Method Article

שיטת מיצוי לא מתפרקת לאפיון מבנה מולקולרי של חלקיקי גליקוגן חיידקיים

DOI:

10.3791/63016

⸱

February 18th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioinformatics, School of Medical Informatics and Engineering, Xuzhou Medical University, 2Jiangsu Key Laboratory of New Drug Research and Clinical Pharmacy, School of Pharmacy, Xuzhou Medical University, 3Department of Pharmaceutical Analysis, School of Pharmacy, Xuzhou Medical University, 4Department of Biological Sciences, School of Life Sciences, Xuzhou Medical University, 5School of Chemistry and Molecular Biosciences, The University of Queensland, 6Centre for Nutrition and Food Sciences, Queensland Alliance for Agriculture and Food Innovation, The University of Queensland, 7Joint International Research Laboratory of Agriculture and Agri-Product Safety, College of Agriculture, Yangzhou University, 8State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicines, Macau University of Science and Technology

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מבנה הגליקוגן החיידקי מושפע מאוד משיטות מיצוי שעלולות לגרום לפירוק מולקולרי ו/או דגימה מוטה. חיוני לפתח שיטות למזעור בעיות אלה. כאן, הושוו ארבע שיטות מיצוי באמצעות חלוקת גודל והתפלגות אורך שרשרת כקריטריונים מרכזיים למזעור חפצי מיצוי.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נכון לעכשיו, קיימות מגוון שיטות מיצוי גליקוגן, הפוגעות במבנה המרחבי של הגליקוגן או מחלצות גליקוגן באופן חלקי בלבד, מה שמוביל לאפיון מוטה של המבנה המולקולרי העדין של הגליקוגן. כדי להבין את השינויים הדינמיים של מבני הגליקוגן ואת הפונקציות המגוונות של חלקיקי גליקוגן בחיידקים, חיוני לבודד גליקוגן עם פירוק מינימלי. במחקר זה, מודגמת שיטת בידוד גליקוגן קלה על ידי שימוש במשקעי מים קרים (CW) באמצעות אולטרה-צנטריפוגה בשיפוע צפיפות סוכר (SDGU-CW). השיטה המסורתית של חומצה טריכלורואצטית (TCA) ושיטת אשלגן הידרוקסיד (KOH) בוצעו גם לשם השוואה. זן מעבדה נפוץ, Escherichia coli BL21(DE3), שימש כאורגניזם מודל במחקר זה למטרות הדגמה. לאחר חילוץ חלקיקי גליקוגן בשיטות שונות, המבנים שלהם נותחו והושוו באמצעות כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC) עבור התפלגות גודל החלקיקים ואלקטרופורזה נימית בסיוע פלואורופור (FACE) עבור התפלגות אורך שרשרת ליניארית. הניתוח אישר כי לגליקוגן המופק באמצעות SDGU-CW יש פירוק מינימלי.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גליקוגן הוא פוליסכריד מסועף מאוד המורכב משאריות גלוקוזיל וגם כמות קטנה אך משמעותית של חלבונים, בהם כל שאריות הגלוקוזיל מקושרות זו לזו באמצעות קשרים α-1,4-גליקוזידיים בשרשראות ליניאריות וקשרים α-1,6-גליקוזידיים בנקודות הסתעפות1. המבנה של חלקיקי גליקוגן מחולק בדרך כלל לשלוש היררכיות: 1) אוליגומרים קצרי שרשרת, 2) חלקיקי β כדוריים (בקוטר ~20 ננומטר), ו-3) חלקיקי α גדולים בצורת שושנה המצטברים יחד על ידי חלקיקים β, שקוטרם נע בערך עד 300 ננומטר. לאחרונה נמצא כי לחלקיקי גליקוגן α יש שני מצבים מבניים באיקריוטים, כלומר מצב שביר ומצב יציב. כאן, שבריריות פירושה פירוק של חלקיקי α גדולים יותר לחלקיקי β קטנים יותר בנוכחות גורם כאוטרופי כמו DMSO2. ניתוחים נוספים מצאו כי חלקיקי גליקוגן α בכבד הסוכרתי הם שבירים באופן עקבי3 וחלקיקי α השבריריים מתפרקים הרבה יותר מהר מחלקיקי α יציבים4. לפיכך, שבריריות מבנית של גליקוגן עלולה להחמיר מצבים היפרגליקמיים בסוכרת 2,4, מה שהופך את החלקיק α השביר לסמן ביולוגי פתולוגי פוטנציאלי של סוכרת ברמה המולקולרית. עם זאת, קיומם של חלקיקי גליקוגן α בפרוקריוטים מדווח רק באופן ספורדי5, ואין דיווח על שני מצבים מבניים שונים של חלקיקי גליקוגן α בחיידקים.

על מנת להבין את הפונקציות הפיזיולוגיות של חלקיקי גליקוגן חיידקיים, חיוני לקבוע את המבנה העדין של מולקולות גליקוגן, הדורש בידוד גליקוגן עם תפוקה מקסימלית ופירוק מינימלי1. עד כה פותחו טכניקות שונות למיצוי גליקוגן, כולל אך לא רק מיצוי מים חמים, מיצוי חומצה טריכלורואצטית (TCA) ומיצוי אלקליין חם (אשלגן הידרוקסיד, KOH)6. בנוסף, שיטה נוספת המשמשת בדרך כלל לבידוד גליקוגן אוקריוטי, שיטת שיפוע צפיפות הסוכר אולטרה-צנטריפוגה (SDGU), דווחה גם לבידוד גליקוגן חיידקי ב-Selenomonas ruminantium ו-Fibrobacter succinogenes 7,8. למרות שהיתרונות והחסרונות של שיטות אלה נדונו בהרחבה במחקרים אוקריוטיים 9,10, לעתים רחוקות ישנם מחקרים השוואתיים של מבנים עדינים של גליקוגן המבודדים באמצעות שיטות מיצוי שונות בחיידקים מנקודת המבט של מבני חלקיקי גליקוגן.

במחקר זה, נושא זה טופל על ידי שימוש ב-Escherichia coli BL21(DE3) כאורגניזם המודל. בסך הכל הושוו ארבע שיטות מיצוי גליקוגן, כלומר, מיצוי מים חמים משקעים TCA (TCA-HW), מיצוי מים קרים משקעים TCA (TCA-CW), מיצוי תמיסת KOH חמה 30% (KOH-HW) ומיצוי מים קרים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה בשיפוע צפיפות סוכרוז (SDGU-CW). לאחר מכן נמדדה התפלגות גודל חלקיקי הגליקוגן באמצעות כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC) בעוד שהתפלגות אורך השרשרת זוהתה באמצעות אלקטרופורזה של פחמימות בסיוע פלואורופור (FACE), שניהם שימשו להערכת איכות שיטות המיצוי. בנוסף, היציבות והשבריריות של חלקיקי α גליקוגן חיידקיים הושוו גם בין שיטות המיצוי השונות על ידי השוואת התפלגות גודל החלקיקים לפני ואחרי הטיפול בחומר הכאוטרופי הנפוץ, דימתיל סולפוקסיד (DMSO). הנהלים המפורטים למיצוי גליקוגן ואפיון מבני מוצגים להלן. לסיכום, לשיטת SDGU-CW יש את ההשפעה הכוללת הטובה ביותר מבחינת שלמות מבנית הגליקוגן ולכן היא מומלצת למיצוי גליקוגן חיידקי במחקרים רלוונטיים עתידיים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תרבית ואיסוף חיידקים

  1. להחיות E. coli BL21(DE3) ממאגר גליצרול חיידקי (-80 מעלות צלזיוס) על ידי חיסון צלחת אגר LB סטרילית (10 גרם/ליטר טריפטון, 5 גרם/ליטר תמצית שמרים, 10 גרם/ליטר NaCl ו-15 גרם/ליטר אגר). הכניסו את הצלחת לחממה רגילה וטפחו למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס.
  2. יש להרים מושבה בודדת ולחסן אותה למדיום נוזלי סטרילי של 10 מ"ל (10 גרם/ליטר טריפטון, 5 גרם/ליטר תמצית שמרים ו-10 גרם/ליטר NaCl). יש לערבב היטב באמצעות מערבולת ותרבית למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-220 סל"ד.
    הערה: אלא אם צוין אחרת, כל תנאי התרבית הנוזלית היו 37 מעלות צלזיוס עם קצב טלטול של 220 סל"ד.
  3. העבירו 1 מ"ל מתרבית E. coli הלילה ל-100 מ"ל של מדיום נוזלי LB סטרילי ותרבית למשך 5 שעות. העבירו 50 מ"ל ל-1 ליטר של 1x M9 בינוני מינימלי (3 גרם/ליטר KH2PO4, 0.5 גרם/ליטר NaCl, 6.78 גרם/ליטר Na2HPO4 ו-1 גרם/ליטר NH4Cl) המכיל 0.8% D-(+)-גלוקוז. מערבבים היטב ומרבטים במשך 20 שעות.
    הערה: 1x M9 מדיום מינימלי וגלוקוז עוקרו בנפרד ולאחר מכן עורבבו בעת קירור לטמפרטורת החדר באופן אספטי.
  4. לאחר תרבית של 20 שעות, תמיסת חיידקי צנטריפוגה ב-6,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט. אחסן את כדור התא בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך הלילה ולאחר מכן יבש בהקפאה את הגלולה.
  5. אטמו ואחסנו את אבקת החיידקים הליופילית במקרר (-20 מעלות צלזיוס) לשימוש מאוחר יותר.

2. מיצוי גליקוגן

  1. מיצוי מים חמים עם חומצה טריכלורואצטית (TCA-HW)
    1. שקלו במדויק 500 מ"ג של אבקת E. coli BL21 (DE3) מיובשת בהקפאה והשעו אותה מחדש ב-20 מ"ל של מאגר טריאתנולאמין (TEA) קר כקרח. השתמש במגרסה תאים אולטראסונית (25% אנרגיה, 4 מעלות צלזיוס) כדי לשבש תאי חיידקים למשך 3 דקות (מחזורי עבודה של 30 שניות ומרווחים של 2 שניות). ודא שאין כדורים ברורים בתמיסה.
      הערה: שיבוש התאים בוצע על הקרח. התאימו את ה-pH של מאגר ה-TEA ל-pH 7 על ידי הוספת HCl ואחסנו בטמפרטורת החדר.
    2. העבירו את כל ההומוגנט החיידקי לשני צינורות אולטרה-צנטריפוגה של 10.4 מ"ל (10 מ"ל / צינור). מלאו את הצינורות במים נטולי יונים למעלה, וצנטריפוגה ב-104,000 x גרם באולטרה-צנטריפוגה ב-4 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות. השליכו את הסופרנטנט.
    3. הוסף 2 מ"ל מים נטולי יונים כדי להשעות מחדש את הגלולה בכל צינור. מעבירים את המתלים לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל ומוסיפים מים נטולי יונים לנפח סופי של 20 מ"ל. מחממים ומרתיחים במשך 5 דקות כדי לנטרל את כל החלבונים.
    4. צנטריפוגה את המתלים למשך 10 דקות ב-18,000 x g ושמרו על הסופרנטנט (S1). התייחס למשקעים באותו אופן כמו בשלב 2.1.3. צרף את הסופרנטנט החדש (S2) עם S1.
    5. הוסף 50% TCA (נפח 0.1) לסופרנטנט (S1+S2) והניח את התערובת על קרח למשך 10 דקות כדי לזרז מקרומולקולות כגון DNA, RNA, חלבונים וכו'. צנטריפוגה את התערובת ב-18,000 x גרם למשך 10 דקות וערבבו את הסופרנטנט עם נפח 1.5 של אתנול מוחלט.
      הערה: ריכוז ה-TCA הוא 50% v/v. לאחסון, הרחק אותו מאור.
    6. זרז גליקוגן על קרח למשך 20 דקות וצנטריפוגה ב-18,000 x גרם למשך 10 דקות. שפכו את הסופרנטנט.
    7. ממיסים את הגלולה ב-5 מ"ל של ddH2O, ולאחר מכן מוסיפים 5 מ"ל אתנול מוחלט קר כקרח. דגרו את התמיסה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס וצנטריפוגה ב-18,000 x גרם למשך 10 דקות. השליכו את הסופרנטנט ושמרו את הגלולה.
    8. חזור על שלבי "שטיפה ומשקעים" כמו בשלב 2.1.7 פעמיים נוספות.
    9. לבסוף, ממיסים את הגליקוגן המשקע ב-400 מיקרוליטר של ddH2O בשפופרת של 2 מ"ל, מקפיאים מראש ב-80 מעלות צלזיוס, ומייבשים בהקפאה לקבלת אבקת גליקוגן יבשה.
  2. מיצוי מים קרים עם חומצה טריכלורואצטית (TCA-CW)
    הערה: שיטת TCA-CW זהה לשיטת TCA-HW אלא שלאחר השלכת הסופרנטנט, יש לטפל בגלולה ללא רתיחה (ראה שלב 2.1.3) ולהשעות אותה מחדש ב-20 מ"ל של ddH2O המכיל קוקטייל מעכב פרוטאז של 1 מ"ג/מ"ל.
    1. להכנת תמיסת קוקטייל מעכב פרוטאז של 1 מ"ג/מ"ל, ממיסים 50 מ"ג קוקטייל מעכב פרוטאז ב-1 מ"ל מים נטולי יונים ומדללים ביחס של 50:1 (מים נטולי יונים: תמיסת קוקטייל מעכב פרוטאז).
  3. מיצוי מים קרים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה של שיפוע צפיפות סוכרוז (SDGU-CW)
    1. ממיסים והומוגניזציה של 1 גרם אבקת E. coli מיובשת בהקפאה ב-4 מ"ל של מאגר מיצוי גליקוגן (GEB) עם קוקטייל מעכב פרוטאז של 1 מ"ג/מ"ל.
      הערה: GEB מורכב מ-50 מ"מ טריס, 150 מ"מ NaCl, 2 מ"מ EDTA, 50 מ"מ NaF ו-5 מ"מ נתרן פירופוספט. יש להתאים את GEB ל-pH 8 עם HCl.
    2. השתמש במגרסה תאים אולטראסונית (25% אנרגיה, 4 מעלות צלזיוס) כדי לשבש תאי חיידקים למשך 3 דקות (מחזורי עבודה של 8 שניות ומרווחים של 9 שניות). ודא שכל התהליך מתבצע על הקרח. לאחר הסוניפיקציה, העבירו את ההומוגנט החיידקי לצינור צנטריפוגה, מלאו אותו ב-GEB לנפח סופי של 10 מ"ל, ומערבלו את הצינור לערבוב.
      הערה: אין לבצע הומוגניזציה במשך זמן רב מדי מכיוון שהחום שנוצר עלול לפגוע בגליקוגן.
    3. צנטריפוגה ב-6,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. העבירו את הסופרנטנט לצינור אולטרה-צנטריפוגה של 10.4 מ"ל, מלאו את הצינור למעלה ב-GEB, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-360,000 x גרם למשך שעתיים ב-4 מעלות צלזיוס.
      הערה: ודא שהצינור מלא ואין בועות אוויר.
    4. השליכו את הסופרנטנט לאחר הצנטריפוגה והשעו את המשקעים עם 2 מ"ל מים נטולי יונים.
    5. בצינור אולטרה-צנטריפוגה חדש, שכבה איטית של 4 מ"ל של תמיסת סוכרוז 75% עם 4 מ"ל של תמיסת סוכרוז 37.5%. לאחר מכן, שכבו את התרחיף שהתקבל בשלב 2.3.4 על גבי תמיסת הסוכרוז, ומלאו במים נטולי יונים (ראה איור 1).
      הערה: ריכוז הסוכרוז הוא 75% [v/v] ו-37.5% [v/v]. היזהר בעת ביצוע שיפוע צפיפות הסוכרוז וודא שיש שכבות ניכרות בין שתי תמיסות הסוכרוז. כמו כן, ודא שאין בועות אוויר בצינור האולטרה-צנטריפוגה.
    6. צנטריפוגה ב-360,000 x גרם למשך 2.5 שעות ב-4 מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנטנט. ממיסים את הגלולה ב -200 מיקרוליטר מים נטולי יונים. הוסף 800 מיקרוליטר אתנול מוחלט למשקעי גליקוגן.
    7. זרז גליקוגן ב-20 מעלות צלזיוס למשך הלילה. צנטריפוגה ב-4,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנטנט.
    8. ממיסים את הגלולה המתקבלת ב-400 מיקרוליטר של ddH2O בצינור של 2 מ"ל, מקפיאים מראש ב-80 מעלות צלזיוס, ומייבשים בהקפאה לקבלת אבקת גליקוגן יבשה. שמור על אבקת גליקוגן יבשה ב-4 מעלות צלזיוס לניתוח מבני.
      הערה: הנוהל המפורט מתואר באיור 1.
  4. מיצוי תמיסת אשלגן הידרוקסיד חם 30% (KOH-HW)
    1. מרתיחים אבקת E. coli מיובשת בהקפאה (50 מ"ג) ב-1 מ"ל של 30% [w/v] KOH למשך שעה.
    2. הוסף 67% [v/v] אתנול המכיל 15 מ"מ LiCl למשקעים ב-20 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות. צנטריפוגה את הדגימות ב-16,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
      הערה: 67% [v/v] אתנול עם 15 מ"מ LiCl מכיל 0.6358 גרם LiCl, 67 מ"ל אתנול מוחלט ו-33 מ"ל מים נטולי יונים.
    3. ממיסים מחדש את הכדורים ב-1 מ"ל של ddH2O ומחממים למשך 10 דקות ב-95 מעלות צלזיוס עם תסיסה לסירוגין.
    4. חזור על שלב משקעי האתנול שלוש פעמים נוספות כמתואר בשלב 2.4.2. ממיסים מחדש את הגלולה הסופית ב-400 מיקרוליטר של ddH2O בשפופרת של 2 מ"ל, מקפיאים מראש ב-80 מעלות צלזיוס ומייבשים בהקפאה לקבלת אבקת גליקוגן יבשה.

3. קביעת מבנה גליקוגן

  1. מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM)
    1. יש להשהות מחדש את אבקת הגליקוגן בתמיסת מלח עם 50 מ"מ Tris-buffered (pH 7) עם ריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל.
    2. בצע דילול פי 10 של המתלה והחל את המתלה המדולל על רשת הנחושת בעלת 400 הרשת.
    3. לאחר 2 דקות, משוך את הדגימה העודפת מהרשת באמצעות נייר סינון וצבוע את הרשת ב-2-3 טיפות של 1% אורניל אצטט.
    4. השתמש במיקרוסקופ אלקטרונים שידור הפועל ב-75 קילו וולט כדי לבחון את התכשירים.
  2. כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC)
    1. הכנת שלב נייד: הכינו תמיסות נתרן אזיד 0.02% (w/w) ו-50 מ"מ נתרן חנקתי במים נטולי יונים, וסננו דרך קרום סינון של 0.45 מיקרומטר. השתמש באמבט המים המתנודד האולטראסוני כדי לסוניזציה של התמיסה למשך יותר מ-15 דקות כדי להסיר בועות אוויר.
    2. הכנת דגימה: השתמש בשלב הנייד כדי להמיס אבקת גליקוגן כך שהריכוז הסופי יהיה 1 מ"ג/מ"ל. דגרו את התמיסה בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך הלילה בתרמו-מיקסר. צנטריפוגה את הדגימה המומסת ב-6,000 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ומעבירה את הסופרנטנט לבקבוקון SEC סטנדרטי.
    3. הכנת דגימות גליקוגן שטופלו ב-DMSO
      1. ממיסים 1 מ"ג של אבקת גליקוגן ב-300 מיקרוליטר של DMSO ומדגרים אותה ב-80 מעלות צלזיוס למשך הלילה בתרמו-מיקסר. הוסף פי 4 נפח אתנול כדי לזרז גליקוגן וצנטריפוגה את התמיסה ב-6,000 x גרם.
      2. שוטפים את הגלולה פעמיים עם אתנול, ממיסים את הכדור ב-ddH2O וליופיליזציה.
      3. נתח את אבקת הגליקוגן המיובשת בהקפאה באמצעות SEC על ידי הכנת דגימות כמתואר לעיל.
    4. השתמש במערכת SEC עם עמודות מוקדמות, ועמודות 1000 ו-10000 לניתוח התפלגות גודל חלקיקי הגליקוגן. שמור על העמודות על 80 מעלות צלזיוס וקצב הזרימה על 0.3 מ"ל לדקה.
  3. אלקטרופורזה של פחמימות בסיוע פלואורופור (FACE)
    1. הסתעפות גליקוגן
      הערה: בעת שימוש ב-FACE כדי לזהות התפלגות אורך שרשרת (CLD), כל הדגימות שייבדקו צריכות לעבור טיפול מקדים של הסתעפות.
      1. הוסף למבחנה 0.5 מ"ג אבקת גליקוגן, 90 מיקרוליטר מים חמים (90 מעלות צלזיוס), 1.5 מיקרוליטר תמיסת NaN3 , 3.5 מיקרוליטר איזועמילאז (200 U/mL) ו-8 מיקרוליטר חומצה אצטית-נתרן אצטט (pH 3.5).
        הערה: איזועמילאז מתווסף כדי לחתוך באופן ספציפי את השרשרת המסועפת של הדגימה לבדיקה. איזואמילאז הוא אנזים מסתעף שיכול להרוס באופן ספציפי את הקשר α-(1-6) מבלי להרוס את הקשר α-(1-4), כך שהוא יכול לבקע באופן ספציפי את שרשרת הצד של הגליקוגן מבלי להרוס את מבנה השרשרת הראשית.
      2. דגרו את התערובת בחום של 37 מעלות למשך 3 שעות בתרמו-מיקסר. לאחר הפיכת ה-pH לניטרלי עם 8 מיקרוליטר של תמיסת NaOH של 0.1 M, דגרו את התערובת ב-80 מעלות צלזיוס למשך שעה בתרמו-מיקסר.
      3. הוסף נפח פי 4 של אתנול מוחלט לתערובת כדי לזרז גליקוגן. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 6,000 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. שוטפים את הגלולה פעמיים עם אתנול, ממיסים את הגלולה ל-ddH2O ועושים ליופיליזציה.
    2. הכנת תמיסת פלורסנט
      1. צנטריפוגה בקבוק המגיב APTS (8-Aminopyrene-1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt) (כל בקבוק מכיל 5 מ"ג APTS) ב-4,000 x g למשך 2 דקות. הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת חומצה אצטית 15% כדי להמיס את האבקה, לערבב היטב ולצנטריפוגה ב-4,000 x גרם למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר כדי לקבל תמיסת חומצה אצטית של 0.2 M APTS.
        הערה: שמור את תמיסת ה-APTS במקרר בטמפרטורה של -20 מעלות C.It יש להשתמש בה לחלוטין תוך שבועיים לאחר הפתיחה. אחרת, הוא יושבת. APTS הוא צבע נפוץ בעל מטען שלילי שנקשר לקצה המפחית של שרשרת הגליקוגן. מכיוון שהשרשראות בעלות דרגות פילמור שונות (DP) נושאות כולן מטען שלילי אחד בלבד, FACE יכול להפריד ביניהן על סמך יחסי המסה למטען השונים שלהן. באופן זה, אותות של ערכי DP שונים מתגלים על ידי גלאי הקרינה.
    3. העבירו את הגליקוגן המסועף למבחנה והוסיפו 1.5 מיקרוליטר של תמיסת APTS ו-1.5 מיקרוליטר של תמיסת נתרן ציאנובורוהידריד. דגירה בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך שעה וחצי בחושך. הוסף 80 מיקרוליטר מים נטולי יונים, צנטריפוגה ב -4,000 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ושמור על הסופרנטנט.
    4. הכנס את הדגימה למערכת האלקטרופורזה הנימים על ידי הזרקה למשך 3 שניות ב-0.5 psi (3.4 kPa מעל הלחץ האטמוספרי).
      הערה: גלוקנים ליניאריים בעלי תווית פלואורסצנטית הופרדו באמצעות מתח מופעל של 30 קילו וולט וזרם משוער של 14 mA ב-25 מעלות צלזיוס. אזורי השיא נתנו כמויות יחסיות של גלוקנים עם מסות שונות (דרגת פילמור (DP) של גלוקנים בפסגות סמוכות הייתה שונה ב-1 DP). טמפרטורת הדגימה נשמרה על 18 מעלות צלזיוס.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התפלגות גודל של חלקיקי גליקוגן
סדרה של מחקרים הראתה כי חלקיקי α הגליקוגן בכבד הסוכרתי הם שבירים ומתפרקים בקלות במשבש קשרי המימן DMSO 11,12,13,14. המחקר הנוכחי בדק כיצד גודל החלקיקים והיציבות המבנית השתנו עבור גליקוגן חיידקי המופק בארבע שיטות שונות. כל דגימות הגליקוגן מארבע השיטות טופלו במים (עקומות כחולות) ו-DMSO (עקומות אדומות), בהתאמה. התפלגות המשקל, w(logR

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גליקוגן הוא מאגר אנרגיה חשוב שזוהה בחיידקים רבים16. כדי לנתח את הפונקציות הפיזיולוגיות של חלקיקי גליקוגן, חיוני להבין טוב יותר את המבנה העדין של מולקולות גליקוגן. עד כה פותחו מגוון שיטות להפקת גליקוגן מתרבית חיידקים. עם זאת, התפלגות גודל שונה של חלקיקי גליקוגן נצפו משיטות מיצוי שונות, מה שמרמז על מבנה גליקוגן פגום. לפיכך, יש צורך להשוות ולתקנן הליכי מיצוי על מנת לוודא שמבני גליקוגן ממחקרים שונים ניתנים להשוואה. במחקר זה מוצג פרוטוקול מפורט המתאר ארבע שיטות נפוצות ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו אסירי תודה לפרופסור רוברט ג. גילברט מאוניברסיטת קווינסלנד ואוניברסיטת יאנגג'ואו שסיפק תובנות ומומחיות שסייעו רבות להשלמת מחקר זה. אנו מכירים בתמיכה הכספית של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס' 31900022, מס' 32171281), הקרן למדעי הטבע של מחוז ג'יאנגסו (מס. BK20180997), צוות החדשנות המדעית והטכנולוגית הצעיר של האוניברסיטה הרפואית שוז'ו (No. TD202001), ופרויקט ג'יאנגסו צ'ינגלאן (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<חזק>ציוד
Agilent 1260 אינסוף SEC מערכתAgilent1260 אינסוף IIהתפלגות גודל החלקיקים
עמודה אנליטיתPSS10-1000-צנטריפוגה
Eppendorf5420-ממברנת
פילטרCambioKm-0220-
מערכת אלקטרופורזה נימית בסיוע פלואורסצנטיבקמןחלוקת אורך שרשרת
מייבש הקפאהXinzhiSCIENTZ-10Nליופיליזציה של חיידקים וגליקוגן
מקפיאתרמו פישרפורמה 900אחסון דגימות
עמוד משמרPSSSUPPERMA-חממה
תרמו פישרPR505750R-CN-
צנטריפוגה במהירות נמוכה בעלת קיבולת גדולהHexiHR / T20MMצנטריפוגה לדוגמא
Multiskan FC קורא מיקרופלייטתרמו פישר1410101-אופטימה
XPN אולטרה-צנטריפוגהבקמןXPN-100/90/80גליקוגן
XinbaoSHZ-82-PA-800
פלוס מערכתבקמן קולטרA66528-מד
pHמטלר טולדוFE28 -TRIS-גלאי
אינדקס שבירהWyattOptilab T-rEX-מקרר
HaierBCD-406WDPD-Thermomixer
שנחאי JingxinJXH-100דגירה לדוגמא
שידור מיקרוסקופ אלקטרוניםHitachi CorporationH-7000מורפולוגיה של חלקיקי גליקוגן
צינור אולטרה-צנטריפוגהבקמן
355651-מגרסת תאים אולטרסאונדNingbo XinzhiScientz-IID  חיידקים משבש
אמבט מים מתנודד אולטרסאונדJietuoJT-1027HTD-מערבולת
מערבלTiangenOSE-VX-01-מערכת
מיםMerck MilliporeH2O-MM-UV-Tמים נטולי יונים
<>חומר חזק
8-אמינופירן-1,3,6-חומצה טריסולפונית מלח טריסודיוםסיגמא-אולדריץ'196504-57-1-אתנול
אבסולוטיגואויאו10009228-אגר
אבקת SolarbioA1890-אלפא-עמילאז
מגה-זיםE-BLAAM-40ML-עמילוגלוקוזידאז
מגה-זיםE-AMGDF-40ML-cOmplete
MiniRoche4693159001-D
- (+)ערכת בדיקת גלוקוזסיגמא-אולדריץG8270-1kg-D-גלוקוז
(פורמט GOPOD)MegazymeK-GLUCגליקוגן
כימות דימתיל סולפוקסידVicmedVic147חומר כאוטרופי
E. coli BL21(DE3)TiangenCB105-02-אתילן
דיאמין טטרה-חומצה אצטיתVicmedVic1488-
חומצה אצטית קרחוניתGuoyao
10000218-גליצרולGuoyao10010618אחסון חיידקים
חומצה הידרוכלוריתGuoyao
10011008-הידרוקסימתיל אמינומתאןסיגמא-אולדריץ'V900483-500
MegaZyme9067-73-6ענף גליקוגן
ליתיום כלורידסיגמא-אולדריץ'62476-100גרם-M9
, מינימום מלחים, 5 פעמים;Sigma-AldrichM6030-1kgתרבית חיידקים
אשלגן הידרוקסידGuoyao10017008-Pullulan
StandardPSS-
נתרן אצטט טריהידראטGuoyao10018718-נתרן
אזידסיגמא-אולדריץ'26628-22-8-נתרן
כלוריGuoyao10019318חיידקי תרבית
נתרן ציאנובורוהידרידHuaweiruikehws001297-נתרן
דיפוספטסיגמא-אולדריץ'71515-250גרם-נתרן
פלואורידמקליןS817988-250 גרם-נתרן
הידרוקסידגואויאו10019762-נתרן
חנקתיגואויאו10019928-נתרן
פירופוספטסיגמא-אולדריץ'V900195-500גרם-סוכרוז
גואויאו
10021463-חומצה טריכלורואצטיתגואויאו40091961-טריפטון
אוקסואידLP0042תרבית חיידקים
תמצית שמריםאוקסואידLP0021תרבית חיידקים
קולטר עבור מתנד ' גרם-איזועמילאז

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, L., et al. Molecular structure of glycogen in Escherichia coli. Biomacromolecules. 20 (7), 2821-2829 (2019).
  2. Deng, B., et al. Molecular structure of glycogen in diabetic liver. Glycoconjugate Journal. 32 (3-4), 113-118 (2015).
  3. Hu, Z., et al. Diurnal changes of glycogen molecular structure in healthy and diabetic mice. Carbohydrate Polymers. 185, 145-152 (2018).
  4. Nawaz, A., Zhang, P., Li, E., Gilbert, R. G., Sullivan, M. A. The importance of glycogen molecular structure for blood glucose control. iScience. 24 (1), 101953(2021).
  5. Rashid, A. M., et al. Assembly of α-glucan by GlgE and GlgB in mycobacteria and streptomycetes. Biochemistry. 55 (23), 3270-3284 (2016).
  6. Wang, L., et al. Recent progress in the structure of glycogen serving as a durable energy reserve in bacteria. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 36 (1), 14(2020).
  7. Kamio, Y., Terawaki, Y., Nakajima, T., Matsuda, K. Structure of glycogen produced by Selenomonas ruminantium. Agricultural and Biological Chemistry. 45 (1), 209-216 (1981).
  8. Gong, J., Forsberg, C. W. Separation of outer and cytoplasmic membranes of Fibrobacter succinogenes and membrane and glycogen granule locations of glycanases and cellobiase. Journal of Bacteriology. 175 (21), 6810-6821 (1993).
  9. Mojibi, N. Comparison of methods to assay liver glycogen fractions: the effects of starvation. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 11 (3), (2017).
  10. Orrell, S. A., Bueding, E. A comparison of products obtained by various procedures used for the extraction of glycogen. The Journal of Biological Chemistry. 239, 4021-4026 (1964).
  11. Tan, X., et al. Proteomic investigation of the binding agent between liver glycogen beta particles. ACS Omega. 3 (4), 3640-3645 (2018).
  12. Hu, Z., et al. Diurnal changes of glycogen molecular structure in healthy and diabetic mice. Carbohydrate Polymers. 185, 145-152 (2018).
  13. Sullivan, M. A., Harcourt, B. E., Xu, P., Forbes, J. M., Gilbert, R. G. Impairment of liver glycogen storage in the db/db animal model of type 2 diabetes: a potential target for future therapeutics. Current Drug Targets. 16 (10), 1088-1093 (2015).
  14. Deng, B., et al. Molecular structure of glycogen in diabetic liver. Glycoconjugate Journal. 32 (3-4), 113-118 (2015).
  15. Sullivan, M. A., et al. Molecular structural differences between type-2-diabetic and healthy glycogen. Biomacromolecules. 12 (6), 1983-1986 (2011).
  16. Wang, L., et al. Systematic analysis of metabolic pathway distributions of bacterial energy reserves. G3 Genes|Genomes|Genetics. 9 (8), 2489-2496 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Glycogen ExtractionBacterial GlycogenMolecular Structure CharacterizationCold Water PrecipitationSugar Density GradientUltracentrifugationEscherichia ColiSize Exclusion ChromatographyCapillary ElectrophoresisGlycogen Particle Isolation
Video Coming Soon

Related Articles