ממשקי הידרוג'ל הניתנים לצילום להקרנת חיידקים, בחירה ובידוד

Summary

השימוש הידרוג'לים פוטו-הדרגתיים כדי לבודד תאים חיידקיים על ידי שימוש בכלי טפיחה אור ברזולוציה גבוהה מדווח. נהלים ניסיוניים חיוניים, תוצאות ויתרונות של התהליך נבדקים. השיטה מאפשרת בידוד מהיר וזול של חיידקים ממוקדים המציגים פונקציות נדירות או ייחודיות מקהילות או אוכלוסיות הטרוגניות.

Abstract

ביולוגים מנסים זה זמן רב להבין את הקשר בין פנוטיפ לגנוטיפ. כדי להבין טוב יותר את הקשר הזה, חיוני לפתח טכנולוגיות מעשיות המקשרות סינון תאים מיקרוסקופיים עם בידוד תאים בטוהר גבוה לניתוח גנטי במורד הזרם. כאן, השימוש של פולי (אתילן גליקול) hydrogels photodegradable להקרנה ובידוד של חיידקים עם פנוטיפים צמיחה ייחודיים מאוכלוסיות תאים הטרוגניים מתואר. השיטה מסתמכת על אנקפסולציה או לכידה של תאים עם הידרוג'ל, ואחריו תרבית, סינון מיקרוסקופי, ולאחר מכן שימוש בכלי דפוס אור ברזולוציה גבוהה לשליטה spatiotemporal של השפלת הידרוג'ל ושחרור של תאים נבחרים לתוך פתרון לאחזור. החלת דפוסי אור שונים מאפשרת שליטה על המורפולוגיה של התא שחולץ, ודפוסים כגון טבעות או צלבים יכולים לשמש כדי לאחזר תאים עם חשיפה אור UV ישיר מינימלי כדי להקל על נזק DNA לבודדים. יתר על כן, כלי דפוס האור מספק מינון אור מתכוונן כדי להשיג השפלה שונים ושיעורי שחרור תאים. זה מאפשר השפלה ברזולוציה גבוהה, המאפשר אחזור תאים עם דיוק מרחבי בקנה מידה מיקרון. כאן, השימוש בחומר זה כדי לסנן ולאחזר חיידקים הן הידרוג'ל בתפזורת והן ממכשירי מעבדה על שבב microfabricated הוא הודגם. השיטה זולה, פשוטה, וניתן להשתמש בה ליישומים נפוצים ומתפתחים במיקרוביולוגיה, כולל בידוד של זני חיידקים עם פרופילי צמיחה נדירים מספריות מוטנטיות ובידוד של קונסורציום חיידקי עם פנוטיפים מתפתחים לאפיונים גנומיים.

Introduction

בידוד תאים עם התנהגויות ייחודיות מסביבה מורכבת והטרוגנית הוא בסיסי להשגת מידע גנטי בביולוגיה¹. במיקרוביולוגיה, הבחירה והבידוד של חיידקים נדירים או ייחודיים לאחר התצפית הופכים חשובים ביישומים רבים הדורשים קשר בין מידע גנומי למידע פנוטיפי נצפה. יישומים אלה כוללים בחירת זנים נדירים פנוטיפיקיים מספריות מוטנטיות², בחירת מיקרואורגניזמים keystone מקהילות מיקרוביות מורכבות^3,4, ובחירת חיידקים נדירים פנוטיפיים אך חשובים מאוכלוסיות איזוגניות. בידוד של תאים קיימא אך לא תרבותיים (VBNC) מאוכלוסיית חיידקים הוא דוגמה חשובה של האחרון, שבו תאים עם פנוטיפ VBNC מוסתרים לעתים קרובות באוכלוסיות חיידקים ב 1:10² עד 1:10⁵ יחסים^5,6. בשל הקשיים הנרחבים בבידוד חיידקים, הרבה עדיין לא ידוע על מיקרואורגניזמים נדירים פנוטיפיים רבים. מגבלות אלה מדגישות את הצורך בטכניקות בידוד תאים כדי לזהות תחילה את תא היעד או התאים מתערובת ולאחר מכן לאחזר ולבודד אותם לניתוח מולקולרי במורד הזרם⁷.

חלק מהשיטות הנפוצות ביותר לבידוד תאים כוללות ציטומטריית זרימה ומיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS)⁸, הפרדה אימונומית^9,10,ומיקרופלואידיקה¹¹. בעוד שיטות בידוד אלה יש ערך גבוה, יש להם גם חסרונות המגבילים את השימוש בהם. לדוגמה, FACS יכול לספק בידוד מיקרוביאלי שגרתי ברמת תא אחד לניתוח גנומי מעקב^3, אך לעתים קרובות מוגבל על ידי הזמינות וההוצאות שלו, כמו גם בעיות זיהום במורד הזרם¹¹. גישות מבוססות מיקרופלואידיות כגון ציטומטריית זרימה מיקרופלואידית זכו לתשומת לב רבה, אשר, בהשוואה לציטומטריית זרימה קונבנציונלית, מאפשרת ירידה משמעותית בנפח המדגם הנדרש¹². עם זאת, הפרדה ואחזור של אוספים בודדים או קטנים של תאים ממכשירים מיקרופלואידיים היא לעתים קרובות בעיה מאתגרת שבדרך כלל דורשת התקנה מורכבת יותר ועיצוב המכשיר¹³. גישות מבוססות מיקרופלואידיות רבות מאפיינות תאים גנטית לפני שהם נקלטים ונצפתם במכשיר¹⁴, הגבלת מספר המינים הייחודיים שנצפו בעת ביצוע מסך פונקציונלי. בהתחשב במגבלות אלה, נדרשת חדשנות נוספת של שיטות וחומרים מעשיים לבדיקת תאים ובידוד לשימוש נרחב במעבדות רבות.

מאמר זה מציג גישה חדשה ומבוססת חומרים להקרנת חיידקים ובידוד. השיטה משתמשת הידרוג'לים פוטו-הדרגתיים עבור אנקפסולציה של תאים, תרבית, תצפית מיקרוסקופית, ושחרור לפי דרישה והתאוששות של חיידקים ממוקדים עם פנוטיפים ייחודיים. הידרוג'לים מתוכננים להכיל גודל רשת 10 ננומטר, שבו כל crosslink מכיל o- קבוצות ניטרוציל¹⁵. החומר מתמצת או לוכד תאים לתצפית תוך מתן אפשרות לפיזור חומרים מזינים ומוצרי פסולת לתאים וממנו לתרבות. חשיפת החומר למקור אור UV בדוגמת 365 ננומטר באמצעות מיקרוסקופ זקוף מאפשרת השפלה מקומית של ההידרוג'ל באמצעות פוטוקלאבאג'ל של קבוצות o-nitrobenzyl^{16, 17}. השפלה מפעילה את השחרור הסלקטיבי של תאים להתאוששות לניתוח במורד הזרם, כולל ניתוח גנומי, ואולי, פרוטאומי ותעתיק. ההתקנה והפרוטוקול הניסיוניים הם פשוטים יחסית, זולים ותרגומים למעבדות מיקרוביולוגיה. זה דורש רק אנקפסולציה של תאים באמצעות היווצרות הידרוג'ל, תצפית של תאים שנתפסו עם מיקרוסקופ בהיר ופלואורסצנטיות זקוף, והארה של תאים מעניינים עם מקור אור UV בדוגמת לאחזור.

יתרון מרכזי בגישה מבוססת חומרים זו להקרנה הוא יכולת ההסתגלות שלה לפורמטי הקרנה שונים. בתבנית הבסיסית ביותר שלה, החומר יכול לשמש להקרנה על ידי אנקפסולציה של אוסף תאים הטרוגניים הידרוג'ל בתפזורת. תאים נצפים לאחר מכן עבור פנוטיפ הרצוי, ותאים בודדים של עניין מוסרים עבור אפיון גנומי. בפורמטים משוכללים יותר, ניתן לשלב את החומר גם בהתקני מעבדה על שבב כדי לספק שחרור ואחזור מדויקים של התא מהאזורים הרצויים של המכשיר. שני הפורמטים מתוארים כאן, ושניהם אפשרו הקרנה מיקרוביאלית חדשנית לאחרונה ויישומי בחירה^17,18,19. השיטה מודגמת כאן עם אורגניזמים גרם שלילי מודל(Escherichia coli, אגרובקטריום tumefaciens) ואורגניזם גרם חיובי מודל (Bacillus subtilis) והוא הורחב בקלות למגוון של חיידקים אחרים.

Protocol

1. זנים חיידקיים ופרוטוקולי תרבות

1. מושבות פסים של חיידקים על לוחות אגר בתוספת מדיה צמיחה מתאימה. בדו"ח זה, B. subtilis (זן 1A1135, מרכז מלאי גנטי Bacillus) הוא תרבית על ATGN (0.079 M KH₂PO₄, 0.015 M (NH₄)₂SO₄, 0.6 מ"מ MgSO₄·7H₂O, 0.06 mM CaCl₂·2H₂O, 0.0071 mM MnSO₄· H₂O, 0.125 M FeSO_4· 7H₂O, 28 mM גלוקוז, pH: 7 ± 0.2, 15 גרם / L אגר) צלחות אגר בתוספת 100 מיקרוגרם / mL spectinomycin ו- E. coli (זן 25922, ATCC) על צלחות אגר ATGN בתוספת 100 מיקרוגרם / mL אמפיצילין.
   הערה: דיווחים קודמים של אנקפסולציה הידרוג'ל ושחרור עם חומרים אלה מפתאחי ואח^'19 במקום להשתמש A. tumefaciens C58 תאים
2. בחרו מושבות רצויות מלוחות אגר ATGN והתחילו תרבויות לילה. עבור זני E. coli ו- B. subtilis המשמשים כאן, תרבות ב 37 °C (75 °F) תוך רועד ב 215 סל"ד במדיום נוזלי ATGN עבור 24 שעות. לאחסן את תרביות התא ב 50% גליסול ב -80 °C (70 °F) עד לשימוש עתידי.
3. בחר מושבות של שני זנים ממניות גליצל באמצעות לולאות חיסון סטריליות ודגרה במדיה נוזלית ATGN עבור 24 שעות ב 37 °C (7 °F) ו 215 סל"ד.

2. הכנת החומר הדרוש להיווצרות הידרוג'ל

1. PEG-o-NB-diacrylate פוטו-דיאקרילט סינתזה
   הערה: הסינתזה הפנימית של PEG-o-NB-diacrylate תוארה היטב ודווחה בעבר^16,17. לחלופין, כי הסינתזה היא שגרתית, זה יכול להיות במיקור חוץ ממתקן סינתזה כימית.
2. מאגר קישור מקושר
   1. קח את המתכון של המדיום שנבחר לזן החיידקי והכן מדיה עם 2x חומרים מזינים. הוסף פוספט, למשל, NaH₂PO_4, לריכוז בינוני עד סופי של 100 מ"מ. לאחר מכן, התאם את ערך ה- pH ל- 8 באמצעות 5 M NaOH (aq).
   2. לחטא את פתרון המאגר ולאחסן אותו ב -20 °C (70 °F) עד לשימוש נוסף.
      הערה: השאירו את כל מתכות המעבר הקיימות בתקשורת, שכן מתכות אלה מזרזות את חמצון התיולים לדזיסולפידים.
3. PEG-o-NB-diacrylate פתרון
   1. עבור כל מ"ג של aliquotPEG-o-NB-diacrylate (3,400 Da משקל מולקולרי) אבקת, להוסיף 3.08 μL של מים אולטרה-תול כדי להגיע 49 mM ריכוז שלPEG-o-NB-diacrylate (98 mM ריכוז אקרילט).
   2. מערבולת את הפתרון עד שהוא מעורבב היטב ולאחסן פתרון זה ב -20 °C (50 °F) עד לשימוש נוסף.
4. פתרון PEG-תיול בעל 4 זרועות
   1. להכנת PEG-תיול (10,000 Da משקל מולקולרי) בעל 4 זרועות, הוסיפו 4 מיקרו-אל של מים אולטרה-תכשירים לאבקת מ"ג כדי להגיע לריכוז של 20 מ"מ (80 מ"ר של ריכוז תיול).
   2. מערבולת פתרון זה עד שהוא מעורבב היטב ולאחסן פתרון זה ב -20 °C (70 °F) עד לשימוש נוסף.

3. הכנת כיסויים פרפלואורואלקים (לא תגובתיים)

1. מקם עד 5 שקופיות זכוכית (25 מ"מ x 75 מ"מ x 1 מ"מ) בתוך דיוור שקופיות פוליפרופילן. Sonicate השקופיות עם 2% (w / v) פתרון דטרגנט(טבלת חומרים)במשך 20 דקות.
2. לשטוף את המגלשות שלוש פעמים עם מים אולטרה-תפותי, ולאחר מכן sonicate את המגלשות במים במשך 20 דקות. יבש את השקופיות באמצעות זרם של N₂.
3. פלזמה נקייה (ראה שולחן חומרים)משני צידי מגלשות הזכוכית על פי הפרוטוקול בסעיף 4.1 למשך 2 דקות.
4. מניחים את שקופיות ניקה הפלזמה בחזרה לתוך דיוור שקופית ולמלא את המיכל עם 0.5% (v / v) פתרון של trichloro(1H, 1H, 2H, 2H,-perfluorooctyl)סילאן toluene. אפשר שקופיות זכוכית אלה להיות פונקציונלי במשך 3 שעות בטמפרטורת החדר (RT).
5. לאחר השקופיות פונקציונליות, לשטוף את השקופיות בתוך דיוור שקופיות, תחילה עם טולואן ואתנול הבא (שלוש פעמים עם כל ממס). לאחר מכן, יבש כל שקופית פונקציונלית עם זרם של N₂.

4. הכנת תיול פונקציונלי (בסיס) כיסויים

1. ניקוי כיסויי הזכוכית באמצעות מנקה פלזמה
   1. מניחים כיסויים בקוברות 18 מ"מ x 18 מ"מ בצלחת פטרי. לאחר מכן, מניחים את צלחת הפטרי בתא מנקה פלזמה ומפעילים את כוחו של מנקה הפלזמה.
   2. הפעל את משאבת הוואקום כדי לנקות את האוויר בתוך התא עד מד הלחץ קורא 400 mTorr.
   3. פתח את שסתום המדידה כדי לתת אוויר לתוך התא עד מד הלחץ מגיע ללחץ קבוע (800-1000 mTorr). לאחר מכן, בחר RF עם מצב "היי" ולחשוף את כיסויים במשך 3 דקות.
   4. לאחר 3 דקות, יש לכבות את מצב ה-RF ואת משאבת הוואקום.
   5. מוציאים את צלחת הפטרי מהתא, הופכים את כיסויי הכיסוי ומניחים אותם בחזרה בתא כדי לחשוף את הצד השני של כיסוי הזכוכית.
   6. חזור על שלבים 4.1.2-4.1.4 כדי לנקות את הצד הלא מטופל של כיסוי הזכוכית.
   7. לאחר השלמת התהליך, להסיר את צלחת פטרי מהתא ולהפוך את שואב הפלזמה ואת משאבת ואקום.
2. ניקוי והידרוקסילגציה של כיסויים עם פתרון פיראנה
   הערה: פרוטוקולי ניקוי פיראנה סטנדרטיים יכולים לשמש לניקוי והידרוקסילט של פתקי זכוכית. פתרון פיראנה הוא תערובת 30:70 (v/v) של H₂O₂ ו- H₂SO₄. ניתן להשתמש גם בשיטות חלופיות לניקוי כיסויי זכוכית.
   זהירות: פתרון פיראנה הוא מאכל מאוד נפץ עם ממיסים אורגניים ויש לטפל בו בזהירות רבה. יש ליישם אמצעי בטיחות והכלה מתאימים, כגון שימוש בציוד מגן אישי מתאים (חלוק מעבדה, סינר עמיד לכימיקלים, משקפי בטיחות, מגן פנים, כפפות בוטיל עמידות לחומצה). כל כלי הזכוכית ומשטחי העבודה במגע עם פתרון פיראנה צריכים להיות נקיים, יבשים וללא שאריות אורגניות לפני השימוש. פתרון פיראנה לעולם לא צריך להיות מאוחסן במיכל סגור חלקית או סגור.
   1. מניחים צלחת זכוכית נקייה 100 מ"מ x 50 מ"מ על מערבבת מגנטית עם מהירות ערבוב מתכווננת מתחת למכסה המנוע של אדים ומוסיפים 14 מ"ל של H₂SO₄ למנה.
   2. מניחים בעדינות מוט מוקפץ מגנטי קטן מצופה טפלון באמצעות מלקחיים מצופים טפלון בתוך המנה. לאחר מכן, להפוך את stirrer לאט כדי למנוע התזה של החומצה.
   3. לאחר מכן, מוסיפים בעדינות 6 מ"ל של H₂O₂ למנה ומאפשרים לפתרון להיות מעורבב היטב.
   4. כבה את stirrer, ולאחר מכן להסיר את בר ערבוב מן המנה באמצעות מלקחיים. לאחר מכן, מניחים בעדינות את הכיסויים בתוך המנה באמצעות המלקחיים ומגדירים את הטמפרטורה ל 60-80 מעלות צלזיוס.
   5. לאחר 30 דקות, להסיר בעדינות את כיסויים באמצעות המלקחיים ולהטביע אותם במים deionized (DI) פעמיים כדי לשטוף את פתרון פיראנה שיורית.
   6. לאחר שטיפה במים, לאחסן את כיסויים במי DI ב RT עד לשימוש נוסף.
   7. כבה את הכיריים ואפשר לתמיסת פיראנה להתקרר.
   8. כדי להיפטר מתמיסת הפיראנה, הניחו בעדינות את צלחת הזכוכית 100 מ"מ x 50 מ"מ המכילה את תמיסת פיראנה מקוררת בכוס זכוכית גדולה וריקה שהיא לפחות 1.5 ליטר בנפח. לאחר מכן להוסיף 1 ליטר של מים לדלל ולהוסיף אבקת ביקרבונט נתרן לנטרול. שים לב כי סודיום ביקרבונט יגרום מבעבע ויצירת חום ויש להוסיף לאט מאוד, אחרת מבעבע עלול להוביל התזת החומצה. כאשר תוספת נוספת של סודיום ביקרבונט אינה גורמת לבעבע, בדוק את ה- pH עם נייר pH כדי לוודא שהוא נוטרל. ברגע שהתמיסה מנוטרל ומצונן, ניתן לשפוך אותו במורד הכיור.
3. תיול פונקציונליזציה של כיסויים
   1. הכן פתרון של 5% (v/v) של 269 mM של (3-mercaptopropyl) תמיסה טרימתוקסיסילן (MPTS) בטולן יבש.
   2. הוסף 10 מ"ל של הפתרון צינורות צנטריפוגה חרוט 50 מ"ל בודדים ומניחים כיסוי אחד ניקה בכל צינור ולהטביע אותו בתוך הפתרון.
      הערה: כיסוי אחד לכל צינור 50 מ"ל משמש כדי להבטיח את התיועלות של שני הצדדים של המצע מבלי להיות מוטרד על ידי מצעים אחרים.
   3. לאחר 4 שעות, לשטוף כל כיסוי (ארבעה שטיפות לכל כיסוי) עם טולואן, 1:1 (v / v) אתנול: תערובת טולואן, ואתנול.
      הערה: זה נעשה על ידי טבילת כל כיסוי ברצף לתוך צינורות צנטריפוגות חרוט המכיל את הפתרונות שהוזכרו.
   4. לאחר שטיפה המצע, להטביע אותם באתנול ולאחסן אותם ב 4 °C (70 °F) עד לשימוש נוסף.
      הערה: בהתאם למספר כיסויים, שיטה זו יכולה להיות מייגע עקב טיפול כיסויים אחד בכל פעם. עבור כיסויים מרובים, צנצנות קולומביה שמתאימות למספר כיסויים בו זמנית ניתן להשתמש.

5. ייצור מערכי מיקרווול סיליקון

1. ציפוי פארילן: השתמש בפרוטוקול הסטנדרטי המתואר במאמרי מחקר קודמים^20,21 לציפוי ופלים סיליקון עם פארילן.
2. מיקרו-פיכחון: פעל לפי הפרוטוקול המתואר על ידי Barua et al.¹⁸ כדי לעצב ולפרוע את מערך המיקרווול(איור 1 משלים).
   הערה: טכניקות פוטוליתוגרפיות סטנדרטיות שתוארו על ידי Timm et al.¹⁷ הוחלו כדי לפברק מערכי מיקרווול על ופלים סיליקון מצופים פארילן.

6. היווצרות הידרוג'ל

1. היווצרות הידרוג'ל בתפזורת על כיסויי זכוכית
   1. פתרון הקדמה הידרוג'ל: הוסף 12.5 μL של המאגר crosslinking לצינור microcentrifuge 0.5 מ"ל, ואחריו 5.6 μL של PEG-o-NB-diacrylate פתרון. לבסוף, להוסיף 6.9 μL של פתרון PEG-thiol 4 זרוע לתערובת.
      הערה: הוספת תיטול PEG בעל 4 זרועות לתערובת יוזמת את תגובת הקישור הצולבת. לכן, הפתרון הקדמה הידרוג'ל יש להשתמש מיד לאחר ערבוב.
   2. עבור אנקפסולציה של תאים בתמיסת מבשר הידרוג'ל, בצע את השלבים 6.1.3-6.1.9.
   3. עבור אנקפסולציה של תאים, לפני שלב 6.1.1, לחסן את מאגר הקישור הצולב עם צפיפות התא הרצויה. כפי שדווח בעבר¹⁹, נצפתה כי צפיפות התא של 7.26 × 10⁷ CFU / mL במאגר crosslinking מתאם לצפיפות של ~ 90 תאים / מ"מ² אנקפסולציה על פני הידרוג'ל.
   4. מניחים את מכסה הבסיס thiolated על צלחת פטרי נקי. מקם שני מרווחים (ראה טבלת חומרים) בשני הצדדים המנוגדים של כיסוי הכיסוי.
      הערה: פונקציונליזציה Thiol של כיסויים יש צורך חיבור covalent של הידרוג'ל למשטח כיסוי. זה נעשה באמצעות התגובה של קבוצות תיול על פני השטח ואת קבוצות אקרילט נוכח פתרון הקדמה הידרוג'ל.
   5. תקן את המרווחים על מכסה הבסיס על ידי הדבקת המרווחים לצלחת פטרי.
   6. Pipette את הנפח הרצוי של פתרון מבשר על שקופית זכוכית perfluoroalkated לא תגובתי.
   7. הנח את שקופית הזכוכית perfluoroalkated על כיסוי הבסיס(איור 1C). המתן 25 דקות ב- RT להשלמת היווצרות הידרוג'ל.
   8. לאחר הג'לציה, הסר בעדינות את שקופית הזכוכית perfluoroalkated. ההידרוג'ל יישאר מחובר לכיסוי הבסיס.
      הערה: עבור כיסויים בעובי 18 מ"מ x 8 מ"מ כדי להשיג ממברנה בעובי 12.7 מיקרומטר, השתמש ב- ~7 μL של פתרון מבשר (איור 1A,B). שימוש בכמויות גדולות יותר של פתרון מבשר עלול לגרום הידרוג'ל מתחת כיסוי הבסיס. זה עלול לגרום כיסוי הבסיס להיצמד צלחת פטרי לשבור על ניסיון הסרה. כמו כן, שאריות הידרוג'ל מתחת לכיסוי הוא בעייתי למיקרוסקופיה. הסרה עדינה של שקופית זכוכית perfluoroalkated ללא תגובתי נדרשת כמו הסרה מהירה יכולה לפגוע הידרוג'ל.
   9. מניחים את המצע בצלחת פטרי 60 מ"מ x 15 מ"מ במדיה התרבותית שצוינה. כאן, מדיה ATGN בתוספת 100 מיקרוגרם / mL spectinomycin עבור B. subtilis או 100 מיקרוגרם / mL אמפיצילין עבור E.coli ב 37 °C (50 °F) שימש עבור 24 שעות תרבות פעמים.

איור 1: היווצרות הידרוג'ל על כיסויי זכוכית תיאולה. (A)מרווחים בעובי של 12.7 מיקרומטר ממוקמים משני צדדים מנוגדים של כיסוי בסיס המכיל קבוצות תיול תגובתיות. (B)תמיסת המבשר ההידרוג'ל מונפשת על מגלשת זכוכית פלואורית שאינה תגובתית. (C)שקופית הזכוכית הלא תגובתית ממוקמת על המרווחים להיווצרות הידרוג'ל בעובי 12.7 מיקרומטר. (D)שקופית הזכוכית הלא תגובתית מוסרת בעדינות, ומשאירה את ההידרוג'ל מחובר לכיסוי הבסיס. (ה)ההידרוג'ל המוכן יכול להיות דגירה במדיה לתרבות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

7. היווצרות הידרוג'ל מעל מערכי מיקרווול

1. חיידקים שזורעים במערכי מיקרווול
   הערה: 700 μL של 0.1 OD₆₀₀ השעיות תאים נזרעו מעל מצעים מערך microwell, ואת שיטת הרמת פארילן הוחל כדי להסיר תאים מהרקע באמצעות הפרוטוקול המתואר על ידי טים ואח' . ^22.
2. הכן את פתרון הקדמה הידרוג'ל על ידי הוספת 5.6 μL שלPEG-o-NB-diacrylate עם 12.5 μL של pH 8 תמיסת מלח חוצץ פוספט ATGN וערבוב עם 6.9 μL של פתרון PEG ארבע זרועות.
3. Pipette 12.5 μL של פתרון מבשר על שקופית זכוכית perfluoroalkated לא תגובתי, perfluoroalkated ומניחים שני מרווחי פלדה 38 מיקרומטר (ראה טבלה של חומרים ) על שני צדדים מנוגדיםשל מערך microwell מצע מחוסן עם תאים.
4. הפוך את שקופית הזכוכית perfluoroalkated עם טיפת פתרון הקדמה ומניחים את הטיפה באמצע מצע microwell. לאחר מכן, דגירה במשך 25 דקות ב RT להיווצרות הידרוג'ל.
5. הסר בעדינות את שקופית הזכוכית ממצע המיקרווול. קרום ההידרוג'ל צריך להישאר מחובר למצע המיקרווול. המשך לשלב 6.1.9.

8. הכנת חומר להפקת תאים

1. הכנת מחזיק PDMS
   1. מדביקים ערימה של 18 x 18 מ"מ מכסים יחד ומדביקים את ערימת הכיסויים הזו לתחתית צלחת פטרי.
   2. כדי לפברק מחזיקי PDMS, לערבב PDMS מבשר וסוכן ריפוי ביחס של 10:1 יחס נפח בכוס פלסטיק, degas את התערובת בחיטוי ואקום, ולאחר מכן לשפוך את התערובת לתוך צלחת פטרי.
   3. לרפא PDMS במשך 90 דקות ב 80 °C (70 °F). לאחר מכן, גזור סביב הבלוק המודבק כדי להסיר את מחזיק ה-PDMS והצב את מחזיק ה-PDMS במגלשת זכוכית לטיפול קל יותר במיקרוסקופיה.
2. הכנת מיקרו-מזרק וצינורות
   1. חותכים 20 ס"מ של צינורות PTFE (0.05 בתקנות זהות) ומצמידים קצה אחד של הצינורות למזרק מיקרוליטר 100 μL.
      הערה: להפקה, הימנע משימוש בצינורות כמו ציור התאים ששוחררו באמצעות קצה פיפטה יכול לפגוע במשטח הידרוג'ל ולהוביל לזיהום.

9. השפלת הידרוג'ל עם כלי התאורה בדוגמת

הערה: השלבים הבאים המתוארים בסעיף זה זהים הן עבור הידרוג'לים בתפזורת והן עבור מערכי מיקרווול, למעט דפוסי החשיפה לאור המתוארים בשלבים 9.6.4-9.6.6 ו- 9.6.7-9.6.10.

1. הפעלת המיקרוסקופ (ראה טבלת חומרים). לאחר מכן, הפעל את כלי התאורה בדוגמת המילוי (ראה טבלת חומרים).
2. הפעל את מודול הבקרה האנלוגית והדיגיטלית של מקור ה- LED של 365 ננומטר. לאחר מכן, הפעל את מודול בקרת מקור האור של ה- LED.
3. פתח את תוכנת המיקרוסקופ ואת התוכנה עבור כלי התאורה בדוגמת. כאשר חלון תצורת החומרה נפתח, בחר בלחצן טען.
   הערה: שלושה מכשירים ייטענו כאן. (מצלמת צד שלישי, מודול בקרה וכלי תאורה בדוגמת)
4. לחץ על לחצן התחל. חלון תוכנת דפוס האור ייפתח כעת. בחר באפשרות הראשונה, לחצן בקרת התקן, בסרגל הצד הימני של החלון.
5. כייל את כלי התאורה בדוגמתו.
   הערה: כיול חייב להיעשות עם אותה מטרת מיקרוסקופ ומסנן שישמש לחשיפה לאור.
   1. הגדר את מטרת המיקרוסקופ להגדלה של פי 10.
      הערה: הגדלה זו מאפשרת מספיק מרחק עבודה בין עדשת המיקרוסקופ לבין פני השטח לדוגמה. זה גם מאפשר ניטור והקלטה של תהליך האחזור בזמן אמת דרך חלון התמונה.
   2. הגדר את עדשת המיקרוסקופ וסינן להגדרות המשמשות לחשיפה לאור והצב את מראה הכיול מתחת למיקרוסקופ.
   3. בחלון בקרת התקן, הקש על הכרטיסיה בקרת LED. הפעל את נורית LED #1 והגדר את עוצמת האור למספר הרצוי. בניסויי מיצוי סטנדרטיים, זה מוגדר ל -60%.
   4. הקש על הכרטיסיה שכותרתה עם שם המוצר של כלי התאורה בדוגמת המילוי בחלון 'בקרת התקנים'. לאחר מכן, לחץ על לחצן הצג רשת.
      הערה: תבנית רשת תוקרן על שיקוף הכיול.
   5. התאם את מוקד המיקרוסקופ ואת חשיפת המצלמה כדי להשיג איכות תמונה גבוהה של הרשת ולסובב את המצלמה כדי ליישר את קווי הרשת במקביל למסגרת חלון המצלמה, במידת הצורך.
   6. בחר בלחצן אשף הכיול תחת הכרטיסיה שכותרתה בשם המוצר של כלי התאורה בדוגמת מילוי ובצע את ההוראות שסופקו על-ידי התוכנה בחלון זה.
      הערה: ייפתח חלון הגדרת מצלמה של ספק חיצוני.
   7. חלון בחירת סוג כיול ייפתח. בחר כיול אוטומטי והקש הבא.
   8. כאשר החלון התאמת כיול קדם נפתח, בצע את הוראות התוכנה ולחץ על לחצן הבא.
   9. כאשר החלון מידע מיפוי נפתח, שמור כיול זה בהתאם בתיקיה הרצויה. זה נעשה על ידי הצבת התאריך, שם המיקרוסקופ, העדשה האובייקטיבית והמסנן.
   10. לאחר הכיול, לחץ על לחצן הגדרת אזור עבודה שנמצא תחת הכרטיסיה שכותרתה עם שם המוצר של כלי התאורה בדוגמת המילוי כדי להגדיר את אזור העבודה של כלי התאורה בדוגמת המילוי במידת הצורך.
6. מקטע עיצוב רצף להכנת תבנית.
   1. לחץ על לחצן עיצוב רצף בסרגל הימני של חלון התוכנה. לאחר מכן, לחץ על לחצן עורך רצף הפרופילים.
   2. כאשר החלון עורך רצף הפרופילים נפתח, בחר באפשרות פרופיל חדש תחת רשימת הפרופילים.
      הערה: כעת ייפתח חלון עורך התבניות.
   3. הכן את התבנית הרצויה לחשיפה לאור על-ידי בחירת צורות וגדלי דוגמת מילוי שונים, או צייר את התבנית באופן ידני, אם תרצה בכך.
   4. לתבניות עיגול וצלב שבור עבור הידרוג'ל בתפזורת, בצע את השלבים 9.6.5- 9.6.6
   5. לתבניות מעגל, הגדר עיגול בקוטר של 30 מיקרומטר מעל מושבת חיידקי מטרה כדי לכסות את כל המושבה. בחר את צבע מילוי הצורה בלבן.
   6. עבור תבניות מוצלבות שבורות, בחר את צורת המלבן מחלון ציור התבנית עם מידות של 3 מיקרומטר x 8 מיקרומטר. מקם ארבעה מלבנים עם ממד זה בשולי מושבת היעד, בעוד שלמחצית מהדפוסים יש שכבת-על עם המושבה.
   7. לתבניות עיגול וטבעת עבור מערכי המיקרווול, בצע את שלבים 9.6.8-9.6.10.
   8. לתבניות עיגול, ציירו עיגול בקוטר 10 מיקרומטר סביב היקף הבאר. בחר את צבע מילוי הצורה בלבן.
   9. לתבנית הטבעת, ציירו עיגול בקוטר 20 מיקרומטר, הניחו אותו מעל הבאר ובחרו את צבע מילוי הצורה בלבן.
   10. צייר דפוס עיגול נוסף בקוטר 10 מיקרומטר עם צבע צורת מילוי שחור ומניחים אותו סביב היקף הבאר.
7. ערוך את התבנית ושנה את הצורות בהתבסס על שיטת החילוץ הרצויה. ודאו שהתבנית הרצויה קיימת באזור העבודה של כלי התאורה בדוגמתו.
8. מקם את המדגם במחזיק PDMS ו pipette את המדיה המוגדרת על גבי המדגם כדי למנוע התייבשות מדגם ולספק פתרון נושא עבור תאים שפורסמו.
9. לאחר מכן, החלף את זה במראה הכיול.
10. התאם את מוקד המיקרוסקופ כדי לקבל תמונה חדה של המושבות בתוך ההידרוג'ל. בדוק את המושבות כדי לזהות מושבה של עניין.
11. כאן, עצב את דפוסי האור בזמן שתצוגת המצלמה מציגה את המושבות בתוך המדגם כדי לבדוק דפוסים שונים להפקת תאים.
12. שמור את התבנית המוגדרת. לאחר שמירת התבנית המוגדרת, בחר במקטע בקרת הפעלה.
13. במקטע זה, תחת הכרטיסיה שכותרתה עם שם המוצר של כלי התאורה בדוגמת המילוי, הוסף את הרצף שנשמר.
14. לאחר הוספת הרצף, בחר באפשרות לדמות את דוגמת המילוי להצגה והתאמה למיקום הרצוי של חשיפה.
    הערה: ניתן להתאים את המיקום לדוגמה כאן כדי להבטיח שהתבנית מוקרן דווקא באזור היעד.
15. לאחר מכן, התאם את עוצמת האור ל- 60% ואת זמן החשיפה ל- 40 שניות תחת הכרטיסיה בקרת LED והתחל את תהליך החשיפה.
16. נטר את השפלת ההידרוג'ל בזמן אמת ובמצב Brightfield כדי להבטיח שחרור תאים.
    הערה: למנוע תנועות כלשהן המדגם במהלך חשיפה לאור כפי שהוא יכול לגרום השפלה של אזורים לא רצויים של הידרוג'ל וכתוצאה מכך זיהום צולב.

10. אחזור תאים

הערה: הליך אחזור התא זהה הן עבור הידרוג'ל בתפזורת והן עבור מערכי מיקרווול.

1. לאחר חשיפה לאור של 365 ננומטר ושחרור תאים, אספו את התאים באמצעות מזרק מיקרוליטר וצינורות מיקרופלואידיים(איור 2).
   הערה: אחזור תאים צריך להיעשות מיד לאחר חשיפה לתבנית. פעולה זו מאפשרת שחזור תאים מקומיים לפני שהתאים ששוחררו מתרחקים מהאזור המוקרן.
2. שנה את המיקרוסקופ מ- Brightfield למסנן FITC או TRITC כדי לאפשר הדמיה של האזור החשוף של המדגם בעין בלתי.
3. לאחר שהאזור החשוף ממוקם, הנח את קצה הצינורות על הנקודה המוקרנת. לאחר מכן שנה את מסנן המיקרוסקופ בחזרה לברייטפילד כדי לפקח על אחזור תאים בזמן אמת.
4. השתמש במזרק המחובר לקצה השני של הצינורות כדי למשוך בזהירות את התאים המשוחררים. למשוך 200 μL של הפתרון ולהכניס את הפתרון לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל לניתוח DNA או ציפוי.

איור 2: ייצוג סכמטי של שיטת החילוץ לאיסוף תאים ששוחררו מההידרוג'ל. כאן, מיד לאחר חשיפה UV 365 ננומטר, השפלת הידרוג'ל, ושחרור התא, המיקרוסקופ משמש כדי להאיר את דגימת הידרוג'ל עם אור ממסנן TRITC, וכתוצאה מכך נקודה ירוקה בהירה המכסה את האזור שבו התרחש שחרור התא. פעולה זו מסייעת למשתמש בזיהוי המיקום המרחבי עבור איסוף דוגמאות. לאחר הדמיית אזור זה, צינורות איסוף המחוברים מזרק microliter ממוקם במקום זה ואת המדגם נאסף. מיקרוסקופיית ברייטפילד בהגדלה של פי 10 משמשת לניטור קצה משטח הצינורות וההידרוג'ל בזמן אמת לאיסוף תאים מדויק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

11. טיהור דנ"א גנומי ומדידת איכות DNA

1. השתמש בערכת טיהור DNA (ראה טבלה של חומרים) כדי לחלץ DNA מן בידוד חיידקים.
   1. עקוב אחר מפרט היצרן המתואר במדריך ערכת טיהור ה- DNA²³ עד לשלב האחרון (שלב 7), הדורש חמקה עם מאגר AE.
   2. עבור שלב ההתחמקות, בצע את מפרט היצרן, עם ההבדל של שימוש 100 μL של מאגר AE במקום 200 μL.
   3. חזור על ההבחנה פעם אחת כמתואר בשלב 11.1.2. צעד זה מוביל לתפוקת DNA כוללת מוגברת.
2. מדוד את איכות הדנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis (ראה טבלת חומרים).
   1. תדליק את הספקטרופוטומטר. לאחר אתחול ההתקן, בדף הבית, בחר באפשרות dsDNA על המסך.
   2. לאחר מכן, הרימו את זרוע המעמד ונקו את תנוחת המעמד עם מי DI ומגבונים ללא מוך.
   3. Pipette 2 μL של פתרון ריק, כאן חוצץ AE, על המיקום הכן בעדינות להביא את זרוע המעמד למטה ולבחור ריק על המסך.
   4. לאחר מכן, להרים את המעמד ולנקות את המיקום המעמד עם מים DI כדי להסיר כל חומר שיורית מן המדידה הקודמת.
   5. טען את המדגם (2 μL) על מיקום המעמד, הורד את זרוע המעמד ובחר בלחצן מדידה על המסך.
   6. בצעו מחדש את שלבים 11.2.4 ו- 11.2.5 עבור כל הדגימות.
   7. לאחר סיום המדידה, בחר "סיים ניסויים" על המסך. הכנס את כונן ההבזק להתקן ולחץ על "ייצוא נתונים" על המסך.

12. קביעת הכדאיות של התא מתמציות הידרוג'ל ומיקרווול

1. לדלל את ההשעיות החיידקיות על ידי גורם דילול של 10⁵ באמצעות צלחת 96-well.
2. Pipette 10 μL של השעיית חיידקים מדוללת לזהות שלוש פעמים על לוחות ATGN עבור כל השעיית חיידקים.
3. הטה את הלוחות כדי לפזר את התאים על משטחי אגר. יבש אוויר את לוחות ATGN המכילים את המתלים החיידקיים.
4. לדגור על הצלחות ב 37 °C (55 °F) במשך 48 שעות. ספר ורשום את מספרי יחידות היווצרות המושבה (יחידות CFUs). לספור את כל שלוש ממרחים של השעיות חיידקים על כל צלחת.
   הערה: בצע את השלבים 12.1-12.4 בארון בטיחות ביולוגי כדי למנוע זיהום של הצלחת.

Results

כדי לחקור את היכולת של אור UV לעורר השפלה הידרוג'ל מבוקר לשחרור תאים, הידרוג'לים היו תחילה עטוף מעל כיסויים thiolated ללא חיידקים נוכחים. כל הידרוג'ל נחשף לשלושה דפוסי עיגול משוכפלים של אור בעוצמות שונות ובזמני חשיפה שונים. אחוז השפלת הג'ל חושב לאחר חשיפה לאור UV בכל עוצמת אור, וזמן החשיפה היה אז לכמת על ידי צימוד קבוצות תליון עם צבע פלואורסצין-5-מלמיד עבור הדמיית פלואורסצנטיות^19,24. דוגמה מייצגת לאופן שבו שני פרמטרים אלה משפיעים על השפלת ההידרוג'ל מוצגת באיור 3. כפי שניתן לראות, אור בדוגמת המסופק על ידי כלי התאורה בדוגמת מספק שליטה מרחבית-זמנית של השפלת הידרוג'ל ברזולוציה שיכולה לאפשר שחרור של מספר קטן של תאים בלבד.

איור 3: שליטה על השפלת הידרוג'ל. מינון אור UV וכתוצאה מכך הידרוג'ל השפלה הם טונה באמצעות כלי תאורה בדוגמת. (Inset) שתי עוצמות אור שונות נבחרו עבור השפלת הידרוג'ל בדוגמת דפוס. לאחר חשיפה לאור UV 365 ננומטר, הידרוג'לים סומנו עם פלואורסצין-5-maleimide עבור הדמיית פלואורסצנטיות. הודפס מחדש (מותאם) באישור של פתחי ואח '¹⁹ זכויות יוצרים 2020 האגודה האמריקנית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

להפקת תאים, נעשה שימוש בדפוסי אור שונים כדי לחקור את שחרור התאים (איור 4). כאן, תאי חיידקי אגרובקטריום תוחמו להידרולג'ל בתפזורת מעל כיסויי זכוכית תיאולאטים, ואז תורבו למושבות מיקרו-קשקשים. הידרוג'לים נבדקו אז במיקרוסקופיה של ברייטפילד, ומיקרוקולוניות ממוקדות נחשפו לדפוסי אור UV מגוונים. נצפתה כי דפוסי חשיפה שונים השפיעו על המורפולוגיה של התאים המשוחררים. זה עשוי להועיל עבור יישומים שונים. לדוגמה, חשיפת תבנית טבעת סביב מושבת היעד גורמת לשחרור המושבה כולה שעדיין עטופה הידרוג'ל PEG מגן וללא חשיפה ישירה לאור UV (איור 4A), אשר עשוי לשמר תאים ולספק טיהור קל במורד הזרם. לעומת זאת, על ידי חשיפת חלק מהמושבה או כולה לאור UV, ניתן לחלץ תאים כצבורי תאים מצטברים (איור 4B) או כתאים בודדים וחופשיים(איור 4C).

איור 4: שליטה על המורפולוגיה של התאים שחולצו. (A) שימוש בתבנית טבעת כדי לשחרר את מושבת התא כולה, מוגנת במטריצת PEG. (B)שימוש בתבנית מוצלבת שבורה לשחרור תאים באגרגטים. (ג)שימוש בתבנית צולבת כדי לשחרר תאים בודדים. הודפס מחדש (מותאם) באישור פתחי ואח'¹⁹ אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

קריטי בפרוטוקול אנקפסולציה הוא הן צפיפות זריעת התא ואת עובי ההידרוג'ל, שכן שני הפרמטרים האלה יכולים להשפיע על מספר התאים המשולבים בהידרוג'ל לתצפית. כדי להדגים, דגימות תאי Tumefaciens היו עטופים הידרוג'לים של שני עוביים שונים באמצעות מרווחים דקים (12.7 מיקרומטר) או מרווחים עבים (40 מיקרומטר) תרבית, ותמונה בעקבות הפרוטוקולים שנקבעו. הידרוג'לים דקים יותר גרמו לצפיפות מיקרו-קולוניה של 90 מושבות/מ"מ² ברחבי ההידרוג'ל, שם נצפתה חפיפה מינימלית של המושבה(איור 5A). לעומת זאת, עוביים הידרוג'ל גדולים מ-12.7 מיקרומטר הביאו להיווצרות מושבות חופפות בכיוון האנכי (איור 5B), מה שעלול לגרום להפקת מושבות מרובות. מושבות חופפות יכולות לגרום לזיהום צולב במהלך החילוץ בשל האופי הדו מימדי של תבנית האור. לדוגמה, מושבה עליונה יכולה להיות ממוקדת, בעוד שמושבה המשמשת כבסיס מופקת גם היא איתה (איור 5C). לכן, באמצעות מרווחים 12.7 מיקרומטר מומלץ להכנת הידרוג'ל.

איור 5: עובי הידרוג'ל משפיע על טוהר המיצוי. (A)על ידי שימוש מרווחים עם עובי של 12.7 מיקרומטר להיווצרות הידרוג'ל, מושבות נוצרות בתוך מישור מוקד אחד 10x. (B)שכבת-על של מושבות ניתן לראות בהגדלה של פי 10 אם נעשה שימוש במרווחים עם עוביים גדולים יותר מ- 12.7 מיקרומטר. (C)זיהום צולב יכול להתרחש עם שכבת-על של מושבות במהלך שחרור תאים: (i) תבנית טבעת משמשת לשחרור מושבת תאים ממוקדת, (ii) מושבת התאים הממוקדת מתנתקת מההידרוג'ל, ו- (iii) מושבה נוספת, הבסיסית נצפתה במהלך חשיפת האור מתחת למושבה הממוקדת. מושבה זו מוסרת גם היא, וכתוצאה מכך זיהום צולב. הודפס מחדש (מותאם) באישור של פתחי ואח '¹⁹ זכויות יוצרים 2020 האגודה האמריקנית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

בהתחשב בנזק הפוטנציאלי לחיידקים עם אור UV, ההשפעה של מיקרופנטנים שונים של אור UV על הכדאיות של התא נחקרה עוד יותר באמצעות מודל, חיידקים חיוביים גרם (B. subtilis) ומודל, חיידקים גרם שלילי (E. coli). כל אחד מהם היה עטוף בתוך הידרוג'ל בתפזורת ותרבות למושבות מיקרו-קשקשים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים, המאמתים את תאימותם להידרוג'ל. מיקרוקולוניז ממוקד בגדלים מקבילים (26 ± 1 מיקרומטר קוטר) נחשפו לאחר מכן למינון אור קבוע (168 mJ / mm 2 ), או בצורה של דפוסי^עיגולהחושפים מיקרוקולוניז שלמים לאור UV או דפוסים צולבים המבזים רק קצוות הידרוג'ל כדי למזער את חשיפה לאור לתאים. לאחר מכן התאוששו התאים ומצוות כדי לכמת את ה- CFU/mL שנמצאו בכל מושבה. לא נמצא הבדל משמעותי ברמת שחזור התאים (איור 6A). כדי לחקור עוד יותר את טוהר התאים שחולצו, DNA הופק מדגימות E. coli ונותח באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis. עבור שני הדפוסים, רמות איכות ה- DNA נופלות בטווח A₂₆₀/ A₂₈₀ בין 1.8 ל - 2.0 (איור 6B), שנמצא בטווח האידיאלי לרצף גנומי²⁵. זה מדגים כי דפוסי UV המשמשים לשחרור בתנאים המתוארים יש השפעה מינימלית על כמות התאים קיימא התאושש מן הידרוג'ל בתפזורת או על איכות ה- DNA הגנומי לאחר החילוץ.

איור 6: השפעת דפוסי חשיפה שונים לאור על הכדאיות של התא ועל איכות ה- DNA של חיידקים המשתחררים מהידרוג'ל בתפזורת. (A)רמות התאוששות התא עבור E. coli ו- B. subtilis לאחר החילוץ באמצעות דפוסים צולבים ודפוסי עיגול. עבור ניסוי זה, החילוץ נעשה ממושבות כדוריות באותו קוטר (26 מיקרומטר ± 1 מיקרומטר) כדי להבטיח שמספר התאים המשוחררים מכל מושבה היה שווה ערך. הפתרונות שחולצו אז היו מצופים כדי לחשב את CFU / mL שנרכש מכל דפוס. ניתוח סטטיסטי לא הראה הבדל משמעותי CFU / mL המתקבל מדפוסי הצלב והעיגול הן עבור E. coli והן עבור B. subtilis (ערך P > 0.05, n = 6 עבור שני הזנים). (B)כימות ספקטרופוטומטרי של איכות ה- DNA עבור תאי אי קולי מבודדים באמצעות דפוסי חוצה ועיגול. כאן, ניתוח סטטיסטי לא הראה הבדל משמעותי באיכות ה- DNA עבור הדפוסים המשמשים (P-value > 0.05, n = 6) (C) תמונות ברייטפילד של מושבות עם קטרים שווים החשופים לדפוסי הצלב והעיגול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

מערכי Microwell מספקים ממשק סינון אלטרנטיבי של מעבדה על שבב המציע תכונות סינון מבוקרות יותר בהשוואה להידרוג'ל בתפזורת. לדוגמה, מערכי מיקרווול מאפשרים זריעה של חיידקים לאתרי תרבות נפרדים שבהם ניתן לשלוט במספר התאים באינוקולום. תכונות גיאומטריות של מיקרווולים כגון גם עומק וקוטר נשלטים גם באמצעות שיטות מיקרו-פייבר סטנדרטיות. עם יתרונות אלה, microwells היו שימושיים לחקר צמיחת חיידקים תחת כליאה מרחבית²⁶, ולאחרונה לגילוי אינטראקציות סימביוטיות ואנטגוניסטיות בין מינים חיידקיים שונים כאשר מרותקים יחד בקנה מידה מיקרו¹⁸. מיצוי תאי מבארות לניתוח גנומי כגון ריצוף אמפלייקון 16S הוא קריטי עבור יישומים אלה. באמצעות אותו חומר הידרוג'ל, אור UV יכול להיחשף מעל תאים המכילים היטב של עניין, או כדפוסי עיגול או טבעת. האחרון מבטיח השפלה הידרוג'ל רק בהיקף microwell כדי למנוע הקרנה ישירה של תאים. כדי להדגים זאת, תאי A. tumefaciens המבטאים mCherry נזרעו לתוך בארות, הידרוג'ל היה אז מחובר למערך microwell. התאים היו בתרבית ולאחר מכן הוקרנו עם דפוסי עיגול או טבעת. הממברנה הוכתמה אז בצבע פלואורסצין-5-מלימיד. תמונות פלואורסצנטיות בשני צבעים חשפו כי הן הממברנה והן התאים בתוך בארות מוסרים הן עבור דפוסי הקרנה¹⁷. שלא כמו פורמט הידרוג'ל בתפזורת, חילוץ תאים כאן נצפתה רק בצורה של אשכולות תאים¹⁸.

איור 7: תמונות מיקרוסקופיות קונפוקליות מייצגות המציגות את השפעת דפוס האור על בידוד התאים מערכי מיקרו-וול. (A)מיקרווולים עם קטרים של 40 מיקרומטר המכילים חיידקים (אדום) לאחר זריעה ותרבות. (B)חשיפה לאור באמצעות דפוסי עיגול וטבעת (כחול). (C)ירידה בפלואורסצנטיות אדומה ממחישה כי תאים מופקים מבארות מוקרן. (D)תמונה פלואורסצנטית בשני צבעים של ממברנות וחיידקים לאחר הקרנה, המציינת הסרה של הידרוג'ל (ירוק) וחיידקים (אדומים) מבארות היעד. (E)Z-stack, תמונת פלואורסצנטיות של שני צבעים של בארות היעד. הקו האדום ב- (D) מציין את מישור xz בתמונה (E), ואת הקו הירוק ב (E) מציין את מישור xy בתמונה (D). דוגמאות בתמונות (C-E) נשטפו להסרת תאים ששוחררו, ולאחר מכן תוקנו וצוו. סרגל קנה מידה = 40 מיקרומטר. הודפס מחדש (מותאם) באישור מ ואן דר Vlies ואח^'17. זכויות יוצרים 2019 אמריקן כימית Soceity. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

כדי לכמת את הכדאיות של תאי החיידקים ואת איכות ה- DNA לאחר החילוץ בפורמט זה, תאי B. subtilis ו- E. coli נזרעו, תרבו, ולאחר מכן שוחררו מערכי מיקרווול באמצעות דפוסי עיגול וטבעת (איור 8A, B). תאים ששוחררו היו אז מצופים על לוחות אגר ATGN, ואת איכות ה- DNA של התאים שחולצו היה כימות. כדי להבטיח כי מספר עקבי של תאים היה נוכח במהלך כל מיצוי, microwells עם עוצמות פלואורסצנטיות דומות (~ 6000 A.U.) ולכן מספר דומה של תאים היו ממוקדים לשחרור. מספר התאים הקימים שחולצו באמצעות תבנית עיגול לא היה שונה באופן משמעותי ממספר התאים הקימים שחולצו באמצעות תבנית טבעת עבור כל אחד מהחיידקים (איור 8C). כמו כן, רמות איכות הדנ"א לא היו שונות באופן משמעותי בין דפוסי המעגל והטבעת עבור אף אחד מהחיידקים(איור 8D). לפיכך, בדומה לממצאים בהידרולג'ל בתפזורת, היישום של אור UV בעוצמה ובמשך שצוינו כאן הייתה השפעה זניחה על הכדאיות ואיכות ה- DNA של תאים שחולצו מערכי המיקרווול. ממצאים אלה מראים כי תאי חיידקים בני קיימא ניתן לאחזר באופן סלקטיבי מ microwells עם נזק מינימלי לניתוח במורד הזרם.

איור 8: השפעה של דפוסי חשיפה שונים לאור על הכדאיות של התאים ועל איכות ה-DNA של חיידקים המשתחררים מערכי מיקרווול. (A,B) עבור E. coli ו- B. subtilis, דפוסי עיגול ודפוסי טבעת שימשו להפקת תאים מ 10 מיקרווולים מיקרומטר. תבנית מעגל עם קוטר של 10 מיקרומטר ותבנית טבעת עם קוטר פנימי של 10 מיקרומטר וקוטר חיצוני של 20 מיקרומטר שימשו בניסוי זה להפקת תאים. מיקרווולים עם אותם קטרים שימשו כדי להבטיח שמספר התאים המשוחררים מכל מיקרווול יהיה זהה. (C)הפתרונות שחולצו אז היו מצופים כדי לחשב את CFU / mL שנרכש מכל דפוס חשיפה. ניתוח סטטיסטי לא הראה הבדל משמעותי CFU / mL המתקבל מתבנית מעגל וטבעת עבור E. coli ו- B. subtilis (ערך P > 0.05, n = 6 עבור שני הזנים). (D)ספקטרופוטומטריה שימשה למדידת איכות ה- DNA של תאי E. coli ו- B. subtilis באמצעות דפוסי עיגול וטבעת. כאן, ניתוח סטטיסטי לא הראה הבדל משמעותי באיכות ה- DNA עבור הדפוסים המשמשים (P-value > 0.05, n = 6 עבור שני הזנים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: עיצוב וימצאה של מערכי מיקרווול. (א)טכניקות מיקרו-פיבריות סטנדרטיות הוחלו כדי לפברק מערכי מיקרווול על ופלים מסיליקון. (B)כל מצע כלל 7 x 7 מערכים של בארות בקוטר 10μm עם עומק 20 מיקרומטר ו 30 מיקרומטר המגרש. (C)כל מערך כלל 225 מיקרווולים. נתון זה שונה מברואה ואח '¹⁸. זכויות יוצרים 2021 גבולות מדיה. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

כתב יד זה מדגים את השימוש בהידרוג'לים הניתנים להקרנה ובידוד של חיידקים. החומר והגישה מאפשרים תרבות תפוקה גבוהה, שליטה על מדיה צמיחה ותנאי צמיחה, ומיצוי תאים נקיים ומדויקים בצורה פשוטה וחסכונית. החילוץ דורש רק מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשילוב עם כלי התאורה בדוגמת וניתן לעשות זאת באופן רציף כדי לבודד מטרות תאים מרובות. כל מיצוי לוקח 5-10 דקות לבצע, ועד 30 מושבות ממוקדות הוסרו הידרוג'ל יחיד. יתרון מרכזי של הגישה הוא הסתגלותה למגוון פורמטים שונים של בדיקות, כפי שהודגם כאן עם הקרנה הן של הידרוג'לים בתפזורת והן מערכי מיקרווול. תהליך ההפרדה בשני הפורמטים שימש בהצלחה כדי לבודד חיידקים המציגים התנהגות צמיחה ייחודית עבור genotyping במורד הזרם לאחר תרבית ותצפית מיקרוסקופית, יכולת קריטית לחיבור גנוטיפ התא פנוטיפ. עד כה, אפיונים גנומיים של חיידקים שחולצו מממשקים אלה כללו רצף אמפלייקון 16S לזיהוי אוספים מרובי מינים של חיידקים ממיקרוביומים סביבתיים המייצרים התנהגות צמיחה מתפתחת¹⁸, ולרצף גנום שלם כדי לזהות בהצלחה מוטציות גנטיות הגורמות לפרופילי צמיחה נדירים בתאים הנמצאים בתוך ספריות מוטציות¹⁹.

שימוש הידרוג'ל בתפזורת עבור הקרנת תאים ובידוד הוא הפורמט הפשוט והפשוט ביותר. הידרוג'לים הניתנים לצילום בתפזורת נוצרים במהירות (25 דקות) לאחר ערבוב המבשרים מעל כיסויי זכוכית שקופים כדי לתמצת תאים במטריצה תלת-ממדית של תרבית תאים המצולמת במיקרוסקופ פלואורסצנטיות זקוף או הפוך סטנדרטי. לכן, לשיטה יש פוטנציאל להיות תרגום למעבדות מיקרוביולוגיה נפוצות שאין להן משאבי מיקרו-פיבריות או מומחיות. החיסרון בפורמט זה הוא שהתאים מכוונים באופן אקראי לאורך ההידרוג'ל התלת מימדי. לכן, תאים יכולים להופיע מחוץ למישור המוקד כאשר הדמיה עם מטרות הגדלה גבוהות יותר ומיצוי יכול להיות קשה אם מושבות התאים מכוונות קרוב מדי זו לזו או אם יש שכבת-על אנכית של מושבות. הפקדת הידרוג'ל דק (<13 מיקרומטר) כמתואר היא קריטית כדי להקל על חיסרון זה. חשיפה בדפוסי אור צולב שבורים(איור 4B) עדיפהכאן, שכן דפוס זה גורם לתאים ללא הידרוג'ל שיש להם חשיפה מינימלית לאור UV וניתן לשחזר אותם בקלות באמצעות ציפוי.

לעומת זאת, פורמט מערך microwell מספק ממשק מבוקר יותר, כמו תאי חיידקים מחולקים microwells נפרד המשמשים תרבות קטנה או אתרי תרבויות משותפות^17,18,26. ממד מיקרווול, גובה וצפיפות מפוברקים בדיוק בטכניקות פוטוליתוגרפיות סטנדרטיות. בהשוואה הידרוג'ל בתפזורת, חיידקים ניתן לחלץ מערכי microwell עם רמה גבוהה יותר של ספציפיות וסיכוי נמוך יותר של זיהום צולב, כמו התאים נמצאים רק במקומות מוגדרים מראש, לא מפוזרים באופן אקראי ברחבי הידרוג'ל. הריכוז והיחסים של תאי חיידקים בתמיסת הזריעה יכולים גם להיות מגוונים כדי לשלוט בכמות ובהרכב של אינוקולום microwell באמצעות תהליך זריעה שהתאפיין בדוחות קודמים²⁶, נותן למשתמש גמישות בעיצוב הניסיוני של המסך. החיסרון העיקרי של סינון עם פורמט מערך microwell הוא הזמן הנוסף ואת המומחיות הנדרשים עבור microfabrication. ייצור מיקרווולים הוערך בעלות של כ-10 דולר למערך, הכולל עלויות חומרים והוצאות חדר נקי. בנוסף, מערכי microwells עשויים באופן מסורתי מסיליקון, אשר יכול לגרום קשיי הדמיה שכן המצעים אינם שקופים. יתר על כן, כמות גבוהה של פיזור אור מפני הסיליקון יכולה להגביל את ההדמיה בתוך המיקרווולים ויכולה להקטין את רזולוציית התבנית במהלך חשיפה להידרוג'ל עם אור UV מכלי התאורה המעוצב (באיור 8A,B). מיקרווולים דומים מפוברקים על מצעים קוורץ שקופים כדי לטפל בסוגים אלה של מגבלות²⁷; עם זאת, ייצור זה הוא הרבה יותר קשה. חשיפה לדפוסי טבעת המאירים את היקף הבאר עדיפה כאן לשחרר תאים חופשיים מהבארות תוך מזעור החשיפה לקרינת UV.

הבעיה הנפוצה ביותר המתרחשת בכל פורמט היא ניתוק ההידרוג'ל מהמצע הבסיסי במהלך התרבות עקב נפיחות הידרוג'ל. אם זוהי בעיה עבור הידרוג'ל בתפזורת, נוכחות, צפיפות ואחידות של קבוצות תיול בשכבת ההתקשרות הכימית (MTPS) על פני השטח של כיסוי זכוכית הבסיס יש לאמת באמצעות טכניקת אפיון פני השטח המתאימה (XPS, ATR-FTIR, AFM וכו '). צפיפות נמוכה של קבוצות תיול פני השטח עקב פונקציונליזציה משטח לא יעיל יכול להוביל אינטראקציה חלשה בין המצע לבין הידרוג'ל. אם מתרחשת רמה נמוכה של תיבולציה על פני השטח, יש לבדוק את היציבות של פתרון MTPS. יש להקפיד בניקוי הראשוני של מגלשת הזכוכית כדי להבטיח משטח נקי לפני טיפול MTPS, ויש לנקוט בזהירות כדי להבטיח את השימוש בטולואן נטול מים במהלך תגובת פני השטח של MTPS (פרוטוקול סעיף 4). במקרה של מערכי microwell, משטחים אינם thiolated, הידרוג'ל במקום לצרף דרך מילוי חלקי של בארות עם הידרוג'ל, אשר מעגן את הידרוג'ל למצע הסיליקון¹⁷. אם ניתוק הידרוג'ל הוא בעיה במערכת זו, יותר microwells או תכונות microscale אחרות ניתן לחרוט לתוך המערך כדי לעגן עוד יותר את הידרוג'ל למצע כדי לקדם התקשרות חזקה יותר.

מגבלה של הטכניקה בכל אחד מהפורמטים היא היציבות המוגבלת של ההידרוגלים בנוכחות חיידקים. צוין כי חיידקים מסוימים, כגון A. tumefaciens, יכול לבזות את ההידרוג'ל במהלך 5-7 ימים^17,19, אשר מגביל את זמן הניסוי. החקירה הנוכחית של מנגנוני השפלה חיידקית נמצאת בעיצומה; ההשערה היא כי קבוצות אסתר הנוכחיות מן המונומרים ניאקרילט כפופים הידרוליזה בתיווך חיידקים ו / או השפלה אנזימטית, כפי שצוין במערכות אחרות¹⁷. פיתוח כימיה הידרוג'ל יציבה יותר יאריך את הזמן שבו חיידקים יכולים להישאר בהידרוג'ל וירחיב את המסך למיקרואורגניזמים עם שיעורי צמיחה איטיים יותר. מגבלה שנייה היא כי בשתי הפורמטים, שחזור התא ומיצוי להתרחש בסביבה פתוחה, וכתוצאה מכך נפחי מיצוי גבוהים יחסית (30-100 μL), אשר יכול להיות רגיש לזיהום חיצוני. לכן, יש לתת טיפול כדי להבטיח מספיק תאים נוכחים ממושבות היעד תוך מזעור נפח פתרון החילוץ. כדי להשיג מספיק תאים ל ציפוי והתאוששות או להפקת חומר DNA, נצפתה כי הידרוג'ל בתפזורת, תאים חייבים להיות בתרבית מספיק זמן כדי להגיע קטר המושבה של לפחות 10 מיקרומטר. כדי להנמיך את הנפח הנדרש להפקת תאים, נצפתה כי השימוש במזרק מיקרוליטר וצינורות (איור 2) היה יעיל יותר מאשר צנרת. הצינורות אפשרו לבודדים להילקח מנקודת השחרור בצורה מדויקת יותר, מה שדורש פחות נפח פתרון והורדת הסיכוי לזיהום.

עבודה עתידית כרוכה בהבנת ההשפעה של תכונות מכניות הידרוג'ל על צמיחת התא, כמו תכונות מכניות של הידרוג'ל אלה נשלטים היטב על ידי הבחירה של מבשרי מונומר מבוסס PEG מתאימים של משקולות מולקולריות שונות²⁸, ואינטראקציות מכניות ככל הנראה לשחק תפקיד חשוב בהתנהגות חיידקים²⁹. כמו חומרים הידרוג'ל ניתן לשלב בקלות לתוך מגוון רחב של מערכות והתקנים שונים, פיתוח נוסף מתמקד גם בשילוב של חומר זה לתוך מערכות microfluidic. זה יפחית את פתרון החילוץ femtoliter כדי כרכים picoliter, לעומת אמצעי אחסון 30-100 μL מסורתיים הנדרשים כעת בתבנית האוסף הפתוח. נפחי פתרונות קטנים יותר יפחיתו מאוד את הזיהום הפוטנציאלי ויזיזו את הגישה לבידוד ואפיון של תאים בודדים.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-מרקפטופרופיל) טריאתוקסיסילן	סיגמא-אולדריץ'	175617-25 גרם	> 95%
אבקת ניקוי אלקונוקס	אלקונוקס	1104
אמוניום גופרתי	פישר כימיקל	A702-500	מוסמך ACS חיטוי גרגירי
SK300C	Yamato Scientific	18016
Bacillus subtilis 1A1135	Bacillus Genetic Stock Center	1A1135
מיקרוסקופ זקוף ברייטפילד	תאגיד אולימפוס	BX51
סידן כלורי,	פישר כימיקל	C614-500	לכדורי ייבוש, 4-20
צנטריפוגת רשת 5702	Eppendorf	5702
חומצת לימון מונוהידראט	סיגמא-אולדריץ'	C1909-500G	מגיב ACS, > 99.0%
D-גלוקוז ( דקסטרוז)	VWR אמרסקו מדעי החיים	0188-1KG
Dneasy דם & ערכת רקמות	Qiagen	69504	ערכת טיהור DNA
DOWSIL 184 בסיס אלסטומר סיליקון	Dow Silicones Corporation		טמפרטורת אחסון: -30-60 & deg; C
DOWSIL 184 חומר ריפוי אלסטומר סיליקון	Dow Silicones Corporation		טמפרטורת אחסון: < 32 C
EPOCH2 ספקטרופוטומטר מיקרופלייט	BioTek Instruments	EPOCH2
Escherichia coli ATCC 25922	Thermo Fisher Scientific	R19020
אתנול, נטול מים	פישר כימיקל	459844
פישרברנד זכוכית כיסוי מיקרוסקופ	פישר סיינטיפיק	12540A
שקופיות מיקרוסקופ פרימיום של פישר רגיל	פישר סיינטיפיק	12-544-4
תמיסת מי חמצן	סיגמא-אולדריץ'	216763-500 מ"ל	מכיל מעכב, 30% משקל ב-H2O
Incu-Shaker Mini	Benchmark	E5-0014-01
איזופרופנול	סיגמא-אולדריץ'	190764
מגנזיום גופרתי, 7-hydrate	Macron Fine Chemicals	6066-04	Avantor Performance Materials, Inc.
מתנול	סיגמא-אולדריץ'	179337-4L	מגיב ACS, > 99.8%
NanoDrop ספקטרופוטומטר אחד	Thermo Scientific	ND-ONEC-W
חנקן, דחוס	Matheson	UN1066
מנקה פלזמה חמצן	Harrick Plasma	PDC-001-HP
Pentaerythritol טטרה (מרקפטואתיל) פוליאוקסיאתילן (4 זרועות-PEG)	NOF America Corporation	PTE-100SH	Sunbright-PTE-100SH
תמיסת מלח פוספט חוצץ (PBS), 10X	VWR Amresco Life Science	K813-500ML	חנות בין 15 מעלות; C– 30 מעלות; C
פולידימתיל סילוקסן (PDMS) Slygard 184	Dow Corning	4019862
Polygon400	Mightex	DSI-D-000
שקופיות מיקרוסקופ פרימיום	פישר סיינטיפיק	12-544-4	25 x 75 x 1 מ"מ
נתרן ביקרבונט	סיגמא-אולדריץ'	S5761-500G
נתרן כלורי	סיגמא מדעי החיים	S5886-500G	Bioreagent, מתאים לתרבית תאים
נתרן הידרוקסיד	Sigma-Aldrich	S8045-500G	BioXtra, > 98%, כדורים (נטולי מים)
נתרן פוספט מונו-בסיסי דיהידראט	סיגמא-אולדריץ'	71505-250G	BioUltra, לביולוגיה מולקולרית, > 99.0% (T)
מד עובי נירוסטה	מוצרי מותג מדויק	77739
חומצה גופרתית	סיגמא-אולדריץ'	320501-2.5 ליטר
טולואן, נטול מים, 99.8%	סיגמא-אולדריץ'	244511-1 ליטר	נטול מים, > 99.8%
טריכלורו (1H,1H,2H,2H,2H perfluorooctyl) סילאן (TPS), 97%	סיגמא-אולדריץ'	448931-10G
מרק סויה טריפטי	סיגמא-אולדריץ'	22092-500G	למיקרוביולוגיה
Super Nuova Digital Hot Plate Stirrer	Thermo Scientific	S131825
סוניקטור אולטרסאונד	פישר סיינטיפיק	FS-110H