שיטה לא מתויגת, לא רדיו-איזוטופית כדי לבדוק פעילות גליקוסילאז uracil-DNA פותחה באמצעות ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF לניתוח מוצר ישיר apurinic / apyrimidinic המכיל אתרים. הבדיקה הוכיחה להיות די פשוט, ספציפי, מהיר, וקל לשימוש עבור מדידת גליקוזילאאז DNA.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Uracil-DNA Glycosylase בדיקה על ידי טיהור לייזר בסיוע מטריקס / יינון זמן טיסה ניתוח ספקטרומטריה מסה
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
Uracil-DNA גליקוסילאז (UDG) הוא מרכיב מפתח במסלול תיקון כריתת הבסיס לתיקון של אורסיל שנוצר מ deamination הידרוליטי של ציטוזין. לכן, זה חיוני לתחזוקת שלמות הגנום. פותחה שיטה ספציפית מאוד, שאינה מתויגת, שאינה רדיו-איזוטופית, למדידת פעילות UDG. דופלקס דנ"א סינתטי המכיל אורסיל ספציפי לאתר נבקע על ידי UDG ולאחר מכן היה נתון לפירוק לייזר בסיוע מטריקס / יינון זמן טיסה ספקטרומטריה מסה (MALDI-TOF MS) ניתוח. הוקם פרוטוקול לשימור המוצר של האתר האפוריני/אפירימידיני (AP) בדנ"א ללא שבירת גדילים. השינוי בערך m/z מהמצע למוצר שימש להערכת הידרוליזת אורסיל על ידי UDG. מצע G:U שימש לניתוח קינטי של UDG שהניב את ה- Km = 50 nM, Vmax = 0.98 nM/ s, ו- Kcat = 9.31 s-1. יישום של שיטה זו למעכב גליקוסילאז uracil (UGI) בדיקה הניבה ערך IC50 של 7.6 pM. הספציפיות של UDG באמצעות uracil בעמדות שונות בתוך מצעים DNA חד גדילי כפול תקוע כפול הדגים יעילות מחשוף שונה. לפיכך, שיטת MALDI-TOF MS פשוטה, מהירה ורב-תכליתית זו יכולה להיות שיטת התייחסות מצוינת לגליקוסילות DNA מונו-תעשייתיות שונות. יש לו גם את הפוטנציאל ככלי עבור DNA גליקוסילאז מעכב הקרנה.
מבוא
למרות uracil הוא בסיס נורמלי ב RNA, זה נגע נפוץ מאוד mutagenic מאוד בדנ"א גנומי. אורסיל יכול לנבוע מזיהום הידרוליטי ספונטני/אנזימטי של דיאוקסיציטדין. בכל תא חי, זיהום זה מתרחש 100-500 פעמים ביום בתנאים פיזיולוגיים1,2. אם שינויים אלה אינם מתוקנים, יכול להיות שינוי בהרכב רצף ה- DNA, גרימת מוטציה. כמו uracil ב- DNA מעדיף לזווג עם dATP במהלך השכפול, אם ציטוסין deaminates כדי uracil, בשני אירועי שכפול, תהיה מוטציה חדשה G:C כדי A:T מעבר במחצית DNA הצאצאים3.
בין האסטרטגיות התאיות לשמירה על יציבות גנטית, תיקון כריתת בסיס (BER) הוא מנגנון חיוני המתקנת בסיסים פגומים, כ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת מצע/תבנית
- עיצוב מצע /תבנית דופלקס עם תוכן G+C מאוזן של ~ 50 ± 10% וטמפרטורת ההיתוך המינימלית של 50 °C (50 °F) עבור אזור הדופלקס.
הערה: הבדל נוקלאוטיד אחד בין מצעים של 18 nt לבין תבניות 19 nt (טבלה 1 ואיור 1) מסייע לפרשנות טובה יותר של אותות טרשת נפוצה וחישול מתאים. גדיל התבנית משמש כ- DNA משלים ליצירת אי-התאמות A-U או G-U (טבלה 1) אך יכול לשמש גם כאות ייחוס במדידות MS. השימוש באוליגונוקלאוטידים סינתטיים מטוהרים HPLC משביע רצון למחקר זה. - להמיס DNA ב 1 mM EDTA ו 10 mM Tris-HCl (pH 8.0 ב 25 °C (TE) בריכוז של 100 מיקרומול / L כמו מלאי ולאחסן ב -20 °C (60 °F). ד....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
תבניות ומצעים
אם ניקח אוליגונוקלאוטידים סינתטיים עם U במרכז (U+9) בשילוב עם תבנית G כדוגמה (איור 1A), בקרה ריקה של כמויות שיווימולריות של תבנית ומצע המכיל אורסיל יכולה לשמש לבקרת איכות של טוהר אוליגונוקלאוטיד סינתטי (איור 1B; האותות תואמים ל- m/z המיועד ולרעשי הרקע הנמוכים). בניתוח נתוני טרשת נפוצה נמדדו שיאי השיא (איור 2). ה- DNA של תבנית 19 nt היה צפוי להישאר ללא שינוי לאחר הידרוליזה גליקוסילאז; לכן, האות יכול .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מאמר זה מספק הליך מפורט לשימוש בשיטת בדיקת MS UDG MALDI-TOF MS לזיהוי ישיר של מוצרי DNA המכילים AP. היתרונות העיקריים של שיטה זו הם כי מצעים המכילים uracil הם ללא תוויות, מדרגי, קל לעבוד עם, ולאפשר גמישות רבה יותר בעיצוב מצע.
מיצוי פנול/כלורופורם המומלץ על ידי ספק UDG מאפשר השבתה של האנזים כדי למנוע השפלה של DNA המוצר. עם זאת, פרוטוקול החילוץ פנול כרוך בהפרדת פאזה מייגעת של כימיקלים מסוכנים. שיטת סיום חומצה חלופית באמצעות HCl כדי להוריד את pH התגובה ל 2 ± 0.5 גם ביעילות מושבתת UDG. נטרול מאוחר.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
תודות
אנו מודים למתקן הליבה המשולב NCFPB לגנומיקה פונקציונלית (טאיפיי, טייוואן) ולמעבדת הפרמקוגנומיקה של NRPB (טאיפיי, טייוואן) על התמיכה הטכנית שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי משרד המדע והטכנולוגיה, טייוואן, R.O.C. [מספר מענק MOST109-2314-B-002-186 ל- K.-Y.S., רוב 107-2320-B-002-016-MY3 ל- S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 ל- W.h.F.]. H.-L.C. הוא מקבל מלגת דוקטורט מאוניברסיטת טייוואן הלאומית. מימון תשלום בגין גישה פתוחה: משרד המדע והטכנולוגיה, R.O..C.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 2-אמינו-2-הידרוקסימתיל-פרופאן-1,3-דיול (בסיס טריס) | J.T בייקר | 1,2 | |
| MILLIPORE | מים נטולי יונים אוטוקלאב | 1,2 | |
| פרוטוקול EDTA | J.T Baker | 1,2 | |
| כפפות | AQUAGLOVE | 1,2,3 | |
| פרוטוקול SIGMA של חומצה הידרוכלורית (HCl) | 1,2 | ||
| דלי קרח | Taiwan.Inc | פרוטוקול 2 | |
| קצות פיפטה שמירה נמוכה (0.5-10 ומיקרו; L) | פרוטוקול גן | 1,2 | |
| קצות פיפטה שמירה נמוכה (1,250 ומיקרו; L) | חברת אספקה מדעית לאומית, בע"מ. | פרוטוקול 1,2 | |
| קצות פיפטה עם שמירה נמוכה (200 ומיקרו; L) | חברת אספקה מדעית לאומית, בע"מ. | פרוטוקול 1,2 | |
| MassARRAY | Agena Bioscience, CA | Protocol 4, 5 תוכניות בקרת ספקטרומטריית מסה כוללות Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE ו-Start RT Process. | |
| MassARRAY ננו-דיספנסר | AAT Bioquest, Inc. | RS1000 | פרוטוקול 3 |
| מיקרוצנטריפוגה | קובוטה | פרוטוקול 2 | |
| מיקרוצנטריפוגה | Clubio | פרוטוקול 2 | |
| צינור מיקרוצנטריפוגה (1.5 מ"ל) | אספקה מדעית לאומית בע"מ | פרוטוקול 2 | |
| מתלה צינור מיקרוצנטריפוגה | Taiwan.Inc | פרוטוקול 1,2 | |
| מיקרופיפטה (עמ' 1000) | פרוטוקול גילסון | 1,2 | |
| מיקרופיפטה (עמ2) | גילסון | 1,2 | |
| מיקרופיפטה (P10) | גילסון | 1,2 | |
| מיקרופיפטה (P100) | פרוטוקול גילסון | 1,2 | |
| מיקרופיפטה (P200) | גילסון | 1,2 | |
| מיקרופיפטה (SL2) | ריינין | 1,2 | |
| אוליגונוקלאוטידים | טכנולוגיות DNA משולבות (סינגפור) | פרוטוקול 1,2 | |
| מחשבון Quest Graph IC50 (v.1) | AAT Bioquest, Inc. | איור 4 https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1 | |
| נתרן הידרוקסיד (NaOH) | WAKO | פרוטוקול 2 | |
| מערך SpectroCHIP | Agena Bioscience, CA | #01509 | פרוטוקול 3, 5 |
| טיימר | Taiwan.Inc | פרוטוקול 2 | |
| תוכנת Typer 4.0 | nbsp; Agena Bioscience, CA | #10145 | Protocol 6 Typer 4.0 מורכב מארבע תוכניות כולל Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor ו-Typer Analyzer. |
| מאגר תגובת UDG (10x) | מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד, פרוטוקול MA | B0280S | פרוטוקול 2 |
| מעכב אורסיל גליקוזילאז | ניו אינגלנד ביולאבס, MA | M0281S | פרוטוקול 2 |
| אורציל-DNA גליקוזילאז | ניו אינגלנד ביו-לאבס, MA | M0280L | פרוטוקול 2 |
| ספקטרופוטומטר UV-VISBLE UV-1601 | SHIMADZU | פרוטוקול 1 | |
| אמבט מים | ZETA ZC-4000 ( Taiwan.Inc) | פרוטוקול 2 |
מקורות
- Frederico, L. A., Kunkel, T. A., Shaw, B. R. A sensitive genetic assay for the detection of cytosine deamination: determination of rate constants and the activation energy. Biochemistry. 29 (10), 2532-2537 (1990).
- Kavli, B., Otterlei, M., Slupphaug, G., Krokan, H. E.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
