ריכוז סוכרוז אופטימלי נקבע למיצוי גליקוגן בכבד באמצעות צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות סוכרוז. תוספת של שלב רתיחה של 10 דקות לעיכוב אנזימים מפרקים גליקוגן הוכחה כמועילה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מיצוי מולקולות גליקוגן בכבד לקביעת מבנה הגליקוגן
במאמר זה
סיכום
תקציר
גליקוגן בכבד הוא פולימר גלוקוז היפר-מסועף המעורב בשמירה על רמות הסוכר בדם אצל בעלי חיים. תכונות הגליקוגן מושפעות מהמבנה שלו. לפיכך, שיטת מיצוי מתאימה המבודדת דגימות מייצגות של גליקוגן חיונית לחקר מקרומולקולה זו. בהשוואה לשיטות מיצוי אחרות, שיטה המשתמשת בשלב צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות סוכרוז יכולה למזער את הנזק המולקולרי. בהתבסס על שיטה זו, פורסם לאחרונה המתאר כיצד צפיפות תמיסת הסוכרוז המשמשת במהלך הצנטריפוגה השתנתה (30%, 50%, 72.5%) כדי למצוא את הריכוז המתאים ביותר לחילוץ חלקיקי גליקוגן במגוון רחב של גדלים, מה שהגביל את אובדן החלקיקים הקטנים יותר. שלב הרתחה של 10 דקות הוכנס כדי לבדוק את יכולתו לנטרל אנזימים מפרקים גליקוגן ובכך לשמר גליקוגן. ריכוז הסוכרוז הנמוך ביותר (30%) ותוספת שלב הרתיחה הוכחו כמיצוי הדגימות המייצגות ביותר של גליקוגן.
מבוא
גליקוגן הוא פולימר מורכב והיפר-מסועף של גלוקוז המצוי בבעלי חיים, פטריות וחיידקים1. ביונקים, הגליקוגן בכבד מתפקד כחוצץ גלוקוז בדם, המשמר את ההומאוסטזיס, בעוד הגליקוגן בשריר פועל כמאגר גלוקוז לטווח קצר כדי לספק אנרגיה ישירות2. מבנה הגליקוגן מתואר לעתים קרובות על-ידי שלוש רמות (מוצגות באיור 1): 1. שרשראות ליניאריות נוצרות על-ידי מונומרים של גלוקוז באמצעות (1→4)-α קשרים גליקוזידיים, כאשר נקודות ההסתעפות מחוברות באמצעות (1→6)-α קשרים גליקוזידיים; 2. חלקיקי β מסועפים מאוד (~ 20 ננומטר קוטר) אשר, במיוחד ברקמות כגון שרירי השלד, פועלים כמולקולות גליקוגן עצמאיות 3,4<....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כבדי עכברים ששימשו לאופטימיזציה של הליך זה21 היו מ-12 עכברי רקע זכרים מסוג BKS-DB/Nju (בני 7.2 שבועות, ראו טבלת חומרים). השימוש בבעלי חיים אושר על ידי בית החולים רנמין של ועדת הטיפול והאתיקה בבעלי חיים של אוניברסיטת ווהאן, גיליון IACUC מס '. WDRM 20181113.
1 רקמות בעלי חיים
- לשקול כבד עכבר (1-1.8 גרם של כבד שלם מכל עכבר).
- להקפיא במהירות את כבד העכבר בחנקן נוזלי ולאחסן אותו ב -80 ° C.
2. הכנת חיץ וריאגנטים
- הכינו מאגר בידוד גליקוגן המכיל 5 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF ו-5 mM נתרן פירופוספט עם מים נטולי יונים, וכוונן את ה- pH ל....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בעוד שההליך המתואר לעיל הוא לשיטה האופטימלית ביותר (30% סוכרוז בתוספת שלב רתיחה של 10 דקות), הנתונים מסופקים כאן עבור גליקוגן המופק באמצעות שלושה ריכוזי סוכרוז (30%, 50%, 72.5%), עם וללא שלב רותח, כפי שתואר קודם לכן21. בעקבות הפרוטוקול, הטוהר, התפוקה הגולמית ותפוקת הגליקוגן של גליקוגן יבש המופק בתנאים שונים ניתנים בטבלה 1, שהועתקהמ-21. לא נמצאו הבדלים משמעותיים בתפוקת הנפט הגולמי ובתפוקת הגליקוגן בין הקבוצות שהופקו בתנאים השונים. לעומת זאת, טוהר הגליקוגן הו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מחקרים קודמים הראו כי מבנה הגליקוגן חשוב לתכונותיו; לדוגמה, הגודל המולקולרי משפיע על קצב ההתפרקות של גליקוגן10, והתפלגות אורך השרשרת משפיעה על מסיסותו26. כדי להבין כראוי את היחסים הללו, חשוב לחלץ גליקוגן בהליך המבודד, ככל האפשר, דגימה מייצגת ולא פגומה. שיטות מיצוי מסורתיות השתמשו בתנאי אלקליין חם או חומצה קרה. בעוד שהן יעילות בהפרדת הגליקוגן מרכיבי רקמה אחרים, שיטות אלה הן קשות מבחינה כימית והוכחו כפוגעות במבנה המולקולרי של גליקוגן27.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
תודות
המחברים אסירי תודה למר גאושנג וו ולמיס יונוון ג'ו על הסיוע הטכני עם FACE ולמר ג'נשיה הו ומר דנגבין על הסיוע הטכני עם SEC. MAS נתמכת על ידי מלגת מחקר התעשייה של קווינסלנד מתקדמת, קרן מאטר, נאמני הון ונאמנויות L G McCallam Est וג'ורג' וויבר. עבודה זו נתמכה על ידי התוכנית האקדמית המועדפת של מוסדות להשכלה גבוהה בג'יאנגסו, קרן מדעי הטבע של סין C1304013151101138 מענקים, ותוכנית הכישרונות לחדשנות ויזמות של ג'יאנגסו לשנת 2017. איור 1-5 נוצרו באמצעות BioRender.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonate (APTS) | SIGMA Aldrich | 9341 | תמיסת 0.1 M |
| חומצה אצטית | SIGMA Aldrich | 695092 | 0.1 M, pH 3.5 תמיסת Agilent |
| 1260 Infinity SEC system | Agilent, סנטה קלרה, קליפורניה, ארה"ב | כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC) | |
| BKS-DB/Nju עכברי רקע | המחקר הביו-רפואי של נאנג'ינג של אוניברסיטת נאנג'ינג | ||
| ערכת בדיקת D-גלוקוז (פורמט GOPOD) | מגה-זים | K-GLUC | |
| חומצה אתילנדיניטרילוטטראצטית (EDTA) | SIGMA Aldrich | ||
| IKA | T 25 | ||
| חומצה הידרוכלורית | SIGMA Aldrich | 2104 | תמיסה 0.1 M |
| חומצה הידרוכלורית | SIGMA Aldrich | 2104 | תמיסה 0.1 M |
| מערכת P / ACE MDQ plus Ab | Sciex, ארה"ב | אלקטרופורזה של פחמימות בסיוע פלואורופור (FACE) | |
| גלאי מקדם שבירה | Optilab UT-rEX, וויאט, סנטה ברברה, קליפורניה, ארה"ב) | כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC) | |
| נתרן אצטט | SIGMA Aldrich | 241245 | 1 M, תמיסת pH 4.5 |
| נתרן אזיד | SIGMA Aldrich | S2002 | |
| נתרן כלורי | SIGMA Aldrich | S9888 | |
| נתרן ציאנובורוהידריד | SIGMA Aldrich | 156159 | תמיסה 1 M |
| נתרן פלואוריד | SIGMA Aldrich | 201154 | |
| נתרן הידרוקסיד | SIGMA Aldrich | 43617 | תמיסה 0.1 M |
| נתרן חנקתי | SIGMA Aldrich | NISTRM8569 | |
| נתרן פירופוספט | SIGMA Aldrich | 221368 | |
| Sucrose | SIGMA Aldrich | V90016 | |
| SUPREMA קדם עמודה, 1,000 ו-10,000 עמודות | שירותי תקני פולימרים, מיינץ, גרמניה | כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC) | |
| Trizma | SIGMA Aldrich | T 1503 | |
| צינורות אולטרה-צנטריפוגה | בקמן | 4 מ"ל, צינור פתוח בעל דופן דקה, 11 x 60 מ"מ |
מקורות
- Hills, D. M., Heller, H. C., Hacker, S. D., Hall, D. W., Sadava, D., Laskowski, M. Life: the science of biology. 12th edn. Freeeman, W. H. , (2020).
- Calder, P. C., Geddes, R. Glycogen of high molecular weight from mammalian muscle. Carbohydrate Research. 135 (2), 249-256 (1985).
- Rybicka, K. K.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
