- PDRA עם PSF; Wellcome Trust מימנה את מלגת ISSF עבור SJM עם PSF באימפריאל קולג' בלונדון; מענק המחקר של החברה המלכותית [RGS\R1\191186]; פרס Wellcome Trust SEED [217528/Z/Z/19/Z] עבור SJM באוניברסיטת קנט; ומלגת דוקטורט ל-Ph.D. של קרן מחקר האתגרים הגלובליים (GCRF) עבור KC באוניברסיטת קנט.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| בקבוק 2.5 ליטר | UltraYield תומסון | 931136-B | |
| 3-PGA (>93%) | Sigma | P8877 | |
| 384 צלחת תחתונה שחורה/שקופה | ThermoFisher | 10692202 | |
| אמוניום כלוריד (98%) | Fluorochem | 44722 | |
| ATP, CTP, UTP, GTP (תמיסה של 100 מ"מ, >99%)ThermoFisher | R0481 | ||
| קרבניצילין (צור קשר עם ספק לטוהר) | מלפורד | C46000-25.0 | |
| D-(+)-גלוקוז (צור קשר עם הספק לטוהר) | מלפורד | G32040 | |
| DFHBI (≥ 98% - HPLC) | Sigma | SML1627 | |
| DTT (צור קשר עם הספק לטוהר) | Melford | MB1015 | |
| FlAsH-EDT2 (צור קשר עם הספק לטוהר) | Santa Cruz Biotech | sc-363644 | |
| גלוקוז-6-פוספט (>98%) | Sigma | G7879 | |
| חומצה ללא HEPES (צור קשר עם הספק לטוהר) | Melford | B2001 | |
| חומצה L-גלוטמית, מלח המימגנזיום טטרהידרט (>98%) | סיגמא | 49605 | |
| מגנזיום כלוריד (98%) | מאלט 494356 | ||
| סיגמא | 70167-500G | ||
| פוליאתילן גליקול-6000 | סיגמא | 807491 | |
| פירס, צלחת מיקרודיאליזה 96 בארות, 10K MWCO | ThermoFisher | 88260 | |
| פולי (ויניל) סולפט) מלח אשלגן | סיגמא | 271969 | |
| אשלגן גלוטמט (>99%) | סיגמא | G1149 | |
| RTS דוגם חומצות אמינו | 5 פריים | 2401530 | |
| נתרן כלורי (99%) | פלואורוצ'ם | 94554 | |
| Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE עמוד (1 גרם) | 505471 | סיגמא | |
| מלפורד | Y1333 | ||
| <חזק>ציוד | |||
| קורא צלחות | BMG | אומגה |
מקורות
- Carbonell, P., et al. An automated Design-Build-Test-Learn pipeline for enhanced microbial production of fine chemicals. Communications Biology. 1, 66(2018).
- Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
