איסוף, הרחבה והתמיינות של מודלים ראשוניים של תאי אפיתל באף אנושי לכימות תדירות פעימות הריסונים

Katelin M. Allan; Sharon L. Wong; Laura K. Fawcett; Alexander Capraro; Adam Jaffe; Cristan Herbert; Elvis Pandzic; Shafagh A. Waters

doi:10.3791/63090

הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

איסוף, הרחבה והתמיינות של מודלים ראשוניים של תאי אפיתל באף אנושי לכימות תדירות פעימות הריסונים

5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63090

⸱

10 בנובמבר 2021

Katelin M. Allan¹^,² , Sharon L. Wong¹^,² , Laura K. Fawcett¹^,²^,³ , Alexander Capraro¹^,² , Adam Jaffe¹^,²^,³ , Cristan Herbert⁴ , Elvis Pandzic⁵ , Shafagh A. Waters¹^,²^,³

¹School of Women's and Children's Health, Faculty of Medicine and Health, University of New South Wales, ²Molecular and Integrative Cystic Fibrosis Research Centre (miCF RC), Faculty of Medicine and Health, University of New South Wales, ³Department of Respiratory Medicine, Sydney Children's Hospital, ⁴Department of Pathology, School of Medical Sciences, University of New South Wales Australia, ⁵Katharina Gaus Light Microscopy Facility, Mark Wainwright Analytical Centre, University of New South Wales

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר איסוף, הרחבה והתמיינות של תאי אפיתל באף למודלים של תאי אפיתל אורגנוטיפיים של דרכי הנשימה וכימות של תדירות פעימות הריסונים באמצעות הדמיה של תאים חיים וסקריפטים שנבנו בהתאמה אישית.

תקציר

מדידות של תפקוד הריסונים (תדירות פעימה, דפוס) נקבעו ככלי אבחון למחלות בדרכי הנשימה כגון דיסקינזיה ציליארית ראשונית. עם זאת, היישום הרחב יותר של טכניקות אלה מוגבל על ידי הרגישות הקיצונית של תפקוד ציליארי לשינויים בגורמים סביבתיים כגון טמפרטורה, לחות ו- pH. בדרכי הנשימה של חולים עם סיסטיק פיברוזיס (CF), הצטברות ריר מעכבת את הכאת הריסונים. פונקציית הריסונים נחקרה במודלים ראשוניים של תאי דרכי הנשימה כאינדיקטור לפעילות ערוץ מווסת מוליכות טרנסממברנה CF (CFTR). עם זאת, נמצאה שונות ניכרת בין מטופל לחולה בתדירות הכאת הריסונים בתגובה לתרופות המווסתות CFTR, אפילו עבור חולים עם אותן מוטציות של CFTR . יתר על כן, ההשפעה של הפרשת כלוריד מווסתת CFTR לא מתפקדת על תפקוד הריסיון אינה מובנת כהלכה. אין כיום פרוטוקול מקיף המדגים הכנת דגימות של מודלים של נתיבי אוויר במבחנה , רכישת תמונות וניתוח של Cilia Beat Frequency (CBF). תנאי תרבית סטנדרטיים ורכישת תמונות המבוצעים במצב מבוקר סביבתית יאפשרו כימות עקבי וניתן לשחזור של CBF בין אנשים ובתגובה לתרופות המווסתות CFTR. פרוטוקול זה מתאר את הכימות של CBF בשלוש מערכות מודל שונות של תאי אפיתל בדרכי הנשימה: 1) יריעות אפיתל מקוריות, 2) מודלים של ממשק אוויר-נוזל המצולמים על תוספות תמיכה חדירות, ו-3) אורגנואידים תלת-ממדיים מוטמעים במטריצה חוץ-תאית. שני האחרונים משכפלים את הפיזיולוגיה של הריאות in vivo , עם ריסונים מכים וייצור של ריר. הפונקציה הציליארית נלכדת באמצעות מצלמת וידאו במהירות גבוהה בתא הנשלט על ידי הסביבה. סקריפטים שנבנו בהתאמה אישית משמשים לניתוח CBF. תרגום מדידות CBF למרפאה צפוי להיות כלי קליני חשוב לניבוי תגובה לתרופות מווסתות CFTR על בסיס פר מטופל.

מבוא

מדידות של תדירות פעימת ריסונים (CBF) ודפוס נקבעו ככלי אבחון למחלות בדרכי הנשימה כגון דיסקינזיה ריסיאלית ראשונית (PCD)¹. בסיסטיק פיברוזיס (CF), תפקוד לקוי של תעלת הכלוריד של מווסת מוליכות טרנסממברנה CF (CFTR) גורם להתייבשות של נוזל פני השטח של דרכי הנשימה ולפגיעה בפינוי ליחה². פונקציה ציליארית נחקרה במבחנה במודלים ראשוניים של תאי דרכי הנשימה כאינדיקטור לפעילות ערוץ CFTR³. עם זאת, קיימת שונות ניכרת בין חולה לחולה ב-CBF בתגובה לתרופות המווסתות CFTR, אפילו עבור חולים עם אותן מוטציות CFTR ³. יתר על כן, ההשפעה של הפרשת כלוריד מווסתת CFTR לא מתפקדת על תפקוד הריסי....