Method Article

רובה ציד Proteomics עיבוד מדגם אוטומטי על ידי רובוט מעבדה קוד פתוח

DOI:

10.3791/63092

⸱

October 28th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine-Cardiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Department of Biochemistry & Molecular Genetics, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Consortium for Fibrosis Research & Translation, School of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול מפורט ושלושה סקריפטים של פייתון מסופקים להפעלת מערכת טיפול בנוזל רובוטי בקוד פתוח לביצוע הכנת דגימת חלבון אוטומטית למחצה לניסויי ספקטרומטריית מסה, המכסים הסרת חומרי ניקוי, עיכול חלבונים ושלבי התפלת פפטידים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניסויי פרוטאומיקה של רובה ציד מבוססי ספקטרומטריה המונית דורשים מספר שלבי הכנה מדגם, כולל עיכול חלבון אנזימטי וניקוי, אשר יכול לקחת שעות אדם משמעותיות של עבודת ספסל ולהציג מקור של שונות אצווה לאצווה. אוטומציה של מעבדה עם רובוטים מקטרים יכולה להפחית את העבודה הידנית, למקסם את התפוקה ולהגדיל את יכולת הרבייה המחקרית. עם זאת, המחירים ההתחלתיים התלולים של תחנות אוטומציה סטנדרטיות הופכים אותם לבלתי ניתנים להפרדה עבור מעבדות אקדמיות רבות. מאמר זה מתאר זרימת עבודה של הכנת מדגם פרוטאומיקה באמצעות מערכת אוטומציה של קוד פתוח במחיר סביר (The Opentrons OT-2), כולל הוראות להגדרת הפחתת חלבון אוטומטית למחצה, אלקילציה, עיכול וניקוי; כמו גם נלווה סקריפטים Python קוד פתוח לתכנת את מערכת OT-2 באמצעות ממשק תכנות היישומים שלה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטאומיקה של רובה ציד מבוסס ספקטרומטריית מסה היא כלי רב עוצמה למדידת השפע של חלבונים רבים בדגימות ביולוגיות בו זמנית. ניסויי פרוטאומיקה בניתוח ביואינפורמטיקה משמשים באופן שגרתי לזיהוי סמנים ביולוגיים ולגלות מתחמים ביולוגיים ומסלולים הקשורים העומדים בבסיס מנגנונים פתולוגיים. עם הספציפיות האנליטית הגבוהה שלה ודיוק כמותי פוטנציאלי, פרוטאומיקה רובה ציד יש גם פוטנציאל מצוין להיות מאומץ על ידי מתקני מחקר ומעבדות אבחון לניתוח מדגם קליני ללא צורך להסתמך על נוגדנים1,2.

כדי להכין דגימות חלבון לניתוח פרוטאומיקה של רובה ציד, חלבונים המופקים מדגימות ביולוגיות (למשל, תאים ורקמות) בדרך כלל צריכים....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תסריטי פייתון המפותחים הופקדו ב- GitHub בכתובת: https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons. עותק של קבצי ה- Script ניתן בקובץ משלים 1. נא עיין במאגר GitHub עבור הגירסאות העדכניות ביותר.

1. הכנות ניסיוניות

  1. בדוק את החומרה הדרושה לפני הפעלת הפרוטוקול.
    הערה: רכיבי החומרה הבאים נדרשים: פיפטות OT-2, טיפים פיפטה, ערכת ארון תקשורת צינור 4 ב-1, ערכת בלוק אלומיניום, מודול מגנטי, מודול טמפרטורה, לוחות באר עמוקים 96-well 2 מ"ל (ראה טבלת חומרים).

2. הכנת דגימת ספקטרומטריית מסה (MS) עם אלבומין סרום בקר חלבון יחיד (BSA)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלושה סקריפטים Python מסופקים כאן התואמים לרובוט OT-2, ומבצעים הכנה מדגמית עבור פרוטאומיקה ספקטרומטרית מסה עם אלבומין סרום בקר סטנדרטי חלבון יחיד (טכני משכפל n = 5 עיכולים) ודגימת ליסט לב אנושי המכילה חומר ניקוי (n = 5 עיכולים). כל מוצר תקציר מחולק לשתי תגובות ניקוי פפטיד. מספר ההתאמות המזוהות בספקטרום הפפטיד (PSMs), הפפטידים והחלבונים בכל ריצה של דגימות ה-BSA והלב מוצג באיור 4 ובאיור 5. חציון של 728 PSMs ו 65 פפטידים זוהו עם מדגם BSA, עם 5.2% ו 3.2% מקדמי וריאצ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלבים קריטיים בפרוטוקול
לקבלת הביצועים הטובים ביותר, יש להשתמש בתוכנות מעבדה מאומתות של Opentrons, מודולים וחומרים מתכלים התואמים ל- OT-2. תוכנות מעבדה מותאמות אישית ניתן ליצור בעקבות ההוראה של Opentrons ב Reference14. הקפד לכייל את סיפון OT-2, פיפטות, ו labware בעת שימוש בפעם הראשונה. זה גם קריטי לעקוב אחר הנחיות מיצרן חרוזי SP3 כדי להכין חרוזים לניקוי פפטיד וחלבון. ראוי לציין, במהלך תגובת מחייב חרוז ופפטיד, נפח האצטוניטריל בתגובה המחייבת צריך להיות ≥95%, וריכוז החרוזים צריך ל.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין קונפליקטים להצהיר.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי פרסי NIH F32-HL14919191 ל- YH; R00-HL144829 לאל על; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 ל- MPL. איור 1, איור 2, איור 3 נוצרים בעזרת כלי איור מדעי מבוסס אינטרנט, BioRender.com.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
300 ומיקרו; קצות פיפטה LOpentrons
סט מתלה צינורות 4 ב-1Opentronsכל סט כולל 2 מעמדי בסיס ו-4 צמרות מחזיק צינורות 1.5 מ"ל, 2 מ"ל, 15 מ"ל + 50 מ"ל, 15 מ"ל ו-50 מ"ל. אנו משתמשים ב-2 מ"ל ו-15 מ"ל + 50 מ"ל במחקר זה.
שבחים PepMap 100 C18 HPLC עמודתרמו מדעי#1645683 μ חלקיק m; 100 וארינג; נקבוביות; 75 μ m x 150 מ"מ
אצטוניטריל LC-MS כיתהVWR
סט בלוקים מאלומיניוםOpentronsסט בלוקים זה כולל 3 צמרות התואמות לצינורות 96 בארות, 2.0 מ"ל ורצועת PCR לשימוש עם מודול הטמפרטורה OT-2. אנו משתמשים במחזיק הצינור של 2.0 מ"ל בכתב היד הזה.
אמוניום ביקרבונטסיגמא-אולדריץ'# A6141
סרום בקר אלבומין סטנדרטי, 2 מ"ג / מ"לתרמו מדעי# 23210
דימתילסולפוקסיד (DMSO) LC-MS כיתהתרמו מדעי# 85190
דיתיותרייטולסיגמא-אולדריץ'#D5545
עמודות HPLC EASY-Sprayתרמו מדעי#ES800A
EasynLC 1200 Nano LCThermo Scientific#LC140
הוכחת אתנול 195-200Fisher#04-355-720
חומצה פורמית LC-MS כיתהThermo Scientific#85178
ליזאט לב אנושיNovus BiologicalsNB820-59217
יודואצטמידסיגמא-אולדריץ'#I1149
מתלהצינור מגנטיThermo Scientific#MR02
MAXQuant v.1.6.10.43Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/)
mySPIN 6 מיני צנטריפוגהThermo Scientific#75004061מיני צנטריפוגה ספסל לסיבוב מהיר
NEST 2 מ"ל 96 בארות צלחת באר עמוקה, V תחתוןOpentrons
OT-2 מודול מגנטיOpentronsGEN1
OT-2 P300 פיפטה חד ערוץOpentronsGEN1
OT-2 P50 פיפטה חד ערוציתOpentronsGEN1
OT-2 רובוט פיפטינגרובוט OpentronsOT-2
OT-2 מודול טמפרטורהOpentronsGEN1
פירס כמותי בדיקת פפטיד קולורימטריתרמו מדעי#23275
צינורות חלבון LoBind 2.0 מ"לEppendorf#022431102
מסד נתונים של רצף חלבוניםUniProt/SwissProthttps://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640%
20ביקורת:כן
Sera-Mag SpeedBead חלקיקים מגנטיים שעברו שינוי קרבוקסילאט, HydrophobicCytiva#65152105050250
Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified חלקיקים מגנטיים, HydrophylicCytiva#45152105050250
SpeedVacThermo Scientificמאייד ואקום
Thermo Q אקסאקטיבי HF ספקטרומטר מסהתרמו מדעי#IQLAAEGAAPFALGMBFZ
טריפסין MS כיתהתרמו מדעי# 90057
מים LC-MS כיתהVWR#BDH83645.400
#JT9829

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Geyer, P. E., et al. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942(2017).
  2. Coscia, F., et al. A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue anal....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Shotgun ProteomicsSample PreparationLab AutomationOpen Source RobotProtein DigestionMass SpectrometryLiquid Handling SystemPython Automation ScriptsProtein ReductionPeptide Cleanup

Related Articles