מאמר שיטה

פלואורסצנטיות בין פאתית בהכלאה במקום היברידיות של מריחות מח עצם של מיאלומה נפוצה

DOI:

10.3791/63083

⸱

15 באפריל 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hematology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, 2Wuhan National Laboratory for Optoelectronics, Huazhong University of Science and Technology

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשיפור ההצלחה של פלואורסצנטיות בין פאזית בזיהוי הכלאה במקום על מריחות מח עצם מחולי מיאלומה נפוצים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פלואורסצנטיות בזיהוי הכלאה במקום (FISH) היא שיטה הכרחית בריבוד סיכונים גנטיים במיאלומה נפוצה (MM), שהיא אחת ממאירות המטולוגיות הנפוצות ביותר. המאפיין המזהה של MM מצטבר תאי פלזמה ממאירים במח העצם. דוחות דגים עבור MM מתמקדים בעיקר בתאי פלזמה קלונליים מטוהרים או מזוהים, ולא בכל התאים הגרעינים, על ידי מיון עם חרוזים מגנטיים נגד CD138 או סימון עם שרשרת אור אימונוגלובולין ציטופלסמית κ או λ. גרעינים אינטרפאזי מח עצם מתקבלים בדרך כלל מתאי מח עצם טריים. עם זאת, העשרה משביעת רצון של דגימות תאי פלזמה דורשת כמויות גדולות של מח עצם טרי נגד מח עצם, אשר לא ניתן להשיג במקרה של מיצוי מח עצם קשה או ברז יבש מח עצם. בזאת, אנו מקימים שיטה חדשנית כדי לשפר את ההצלחה של זיהוי דגים על כתמי מח עצם מוכתמים או לא מוכתמים. כתמי מח עצם קלים יותר להשגה מאשר דגימות מח עצם נוגדות קרישה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיאלומה נפוצה (MM) היא מחלת תאי פלזמה ממאירים (PC) עם הטרוגניות ביולוגית חזקה והבדלים אישיים גדולים ביעילות קלינית, עם תקופות הישרדות הנעות בין חודשים לעשורים. מאפיינים ציטוגנטיים הם אינדיקטורים פרוגנוסטיים חשובים של MM. מערכת ריבוד הסיכון וטיפולים מותאמים אישית המבוססים על מאפיינים גנטיים הפכו לנושאים בעלי עניין רב במחקר קליני על MM1. הסטיות של מחשבים שנבדקו בפלואורסצנטיות בלוח היברידיזציה של סיטו (FISH) של מח העצם (BM) כוללות דל 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t(4;14) (IGH/FGFR3), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t (14:20) (IGH/MAFB), 1q21 (CKS1B) רווח/הגברה, ומחיקת 1p (CDKN2C).

ציטוגנטיקה מטפאזה סטנדרטית צריכה להיכלל בהערכה הראשונית של חולי MM. למרות kryotyping רגיל G-פס מציע את היתרון של ניתוח כרומוזום שלם, התשואה הנמוכה של שיטה זו מובילה לתוצאות שליליות כוזבות רבות2. באופן מסורתי, מחשבים נתפסו כבלתי מסוגלים במידה רבה לפיצול מכיוון שהם המוצרים הסופיים של בידול לימפוציטים B. הדבר מקשה על השגת תמונות מפוצלות. ניתוח ציטוגנטי משופר ב- MM עם תרביות לטווח ארוך (6 ימים) וגירוי של תרבויות על ידי ציטוקינים עשוי להיות שיטה מבטיחה לזיהוי חריגות ציטוגנטיות בחולי MM שאובחנו לאחרונה3. גם כאשר זמן התרבות היה ממושך עד 6 ימים, עם זאת, חריגות ציטוגנטיות דווחו במדויק ב 30%-50% של חולי MM4. יתר על כן, MM מאופיין בסטיות ציטוגנטיות מורכבות המשקפות את ההטרוגניות הפרוגנוסטית שלו. עם זאת, הרזולוציה של טכנולוגיית פסים כרומוזום מסורתית היא נמוכה, אשר עלול בקלות להוביל לזיהוי חסר של חריגות כרומוזומלי ב- MM.

דג אינטרפאזה, רצוי לאחר CD138-חיובי חרוז מגנטי מבוסס מיון מחשב או סימון עם שרשרת אור אימונוגלובולין cytoplasmic κ/λ, הוא הכרחי בניתוח של MM5,6. מדגם נבחר CD138 חיובי מומלץ מאוד עבור התשואה הממוטבת של תאים סרטניים. עם זאת, כמות מדויקת של סטיות ציטוגנטיות דורשת לפחות 4 מ"ל של BM אנטי-קולוגי למיון מחשב. בנוסף, השילובים של מיון חרוזים אימונומגנטיים CD138 עם FISH או אימונוגלובולין שרשרת אור ציטופלסמית κ /λ עם בדיקות דגים (cIg-FISH) להגדיל עלויות ניסיוניות רבות והם גוזלים זמן רב.

בדרך כלל, יחס המחשב מוערך תחילה מהבדיקה המורפולוגית של מריחות BM מוכתמות או מקטעי ביופסיה BM7,8. דגימות BM באיכות הגבוהה ביותר (דגימות שאיפה של מח ראשון) משמשות לבדיקות מורפולוגיות, ואילו אלה שנשלחו לדוג או לגילוי אחר הן לעתים קרובות דגימות שאיפה משניות עם יחס גבוה של דילול עם דם היקפי.

כבר בשנות ה-90 של המאה ה-20, מחקרים רבים הראו כי מריחות BM יכולות לשמש ישירות לבדיקות דגים ביניים, שהוכיחו את עצמן כשיטה אמינה וניתן לחזור עליהן9. מחקר אלגנטי המבוסס על מורפולוגיה של תאים וציטוכימיה אסטראז בשילוב עם FISH של דם היקפי וכתמי BM אישר את המשמעות הקלינית הגדולה שלו להבהרת חריגות כרומוזומליות בחולים עם לוקמיה גרנולוציטית ולימפוציטית10.

להלן, אנו מספקים שיטה חדשנית לשיפור ההצלחה של זיהוי דגים interphase בחולי MM.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נערך על פי עקרונות הצהרת הלסינקי ואושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים דז'ונגנן של אוניברסיטת ווהאן (מס ' 2019065). הדגימות נאספו מחולה MM במחלקה להמטולוגיה, בית החולים דז'ונגנן של אוניברסיטת ווהאן (סין).

1. הכנת מריחות BM

  1. מניחים את פתרון ה-0.2 מ"ל הראשון של BM על מגלשת זכוכית חד פעמית נקייה.
  2. מורחים את כתמי BM לעובי אחיד עם זנבות חדים על ידי הסרה מהירה של ה- BM. לאחר מכן, יבש באופן טבעי.
  3. לכסות את סרטי BM עם 1 מ"ל של פתרון רייט-Giemsa עבור כ 10 שניות בטמפרטורת החדר.
  4. הוסף 1 מ"ל של מאגר פוספט לשקופיות.
    הערה: יש להקפיד למנוע מתמיסת הצבע להתייבש או לזרום מהמגלשות.
  5. מערבבים את תמיסת הצבע בעדינות ושומרים עליה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. שוטפים את המגלשות במים נקיים ומייבשים אותן באוויר בטמפרטורת החדר.
  7. השתמש במיקרוסקופיה של אור קדמי כדי לזהות מחשבים ממאירים. המחשבים צריכים להיות מפוזרים היטב.

2. דגים טרום עיבוד של כתמי BM

  1. לכסות את האזור ההיברידי עם פתרון קבוע במשך 10 דקות כדי לשנות צבע ולתקן את המחשבים.
    1. להכנת פתרון קבוע טרי, יש לערבב מתנול עם חומצה אצטית קרחונית ביחס נפח של 3:1.
  2. שטפו את המגלשה במים שעברו דה-יוניזציה (dH2O) וייבשו אותה באוויר בטמפרטורת החדר.
  3. מחממים צנצנת המכילה 2x SSC חוצץ עד 56 °C (56 °F) באמבט מים. יש לדלל את המאגר ל-20x SSC לפני השימוש.
    1. כדי להכין 20x SSC, לערבב ביסודיות 176 גרם של נתרן כלורי ו 88 גרם של נתרן ציטראט עם 800 מ"ל של dH2O. למדוד את ה- pH ולהתאים ל- pH 5.3 ± 0.2. לאחר מכן, הוסף dH2O כדי להביא את אמצעי האחסון הסופי ל- 1 L.
  4. לשטוף את משטח BM מוכן במאגר 2x SSC שחומם מראש במשך 10 דקות, ואחריו לטבול אותו לתוך מים deionized בטמפרטורת החדר.
  5. מייבשים את המריחה בשיפוע אתנול (70%, 85%, ו-100% אתנול, כל אחד למשך דקה אחת). מייבשים את ההמרחה במשך 10 דקות.

3. BM למרוח דגים ושטיפה

הערה: כל השלבים בוצעו בחדר חשוך כדי למנוע מרווה פלואורסצנטית.

  1. הוסף את תערובת הבדיקה TP53/centromere של כרומוזום 17 (CEP17) לאזור ההיברידיות וכסה אותה בהחלקת כיסוי. לחץ בעדינות עם פינצטה מחודדת עדינה כדי להסיר בועות אוויר מלמטה.
  2. לאטום את כל הצדדים של כיסוי כיסוי עם מלט גומי כדי להבטיח הידוק טוב.
  3. לאחר התגבשות של מלט הגומי, מניחים את השקופית על מכונת FISH אוטומטית. בצע denaturation ב 78 °C (78 °F) במשך 5 דקות, ואחריו הכלאה ב 37 °C (50 °F) לילה.
  4. תרים את השקופית ממכונת הדגים. השתמש פינצטה מחודדת עדינה כדי להסיר את מלט הגומי בעדינות.
  5. יש לטבול את המגלשה ב-2x SSC בטמפרטורת החדר למשך כדקה או שתיים כדי לשטוף את המכסה.
  6. לשטוף את השקופית ב 68 °C (68 °C) מחומם מראש 0.4x SSC / 0.3% NP-40 חוצץ באמבט מים במשך 2 דקות.
    1. הכן פתרון 0.4x SSC/0.3% NP-40 על ידי ערבוב יסודי של 20 מ"ל של 20x SSC (pH 5.3) עם 950 מ"ל של dH2O. לאחר מכן, מוסיפים 3 מ"ל של NP-40 ומערבבים היטב עד להמסה מלאה. מדוד את ה- pH והתאם ל- 7.0-7.5 עם NaOH. לאחר מכן, הוסף dH2O כדי להביא את אמצעי האחסון הסופי של הפתרון הכולל ל- 1 L.
  7. לשטוף את השקופיות עם 2x SSC באמבט מים 37 °C (37 °F) במשך 1 דקות. מוגדר זקוף בחושך להתייבש ביסודיות במשך 10 דקות.
  8. הוסף 10 μL של DAPI לאזור ההיברידי וכסה עם כיסוי.

4. ניתוח הדגים והדמיה

  1. הצג את השקופית ההיברידית באמצעות ערכת מסננים מתאימה במיקרוסקופ פלואורסצנטי.
  2. השתמש במסנן אופטי פלואורופור כחול מונוכרומטי כדי לבחון את עוצמת הפלואורסצנטיות של גרעין התא. קח תמונות גרעין תא תחת ערכת מסננים של DAPI.
  3. השתמש בבדיקת צנטרומר כרומוזום כדי להראות כמה כרומוזומים תא מכיל. תווית CEP17 עם פלואורסצנטיות ירוקה. השתמש במסנן אופטי פלואורופור ירוק ספקטרום כדי לבחון את המיקום של CEP17. צלמו תמונת אותות CEP17 מתחת לערכת המסננים הירוקה.
  4. סמן את הגן TP53 בפלואורסצנטיות כתומה. השתמש במסנן אופטי פלואורופור כתום ספקטרום כדי לצפות TP53. קח תמונת אותות TP53 מתחת לערכה זו.
  5. מזג את שלוש התמונות הללו ובחן אותן לאיתור חריגות מספריות.
    הערה: בתא בין-פאזי רגיל, שני אותות כתומים ושני אותות ירוקים נצפים בתוך גרעין עם פלואורסצנטיות כחולה, המציינים זוג אחד של כרומוזום 17 רגיל (איור 1).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בהערכה המורפולוגית הראשונית של חולה MM שאובחן לאחרונה, 15% מהמחשבים במריחת BM נמצאו בעלי גרעינים גדולים וכהים יותר יחד עם כמויות גדולות יותר של ציטופלסמה ממחשבים רגילים (איור 2A). הצינור הראשון של BM אנטי-קרישה הפרין שזוהה על ידי טכניקת אימונופנוטיפ חשף רק 2.3% מהמחשבים החריגים חד שבטיים. מיון חרוזים אימונומגנטיים CD138 בשילוב עם FISH או טכניקת cIg-FISH חיוני להשגת תוצאה מדויקת של FISH. עם זאת, BM שאפתנית מוגבלת במקרה של זה להיות ברז יבש. כתמי BM שימשו לבדיקת דגים בין-פאזיים. מחשב בינוקלציה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היישום של דגים לריבוד סיכון גנטי ב- MM הוא חיוני. החלק הקריטי של דוחות FISH הוא לא כל התאים הגרעינים, אבל מחשבים קלונליים מטוהרים או מזוהים במיוחד על ידי מיון עם חרוזים מגנטיים נגד CD138 או סימון עם שרשרת אור אימונוגלובולין ציטופלסמית κ או λ. אינטרפאזה FISH לאחר מיון מחשב או cIg-FISH נמצאה משמעותית באבחון של MM בשל השיעור הנמוך יחסית של מחשבים ב- BM. עם זאת, לשיטות אלה יש כמה חסרונות, כולל תהליכים מורכבים, דרישות דגימה גבוהות ועלויות ניסיוניות גבוהות. חמישים מחשבים יכולים להיות ממוקמים במהירות על ידי קליפר ורנייה שלב מיק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרויקט זה נתמך על ידי קרן החדשנות של WNLO 2018WNLOKF023.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מכונת FISH אוטומטיתLeica  תאגידS500-24סופי Assy Thermobrite 240V
DAPIאבוט מולקולרי בע"מ06J49-001DAPI תוכנת
ניתוח FISHIMSTAR  תאגידIMSTARFISH Analysis Software
FISH ProbeAbbott Molecular Inc.05N56-020Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH ערכת בדיקה
בנפח קבועEppendorf סין בע"מM33768H10  מיקרוסקופ
פלואורסצנטיOlympus CorporationBX53מיקרוסקופ פלואורסצנטי
קדימה תוכנת ניתוח קריוטיפIMSTAR  תאגידIMSTARKaryotype ניתוח תוכנה
מיקרוסקופ אוראולימפוס  תאגידBX41מיקרוסקופ אור קדמי
NP-40אבוט מולקולרי בע"מ07J05-001NP-40
מתלה צביעה מכתמי פלסטיקגואנגג'ואו Kaixiu מסחר ושות', בע"מRSJ-501  24 שקופיות
פלסטיק מכתים צביעה טנקגואנגג'ואו Kaixiu מסחר ושות', בע"מRSJ-516  24 שקופיות
גומי צמנטMarabu  GmbH & חברתKG FixoGum מלט גומי
SSCאבוט מולקולרי בע"מ02J10-03220&פעמים; אמבט מים SSC
שנחאי Boxun רפואי ביו-מכשיר ושות', בע"מDK-8Dאמבט מים מרובה טמפרטורות
נגד כתמים פיפטה מיקרוליטר

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sonneveld, P., et al. Treatment of multiple myeloma with high-risk cytogenetics: a consensus of the International Myeloma Working Group. Blood. 127, 2955-2962 (2016).
  2. Radbruch, A., et al. Competence and competition: the challenge of becoming a long-lived plasma cell. Nature Reviews Immunology. 6, 741-750 (2006).
  3. Lai, J. L., et al. Improved cytogenetics in multiple myeloma: a study of 151 patients including 117 patients at diagnosis. Blood. 85 (9), 2490-2497 (1995).
  4. Hallek, M., Bergsagel, P. L., Anderson, K. C. Multiple myeloma: increasing evidence for a multistep transformation process. Blood. 91, 3-21 (1998).
  5. Munsh, N. C., et al. Consensus recommendations for risk stratification in multiple myeloma: report of the International Myeloma Workshop Consensus Panel 2. Blood. 117, 4696-4700 (2011).
  6. Gole, L., et al. cIg-FISH On Patients with Multiple Myeloma - A Modified and Simple Technique Easily Incorporated Into Routine Clinical Service. Blood. 120, 4792-4792 (2012).
  7. Lee, S. H., Erber, W., Porwit, A., Tomonaga, M., Peterson, L. I. C. S. I. Hematology, ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports. International Journal of Laboratory Hematology. 30, 349-364 (2008).
  8. Štifter, S., et al. Combined evaluation of bone marrow aspirate and biopsy is superior in the prognosis of multiple myeloma. Diagnostic Pathology. 5, 30(2010).
  9. Huegel, A., Coyle, L., McNeil, R., Smith, A. Evaluation of interphase fluorescence in situ hybridization on direct hematological bone marrow smears. Pathology. 27, 86-90 (1995).
  10. Jacobsson, B., Bernell, P., Arvidsson, I., Hast, R. Classical morphology, esterase cytochemistry, and interphase cytogenetics of peripheral blood and bone marrow smears. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1303-1309 (1996).
  11. Dunning, K., Safo, A. The ultimate Wright-Giemsa stain: 60 years in the making. Biotechnic & Histochemistry. 86, 69-75 (2011).
  12. Woronzoff-Dashkoff, K. K. The wright-giemsa stain. Secrets revealed. Clinics in Laboratory Medicine. 22, 15-23 (2002).
  13. McPherson, R. A., Pincus, M. R. Henry's Clinical diagnosis and Management by Laboratory Methods E-book. Elsevier Health Sciences. , (2017).
  14. Ross, F. M., et al. Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders. Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

FISHTP5317CD138

מאמרים קשורים