הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

רובה ציד Proteomics עיבוד מדגם אוטומטי על ידי רובוט מעבדה קוד פתוח

3.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63092

⸱

28 באוקטובר 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine-Cardiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Department of Biochemistry & Molecular Genetics, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Consortium for Fibrosis Research & Translation, School of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול מפורט ושלושה סקריפטים של פייתון מסופקים להפעלת מערכת טיפול בנוזל רובוטי בקוד פתוח לביצוע הכנת דגימת חלבון אוטומטית למחצה לניסויי ספקטרומטריית מסה, המכסים הסרת חומרי ניקוי, עיכול חלבונים ושלבי התפלת פפטידים.

תקציר

ניסויי פרוטאומיקה של רובה ציד מבוססי ספקטרומטריה המונית דורשים מספר שלבי הכנה מדגם, כולל עיכול חלבון אנזימטי וניקוי, אשר יכול לקחת שעות אדם משמעותיות של עבודת ספסל ולהציג מקור של שונות אצווה לאצווה. אוטומציה של מעבדה עם רובוטים מקטרים יכולה להפחית את העבודה הידנית, למקסם את התפוקה ולהגדיל את יכולת הרבייה המחקרית. עם זאת, המחירים ההתחלתיים התלולים של תחנות אוטומציה סטנדרטיות הופכים אותם לבלתי ניתנים להפרדה עבור מעבדות אקדמיות רבות. מאמר זה מתאר זרימת עבודה של הכנת מדגם פרוטאומיקה באמצעות מערכת אוטומציה של קוד פתוח במחיר סביר (The Opentrons OT-2), כולל הוראות להגדרת הפחתת חלבון אוטומטית למחצה, אלקילציה, עיכול וניקוי; כמו גם נלווה סקריפטים Python קוד פתוח לתכנת את מערכת OT-2 באמצעות ממשק תכנות היישומים שלה.

מבוא

פרוטאומיקה של רובה ציד מבוסס ספקטרומטריית מסה היא כלי רב עוצמה למדידת השפע של חלבונים רבים בדגימות ביולוגיות בו זמנית. ניסויי פרוטאומיקה בניתוח ביואינפורמטיקה משמשים באופן שגרתי לזיהוי סמנים ביולוגיים ולגלות מתחמים ביולוגיים ומסלולים הקשורים העומדים בבסיס מנגנונים פתולוגיים. עם הספציפיות האנליטית הגבוהה שלה ודיוק כמותי פוטנציאלי, פרוטאומיקה רובה ציד יש גם פוטנציאל מצוין להיות מאומץ על ידי מתקני מחקר ומעבדות אבחון לניתוח מדגם קליני ללא צורך להסתמך על נוגדנים1,2.

כדי להכין דגימות חלבון לניתוח פרוטאומיקה של רובה ציד, חלבונים המופקים מדגימות ביולוגיות (למשל, תאים ורקמות) בדרך כלל צריכים להיות מעובדים תחילה באמצעות פרוטוקולים ארוכים, כולל מדידת ריכוז החלבון לדוגמה, הפחתת חלבון ואלקלציה, ועיכול אנזימטי לפפטידים. יתר על כן, חלבונים המופקים במאגרי תמוגה נפוצים המכילים חומרי ניקוי דורשים לעתים קרובות שלבים נוספים של חילופי חוצץ או הסרת חומרי ניקוי לפני הניתוח מכיוון שדטרגנט יכול להפריע לעיכול טריפסין ולפגוע באופן משמעותי בביצועים של ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפיה נוזלית במורד הזרם (ניתוח LC-MS /MS)3. פפטידים הם בדרך כלל מותפלים עוד יותר, מיובשים, ומחודשים בממסים תואמי LC-MS / MS בעקבות עיכול אנזימטי. הליכי ביוכימיה חלבונים אלה יכולים להיות עתירי עבודה וגוזלים זמן רב. לכן, הם ממשיכים להגביל את התפוקה של זרימות עבודה של פרוטאומיקה ולתרום לשונות של נתונים שנרכשו4,5. טעויות אנוש והטיות הוכרו כגורמים מכריעים המשפיעים על שונות הנתונים ועל רבייה6,7. כדי למזער טעויות אנוש בתהליכי עבודה של הכנת דגימת ספקטרומטריית מסה, נעשה שימוש במערכות רובוטיות אוטומטיות של צינורות כדי לשפר את התפוקה והשחזור של זיהוי חלבונים וכימות מפרוטאומיקה של רובה ציד וניתוח ספקטרומטריית מסה ממוקדת, שם התפתחויות כאלה הוכרזו כמסייעות להמשך הדחיפה לאימוץ נרחב של טכנולוגיות פרוטאומיקה במחקר קריטי ובהגדרות קליניות8, 9,10,11,12,13. עם זאת, רוב הפרוטוקולים הקיימים משתמשים בפלטפורמות רובוטיות לטיפול בנוזלים הדורשים השקעה והכשרה משמעותיות, ומגבילים את התועלת שלהם במעבדות רבות בסביבה האקדמית או בכל דרך אחרת עם תקציב מוגבל.

מאמר זה מתאר פרוטוקול המשתמש במערכת טיפול בנוזל רובוטי רובוטי בקוד פתוח בעלות נמוכה, OT-2, כדי להפוך חצי אוטומטית זרימת עבודה טיפוסית להכנת מדגם רובה ציד פרוטאומיקה. ל-OT-2 יש עלות נמוכה יותר ממערכות רבות אחרות לטיפול בנוזלים רובוטיים, ובזמן הכתיבה, הוא עולה כ-5,000 דולר אמריקאי. כאשר לוקחים בחשבון את המחירים של מודולים שונים ותוכנות מעבדה, העלות הכוללת להגדרת ניסויים בפרוטוקול זה בזמן הכתיבה היא סביב $10,000, מה שהופך אותו זול יותר לקבוצה רחבה בהרבה של מעבדות על פני אפשרויות יקרות יותר. ה- OT-2 תואם לתכנות קוד פתוח באמצעות סקריפטים של Python ומציע גמישות רבה בעיצוב פרוטוקול עשה זאת בעצמך המוגדר על-ידי המשתמש. באמצעות שלושה סקריפטים שפותחו בתוך הבית, הפרוטוקולים להלן מכסים ביצוע זרימת עבודה טיפוסית של הכנת דגימת פרוטאומיקה של רובה ציד בתחנת OT-2 עם תקן חלבון ארכיטיפי (אלבומין סרום בקר; BSA) ודגימת חלבון מורכבת של ליסט לב אנושי רגיל (איור 1). ההליכים לעיבוד (1) דגימת BSA ו-(2) דגימת ליסט לב מורכבת מפורטים בפרוטוקול סעיפים 1, 2, 5, 6 ו-3, 4, 5, 6, 6, בהתאמה. חרוזים מגנטיים שעברו שינוי קרבוקסילציה Sera-Mag מנוצלים בהכנת מדגם משופרת של שלב מוצק בסיר אחד (SP3) להסרת חומרי ניקוי ומלחים בדגימות החלבון והפפטיד. תקצירים טריפטיים מאלבומין בסרום בקר וחלבוני לב אנושיים מנוקים עוד יותר על ידי חרוזי SP3 ומוגשים לניתוח LC-MS/MS. ספקטרום המסה מנותח לאחר מכן באמצעות תוכנת MaxQuant לזיהוי פפטיד וחלבון. תוצאות מייצגות המבוצעות על ידינו מראות כי הפרוטוקול משיג מקדמים טכניים מצוינים של וריאציה (CV) תוך חיסכון בזמן הספסל ואינו נחות לעיכול ידני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

תסריטי פייתון המפותחים הופקדו ב- GitHub בכתובת: https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons. עותק של קבצי ה- Script ניתן בקובץ משלים 1. נא עיין במאגר GitHub עבור הגירסאות העדכניות ביותר.

1. הכנות ניסיוניות

  1. בדוק את החומרה הדרושה לפני הפעלת הפרוטוקול.
    הערה: רכיבי החומרה הבאים נדרשים: פיפטות OT-2, טיפים פיפטה, ערכת ארון תקשורת צינור 4 ב-1, ערכת בלוק אלומיניום, מודול מגנטי, מודול טמפרטורה, לוחות באר עמוקים 96-well 2 מ"ל (ראה טבלת חומרים).

2. הכנת דגימת ספקטרומטריית מסה (MS) עם אלבומין סרום בקר חלבון יחיד (BSA)

  1. פתח את קובץ ה- Script NoSP3_digestion.py בעורך טקסט וציין את המשתנים הספציפיים לניסוי לפי הצורך בסעיף התאמה אישית כאן בלבד.
    הערה: המשתנים הספציפיים לניסוי כוללים את מספר הדגימות ומשוכפלים; ריכוז המדגם; הנפח של ריאגנטים dithiothreitol - DTT, iodoacetamide - IAA, ו טריפסין; זמן הדגירה של DTT ו- IAA, והקצה ההתחלתי לפיפטה P20/P50 ו- P300).
    1. פתח את אפליקציית Opentrons והעלה את קובץ ה- Script לכרטיסיה פרוטוקול באפליקציית Opentrons.
      הערה: ניתן להוריד את אפליקציית Opentrons מ-Reference14 למחשב מקומי. בזמן הכתיבה, פיפטה אלקטרונית Opentrons P50 אינה זמינה לרכישה בחנות Opentrons. הוא הוחלף בפיפטה האלקטרונית P20 בערוץ יחיד התואמת לאמצעי האחסון שצוינו בפרוטוקול. הערות והוראות נעשו בתסריט כדי להחליף את פיפטת P50 עם פיפטה P20. ייתכן שהמשתמשים יצטרכו לבדוק ולאמת את תאימות ה- pipette הספציפית לפרוטוקול זה בהתאם להוראת ה- API של Opentrons.
  2. פתח את הכרטיסייה ROBOT ובצע כיול כיול סיפון רובוט בלשונית ROBOT בהתאם להוראות שלב אחר שלב על המסך באפליקציית Opentrons.
    הערה: שלב זה נדרש רק אם הוא לא יושם בעבר או שהרובוט עבר לאחרונה הקצאה.
  3. לחץ על כפתור ניהול PIPETTES כדי לבצע כיול אורך קצה, ואחריו כיול היסט פיפטה לכיול ברירת המחדל של הקצה ומיקום שילוב פיפטה.
    הערה: שלב זה נדרש אם נעשה שימוש ב- pipette בפעם הראשונה.
  4. מקם את תוכנות המעבדה והפיפטות הנדרשות במיקום המתאים בחפיסת OT-2 שצוינה בתסריט של פייתון (איור 2).
    הערה: ודא שמודול הטמפרטורה מחובר ומופעל, ובלוק האלומיניום ממוקם על גבי מודול הטמפרטורה.
  5. פתח את הכרטיסיה CALIBRATE ובצע כיול עבור השילוב של תוכנות מעבדה ופיפטות הנדרשות בקובץ Script זה של פיתון.
    הערה: אפליקציית Opentrons תתעד את פרמטרי הכיול, שאינם נחוצים ליישומים עתידיים עם אותן תוכנות מעבדה ופיפטות.
  6. הכן 5 מ"ל של 100 מ"מ אמוניום ביקרבונט (ABC) (pH ~ 8.0) פתרון על ידי המסת 39.53 מ"ג של ABC במים בדרגת ספקטרומטריה מסה לנפח כולל של 5 מ"ל בצינור חרוטי 15 מ"ל. מניחים חיץ אמוניום ביקרבונט בבאר A1 של מתלה צינור 4 ב -1 עם 15 מ"ל + 50 מ"ל מחזיק צינור העליון.
  7. הכינו 1 מ"ל של חלבון אלבומין בסרום בקר (BSA) בצינור חלבון בעל 2.0 מ"ל עם קשירה נמוכה (ראו טבלת חומרים). מניחים את הדגימה בבאר A1 של מתלה הצינור 4 ב-1 עם מחזיק צינור 2 מ"ל עליון.
  8. באופן ידני למקם 2.0 מ"ל חלבון נמוך לאגד צינורות בבארות של A1, B1, C1, D1, E1, F1, A2, וכו 'בבלוק האלומיניום על גבי מודול הטמפרטורה.
    הערה: הפיפטה הרובוטית תחלק דוגמאות בסדר האנכי החל מ- A1 (המדגם הראשון) ועד לדגימה האחרונה כברירת מחדל. ניתן לציין חלוקה אופקית. עיין ב- 15 לקבלת פרטים. המספר הכולל של צינורות שיש להכין צריך להיות שווה למספר הכולל של דגימות (כלומר, מספר הדגימות הביולוגיות כפול מספר השכפולים הטכניים לכל מדגם).
  9. הכן 1 מ"ל של 60 mM DTT על ידי המסת 9.26 מ"ג של מוצקי DTT במים בדרגת ספקטרומטריית מסה לנפח כולל של 1 מ"ל. מקם את ה- DTT בבאר A6 של מתלה הצינורות 4 ב-1 עם למעלה של מחזיק צינור 2 מ"ל.
    אזהרה: DTT מזיק לעיניים אנושיות, לעור ולמערכת הנשימה. ללבוש PPE ולטפל בו תחת מכסה המנוע הכימי. עיין בגליון נתוני הבטיחות של היצרן לקבלת נהלים מתאימים.
  10. שימו לב בזמן שהרובוט מעביר נפח מתאים של חיץ ABC לצינורות הדגימה בבלוק האלומיניום.
    הערה: הנפח הכולל של ABC ותערובת חלבונים בכל צינור הוא 100 μL, ואת הנפח של מאגר ABC מחושב בתסריט (V = 100 μL פחות נפח של 100 מיקרוגרם של דגימת חלבון).
  11. ודא כי הרובוט מעביר 100 מיקרוגרם של חלבון BSA לכל צינור עם חיץ ABC.
    הערה: ניסוי טיפוסי עשוי להשתמש עד 100 מיקרוגרם של חלבונים לעיכול חלבון, כלומר, 50 μL של 2.0 מיקרוגרם / μL עבור מדגם BSA זה.
  12. ודא באופן ידני שתוכנית הרובוט מושהית ומציגה את ההודעה: ודא ש- DTT נטען ל- A6 מתוך ארון הצינורות של 2 מ"ל הממוקם בחריץ 4 לפני חידוש הפרוטוקול. ודא שפופרת DTT ממוקמת בבאר A6 ופותחת את המכסה שלה. לחץ על לחצן חידוש הפעולה באפליקציית Opentrons כדי להמשיך. ודא כי הרובוט מעביר 10 μL של פתרון DTT לכל מדגם היטב, ואחריו חמישה סיבובי ערבוב.
  13. ודא שתוכנית הרובוט מושהית ומציגה את ההודעה: הקפד לסגור מכסים בצינורות לדוגמה. סגור ידנית את המכסות של הצינורות ולחץ על קורות חיים כדי להמשיך. המתן עד שמודול הטמפרטורה של הרובוט יתחיל לחמם את בלוק האלומיניום עד שהטמפרטורה תגיע ל -55 מעלות צלזיוס, ואחריו דגירה של 5 דקות כדי לאפשר לדגימות להגיע ל -55 מעלות צלזיוס.
    הערה: הרובוט יחזיק את הטמפרטורה בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לאפשר הפחתת חלבון על ידי DTT במהלך הדגירה.
  14. במהלך 30 דקות של דגירה DTT, להכין 1 מ"ל של 187.5 mM Iodoacetamide (IAA) על ידי המסת 34.68 מ"ג של IAA במאגר ABC לנפח כולל של 1 מ"ל. עטפו ידנית את פתרון רשות העתיקות בנייר אלומיניום כדי למנוע חשיפה לאור.
    אזהרה: רשות העתיקות עלולה לגרום לגירוי חמור בעין ובנשימה. להתמודד עם זה תחת מכסה המנוע הכימי לובש PPE תקין.
  15. ודא שמודול הטמפרטורה של הרובוט מתקרר עם השלמת שלב הדגירה של 30 דקות DTT.
    הערה: לאחר שטמפרטורת המודול מגיעה ל-22 מעלות צלזיוס, המודול שומר על הטמפרטורה למשך 5 דקות כדי לאפשר לדגימות להתקרר באופן מלא.
  16. בטל את הניקוי של צינורות הדגימה כאשר התוכנית של הרובוט מושהית והצג את הודעת האזהרה: הקפד לפתוח כובעים בצינורות מדגם. לחץ על חדש כדי להמשיך.
  17. ודא באופן ידני שהתוכנית של הרובוט מושהית עם הודעת אזהרה: ודא שרשות העתיקות נטענה ל- B6 של ארון צינור 2 מ"ל הממוקם בחריץ 4 לפני חידוש הפרוטוקול. אשר את מיקום המדף של צינור רשות העתיקות ופתח את מכסה הצינור. לחץ על חדש כדי להמשיך. ודא כי הרובוט מעביר 10 μL של IAA לכל צינור מדגם ואחריו חמישה סיבובי ערבוב.
  18. מכסים את צינורות הדגימה כאשר התוכנית של הרובוט מושהית ומציגים את ההודעה: סגור כובעים על צינורות מדגם וכסה צינורות מדגם בנייר כסף. לכסות את כל בלוק האלומיניום עם חתיכת נייר אלומיניום נקייה. לחץ על חדש כדי להמשיך. חכה עד הדגימות הם דגירה ב 22 °C (50 °F) במשך 30 דקות. ודא שמודול הטמפרטורה של הרובוט מתבטל עם השלמת הדגירה של רשות העתיקות.
  19. הכן תערובת של פתרון טריפסין במהלך דגירה IAA (שלב 2.19) בריכוז הסופי של 0.2 מיקרוגרם / μL: להמיס 20 מיקרוגרם של ספקטרומטריית מסה / טריפסין רצף כיתה ב 100 μL של מים בדרגת MS.
  20. מקם את פתרון הטריפסין בבאר C6 של מתלה צינור 2 מ"ל עם מכסה הצינור פתוח כאשר התוכנית של הרובוט מושהית ומציג את הודעת האזהרה: ודא טריפסין נטען לתוך C6 של ארון צינור 2 מ"ל הממוקם בחריץ 4 לפני חידוש הפרוטוקול. לחץ על חדש כדי להמשיך.
  21. ודאו שתוכנית הרובוט מושהית ומציגה את הודעת האזהרה: פתחו מכסים בצינורות מדגם במודול הטמפרטורה. נקה את צינורות הדגימה ולחץ על חדש כדי להמשיך. היכונו בזמן שהרובוט מעביר 10 μL של טריפסין לכל צינור מדגם ואחריו חמישה סיבובי ערבוב.
  22. עוטפים את כובעי צינור הדגימה בסרט פרפין, מעבירים את כל הדגימות למיקסר מבוקר טמפרטורה ודגורים ב-37 מעלות צלזיוס ל-16-20 שעות עם רעידות של 600 סל"ד.
    הערה: עיכול טריפסין עשוי להתבצע גם ישירות על מודול הטמפרטורה ב 37 °C (50 °F).

3. ניקוי פפטיד באמצעות חרוזים פרמגנטיים SP3

  1. למחרת לאחר עיכול טריפסין בן לילה, לסובב בקצרה את הדגימות באמצעות microcentrifuge ספסל (≤2,000 x g) (ראה טבלת חומרים) ולהניח את הדגימות על מתלה צינור מגנטי. תן את הדגימות לעמוד במשך 2 דקות.
    1. מעבירים את הסופר-נרטיב בזהירות עם פיפטה לקבוצה חדשה של צינורות מיקרו-צנטריפוגות עתירות חלבון. שמור את הדגימות במקרר ולהמשיך לשלבים 3.2-3.9.
      הערה: לאחסון לטווח ארוך, אחסן את הדגימות בטמפרטורה של -80 °C (80 °F).
  2. פתח את קובץ ה- Script של SP3_peptide_cleanup.py Python בעורך טקסט וציין לפי הצורך בסעיף התאמה אישית כאן בלבד.
    הערה: המשתנים הספציפיים לניסוי כוללים את מספר הדגימות והשכפולים, את נפח הפפטידים שיש להעביר, את נפח הריאגנטים (חרוזים, אצטוניטריל, DMSO), את הקצה ההתחלתי של פיפטות P20/P50 ו- P300, ולהתחיל היטב בלוח העמוק במודול המגנטי. כל מדגם תקציר BSA מכיל כ 120 μL של נפח העיכול, אשר יהיה aliquoted לשני משוכפלים טכניים עם 55 μL בכל שכפול. כדי לנקות חצי מהתקציר בלבד, שנה את משתנה המספר המשוכפל ל- 1.
  3. העלה את קובץ ה- Script לכרטיסיה פרוטוקול ביישום Opentrons .
  4. מקם את תוכנות המעבדה והפיפטות הנדרשות במיקום המתאים בחפיסת OT-2 שצוינה בתסריט של פייתון (איור 3). ודא שהמודול המגנטי מופעל ומחובר לרובוט. מניחים צלחת באר חדשה בעומק 96 מ"ל (ראו טבלת חומרים) על החלק העליון של המודול המגנטי.
  5. פתח את הכרטיסיה CALIBRATE ובצע כיול עבור השילוב של תוכנות מעבדה ופיפטות הנדרשות בקובץ Script זה של Python.
    הערה: כיול עבור אותם שילובי תוכנות מעבדה ופיפטה צריך להתבצע פעם אחת בלבד, ואפליקציית Opentrons תתעד את פרמטרי הכיול.
  6. מקם את הדגימות המעוכלות (supernatant שנאסף בשלב 3.1) למתלה צינור 2.0 מ"ל בסדר האנכי בבארות A1, B1....
  7. הכן 15 מ"ל של אצטוניטריל תואם LC-MS / MS בצינור חרוטי 50 מ"ל ומקם את הצינור בבאר A3 בארון הצינורות 4 ב-1 עם מחזיק צינור 15 מ"ל + 50 מ"ל.
  8. הכן 5 מ"ל של 2% DMSO על ידי הוספת 100 μL DMSO עם 4.9 מ"ל מסה ספקטרומטרית כיתה מים בצינור חרוטי 15 מ"ל. מניחים את הצינור בבאר A1 במתלה צינור 15mL + 50mL.
  9. לתייג צינור חרוטי ריק 50 מ"ל כמו פסולת ולהניח אותו בבאר B3 בארון צינור 15mL + 50mL.
  10. הכן את חרוזי SP3 בעקבות Reference16.
    1. הכן כמות מתאימה של חרוזים מעורבים בצינור מיקרוצנטריפוגה 2.0 מ"ל.
      הערה: כל תגובת ניקוי פפטיד דורשת 10 μL של חרוזים מעורבים. לדוגמה, להכין מינימום של 40 μL של חרוזים מעורבים עבור ארבע תגובות ניקוי.
    2. תן לתערובת החרוזים לשבת על העמדה המגנטית במשך 2 דקות. הסר את supernatant בזהירות עם פיפטה ולמדוד את הנפח של supernatant עם פיפטה.
    3. חשב את הנפח הנותר של חרוזים ולהוסיף 5-10 פעמים את המים כיתה ספקטרומטר המסה (למשל, 100-200 μL מים עבור 20 μL של חרוזים) ומערבולת (מהירות 10) עבור 10 s. שב את החרוזים על הדוכן המגנטי במשך 2 דקות.
    4. חזור על מדרגות שטיפת מים במשך שלוש שטיפות בסך הכל.
    5. הזן מחדש את החרוזים הסופיים במים בדרגת MS לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם/ μL. הנח את החרוזים המגנטיים שנשטפו בבאר A6 במתלה הצינורות של 2.0 מ"ל.
      הערה: החרוזים מומלץ resuspend בריכוז של 10 מיקרוגרם / μL16. במאמץ האופטימיזציה הנוכחי, הריכוז הסופי שונה ל 50 מיקרוגרם / μL כדי למזער את הנפח הכולל של תערובת חרוז-פפטיד-אצטוניטריל.
  11. ודא כי הרובוט מעביר 55 μL של דגימות מעוכלות לבארות בלוחות עמוק היטב על המודול המגנטי.
  12. ודא שפרוטוקול הרובוט מושהה ומציג את ההודעה: ודא שחרוזים מוכנים נטענו לתוך A6 מתוך ארון הצינורות של 2 מ"ל הממוקם בחריץ 4 לפני חידוש הפרוטוקול. מערבולת את החרוזים, ולאחר מכן בקצרה לסובב למטה במשך 5 s על צנטריפוגה ספסל מיני ומניחים את החרוזים בבאר A6 של מתלה צינור 2 מ"ל עם הכובע פתוח. היכונו בזמן שהרובוט מערבב את החרוזים 10 פעמים במשך חמישה סיבובים על ידי צנרת למעלה ולמטה.
    הערה: הרובוט מעביר 10 μL של חרוזים לכל מדגם מתעכל בלוחות עמוקים היטב ואחריו חמש פעמים של ערבוב.
  13. ודא כי הרובוט מעביר 1,292 μL של אצטוניטריל לכל באר ומיד מתערבב 10 פעמים על ידי צנרת למעלה ולמטה כדי להקל על פפטידים וחרוזים מחייבים.
    הערה: כל העברה הושלמה על פני מספר סיבובים מכיוון שפיפטת P300 יכולה להעביר רק עד 300 μL בכל פעם.
  14. ודא כי הרובוט מערבב את כל הדגימות חמש פעמים על ידי צנרת למעלה ולמטה בלוח עמוק היטב.
  15. חכה עד המודול המגנטי עוסק ודגימות הם דגירה על המודול במשך 2 דקות.
  16. היכונו בזמן שאיפה צינור ולחלק מהירויות מוגדרים להאט ב 25 μL /s מברירת המחדל של 150 μL / s.
    הערה: הרובוט מסיר באיטיות את הסופר-נרטיב מכל באר ומשליך אותו בצינור הפסולת בזמן שהמודול המגנטי עוסק.
  17. המתן עד שהשאיפה לצינורות ומהירויות החלוקה יוחזרו להגדרת ברירת המחדל. שימו לב שהמודול המגנטי מתנתק.
  18. ודא שהתוכנית של הרובוט מושהית ומציגה את ההודעה: ודא שמכסה הצינור ACN כבוי. באופן ידני לפתוח את צינור האצטוניטריל ולהחזיר אותו למתלה הצינור. לחץ על חדש כדי להמשיך. ודא כי הרובוט מעביר 1 מ"ל של אצטוניטריל לשטוף כל מדגם ומיד מתערבב 10 פעמים.
  19. ודא כי הרובוט מערבב את כל הדגימות 10 פעמים כדי לשטוף את הדגימות.
  20. היכונו בזמן שהמודול המגנטי עוסק ודגר את הדגימות במשך 2 דקות.
  21. חכה עד שהרובוט ישנה את מהירות השאיפה לצינורות כדי להאט ולאט לאט מסיר את העל-טבעי ומחלק אותו בצינור הפסולת.
  22. שימו לב בזמן שהרובוט מדגיר את הדגימות במודול המגנטי למשך 60 שניות כדי לאפשר לאצטוניטריל שיורית להתאדות, ואז משנה את מהירויות השאיפה של השאיפה חזרה לברירת המחדל. שימו לב שהמודול המגנטי מתנתק.
  23. ודא שתוכנית הרובוט מושהית ומציגה את ההודעה: מערבולת DMSO שוב ופתיחת אותיות רישיות. מערבולת ידנית את 2% DMSO עבור 10 s ולהניח אותו בחזרה בבאר A1 במתלה צינור 15 מ"ל-50 מ"ל. לחץ על חדש כדי להמשיך.
  24. ודא כי הרובוט מעביר 80 μL של 2% DMSO לכל באר ומיד מתערבב 10 פעמים.
  25. ודא כי הרובוט מערבב את כל הדגימות 10 פעמים עבור חמישה סיבובים נוספים.
  26. היכונו בזמן שהמודול המגנטי עוסק ודגר את הדגימות במשך 2 דקות.
  27. שימו לב בזמן שהרובוט משנה את מהירות השאיפה של הפיפטה לאיטית (25 μL/s) ומעביר לאט לאט את הסופר-נרטיב לבארות ריקות בלוח העמוק.
  28. המתינו עד שהרובוט ידגר דגימות על המודול המגנטי למשך 2 דקות כדי להסיר חרוזים שיורית בדגימות.
  29. ודא שהתוכנית של הרובוט מושהית ומציגה את ההודעה: מקם צינורות חדשים של 2 מ"ל בארון הצינורות של 2 מ"ל וודא שמספר הצינורות תואם למספר הכולל של הדגימות.
  30. מניחים את צינור המיקרו-צנטריפוגה הראשון של 2 מ"ל בבאר מיד לאחר דגימת התקציר הסופית של BSA. לחץ על חדש כדי להמשיך.
    הערה: לדוגמה, שש דגימות התקציר של BSA שנבדקו בפרוטוקול זה נמצאות בבארות A1, B1, C1, D1, A2 ו- B2. לכן, הסט החדש של צינורות 2.0 מ"ל ממוקם בארות B3, C3, D3, ... וכן הלאה.
  31. שימו לב בזמן שהרובוט מעביר 88 μL של דגימות מהבארות בצלחת העמוקה לסט החדש של צינורות 2.0 מ"ל.
    הערה: אמצעי האחסון המועבר (1.1 x 80 μL) בפרוטוקול ממוטב כדי להבטיח שכל נפח הדגימה נשאף לטיפים.
  32. היכונו בזמן שהרובוט משנה את מהירות השאיפה של פיפטה לברירת מחדל ומנתק את המודול המגנטי.
  33. ייבשו ידנית את הפפטידים המנוקים באידוי ואקום (ראו טבלת חומרים) והמשיכו לסעיף 5 או אחסנו דגימות מיובשות בטמפרטורה של -20 °C (60 °F).

4. הכנת דגימת טרשת נפוצה עם ליסאט חלבון של הלב האנושי (5 מ"ג / מ"ל) עם חרוזים פרמגנטיים SP3

  1. פתח את קובץ ה- Script של SP3_digestion.py Python וציין ערכים של משתנים במקטע התאמה אישית כאן בלבד.
    הערה: המשתנים כוללים את מספר הדגימות ואת לשכפל, ריכוז המדגם, את נפח ריאגנטים (DTT, IAA, טריפסין, חרוזים, 100% ו 80% אתנול), DTT וזמן הדגירה IAA, קצה מתחיל עבור pipettes P20 /P50 ו P300, ומתחיל היטב בלוח עמוק היטב על המודול המגנטי.
  2. בצע את השלבים 2.2-2.23 בסעיף 2 להכנת דגימת MS עם אלבומין סרום בקר חלבון יחיד לדגירה של DTT ו- IAA. עיינו באיור 1 להגדרת סיפון הרובוט בשלבים אלה.
  3. הכינו תערובת חרוזי SP3 טרייה (20 חרוזי μL לכל תגובת ניקוי) לניקוי חלבונים (כפי שצוין בשלב 3.10) במהלך שלבי הדגירה של DTT ו- IAA (שלבים 2.15 ו-2.19). מניחים את החרוזים בבאר D6 על מתלה צינור 2 מ"ל.
  4. ודא שהתוכנית של הרובוט מושהית עם ההודעה: פתח את כובעי הצינור. בטל באופן ידני את צינורות הדגימה בבלוק האלומיניום מעל מודול הטמפרטורה ולחץ על המשך כדי להמשיך.
  5. ודא כי הרובוט מעביר את כל הדגימות מצינורות 2.0 מ"ל ללוח חדש עמוק היטב על גבי המודול המגנטי.
  6. ודאו שהתוכנית של הרובוט מושהית ומציגה את ההודעה: ודאו שחרוזים מוכנים נטענו ל-D6 של ארון הצינורות של 2 מ"ל הממוקם בחריץ 4 לפני חידוש הפרוטוקול. פתח את מכסה צינור החרוזים ולחץ על קורות חיים כדי להמשיך.
  7. שימו לב בזמן שהרובוט מעביר 20 μL של חרוזים לכל באר בצלחת העמוקה עם חמישה סיבובים של ערבוב של החרוזים וחמישה סיבובים של ערבוב של תערובת חרוזים מדגם.
  8. ודאו שהתוכנית של הרובוט מושהית ומציגה את ההודעה: ודאו ש-100 אחוז אתנול נטען ל-A3 מתוך ארון הצינורות של 15 מ"ל-50 מ"ל הממוקם בחריץ 5 לפני חידוש הפרוטוקול. הכן 10-20 מ"ל של 100% אתנול (כלומר, 200 אתנול הוכחה, ראה טבלת חומרים) בצינור חרוטי 50 מ"ל ומניחים אותו בבאר A3 של המתלה. לחץ על חדש כדי להמשיך.
  9. היכונו בזמן שהרובוט מעביר 140 μL של 100% אתנול לכל באר בצלחת מיד ואחריו 10 סיבובים של ערבוב כדי להקל על כריכת הפפטידים לחרוזים.
  10. ודא כי הרובוט מערבב כל מדגם על ידי צנרת למעלה ולמטה 10 פעמים בכל סיבוב עבור סך של חמישה סיבובים של ערבוב.
  11. היכונו בזמן שהמודול המגנטי עוסק ודגר את הדגימות במודול במשך 2 דקות.
  12. שימו לב בזמן שהרובוט משנה את מהירות הצנרת להאטה (25 μL/s) ושואף את הסופר-נרטיב מכל באר ומחלק אותו לצינור הפסולת.
  13. המתן עד שהרובוט ישנה את מהירות הצנרת בחזרה לברירת המחדל וינתק את המודול המגנטי.
  14. ודאו שהתוכנית של הרובוט מושהית ומציגה את ההודעה: ודאו ש-80 אחוז אתנול נטען לתוך A4 מתוך ארון הצינורות של 15 מ"ל-50 מ"ל הממוקם בחריץ 5 לפני חידוש הפרוטוקול. הכן ידנית 20 מ"ל של 80% אתנול על ידי ערבוב 4 מ"ל של מים בדרגת MS עם 16 מ"ל של 100% אתנול (כלומר, 200 הוכחה). מניחים את האתנול 80% בבאר A4 בארון הצינורות. לחץ על חדש כדי להמשיך. ודא כי הרובוט מעביר 1 מ"ל של 80% אתנול לכל באר ומיד מתערבב 10 פעמים.
  15. שימו לב בזמן שהרובוט משנה את מהירות הצנרת לאיטית (25 μL/s), שואף את הסופר-נרטיב מכל באר, ומחלק לצינור הפסולת. המתן עד שהרובוט ישנה את מהירות הצנרת בחזרה לברירת המחדל וינתק את המודול המגנטי.
  16. פתח את המכסה של פתרון ABC כאשר התוכנית של הרובוט מושהית ומציגה את ההודעה: פתח את המכסה בצינור ABC. לחץ על חדש כדי להמשיך. היכונו בזמן שהרובוט מנתק את המודול המגנטי, מעביר 250 μL של ABC לכל באר, ומיד מתערבב במשך 10 פעמים.
    הערה: שלב זה הוא לשטוף את הדגימות עם ABC.
  17. ודא כי הרובוט עוסק המודול המגנטי ודגר דגימות על המודול במשך 2 דקות.
  18. שימו לב בזמן שהרובוט משנה את מהירות הצנרת לאיטית (25 μL/s) ומעביר את הסופר-נרטיב מכל באר לצינור הפסולת. המתן עד הרובוט מעביר 100 μL של חיץ ABC לכל באר ומיד מתערבב במשך 10 פעמים.
  19. ודאו שתוכנית הרובוט מושהית ומציגה את ההודעה: ודאו שצינורות איסוף חדשים הוצבו בבלוק אלומיניום של 2.0 מ"ל לפני חידוש הפרוטוקול. מקם קבוצה חדשה של צינורות מיקרוצנטריפוגה דלת חלבון בבלוק האלומיניום מיד לאחר צינור הדגימה האחרון בתחילה בבלוק. לחץ על חדש כדי להמשיך. היכונו בזמן שהרובוט מעביר כל דגימה במאגר ABC לצינורות 2.0 מ"ל החדשים.
    הערה: בדוק את הבארות והעבר ידנית כל דגימה שיורית לצינורות במידת הצורך.
  20. הכן כמות מתאימה של טריפסין בדרגת MS (10 μL לכל מדגם) על ידי המסת 20 מיקרוגרם של טריפסין בדרגת MS במים בדרגת MS לריכוז סופי של 0.2 מיקרוגרם / μL כאשר תוכנית הרובוט מושהית ומציגה את ההודעה: ודא שטריפסין (0.2 מיקרוגרם / μL) נטען ל- C6 של מתלה צינור 2 מ"ל הממוקם בחריץ 4 לפני חידוש הפרוטוקול. ודא כי הרובוט מעביר 10 μL של טריפסין לכל צינור מדגם, ואחריו חמישה סיבובים של ערבוב.
  21. עוטפים את כובעי צינור הדגימה בסרט פרפין, מעבירים את כל הדגימות למיקסר מבוקר טמפרטורה, ודוללים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 16-20 שעות עם רעידות של 1,000 סל"ד.
    הערה: מומלץ לבצע את העיכול עם רעד של 1,000 סל"ד כדי למזער את המשקעים של החרוזים במהלך הדגירה הלילית.

5. ניקוי פפטיד באמצעות חרוזים פרמגנטיים SP3

  1. בצע את ההוראות בשלב 2, ניקוי פפטיד באמצעות חרוזים פרמגנטיים SP3.

6. כרומטוגרפיה נוזלית וספקטרומטריית מסה

  1. Resuspend BSA (שלבים 2-3) ו lysate הלב (שלב 4) פפטידים ב 0.1% חומצה פורמית על ידי הוספת 1 מ"ל LC-MS כיתה 99% חומצה פורמית במי MS לנפח כולל של 1 L.
    זהירות: חומצה פורמית היא חומצה חזקה. זה מאכל מאוד לעיניים, לעור ולמערכת הנשימה. לטפל בזהירות תחת מכסה המנוע הכימי לובש PPE.
  2. לכמת את ריכוז הפפטיד לאחר העיכול באמצעות ערכת בדיקת פפטיד כמותית17 ולהזריק 0.5 מיקרוגרם של תקציר BSA ו 1.5 מיקרוגרם של עיכול לב לניתוח LC-MS / MS.
  3. הגדר את תוכנית הכרומטוגרפיה הנוזלית לניתוח LC-MS/MS.
    הערה: בהגדרה טיפוסית, ניתן לטעון תקצירי פפטיד בעמודת C18 הפוכה (חלקיק 3 מיקרומטר; 100 נקבוביות Å; 75 מיקרומטר x 150 מ"מ; ראה טבלת חומרים) באמצעות הפרמטרים המפורטים בקובץ משלים 2.
  4. לרכוש נתוני פרוטאומיקה רובה ציד באמצעות ספקטרומטר מסה (ראה טבלת חומרים) באמצעות הפרמטרים המסופקים קובץ משלים 3.
  5. חפש במאגר החלבון זיהוי חלבונים.
    1. הורד והתקן את התוכנה הנדרשת, MaxQuant.
      הערה: תוכנת MaxQuant (v.1.6.10.43) שימשה כאן לשלבים הבאים (ראה טבלת חומרים).
    2. הורד את מסד הנתונים של פרוטאום אנושי שנאצר ממסד נתונים של רצף חלבונים באיכות גבוהה (UniProt/SwissProt) (ראה טבלת חומרים). לחץ על לחצן ההורדה ובחר FASTA (קנוני).
      הערה: לחלופין, הורד FASTA (לא קנוני) כדי לכלול איזופורמים של חלבון של כל גן במסד הנתונים, אם תרצה.
    3. בממשק התוכנה MaxQuant, ציין את קובץ FASTA שישמש כמסד נתונים של חלבונים על-ידי ניווט לחלונית Global Parameters ולחץ על הכרטיסיה רצפים ; לאחר מכן, לחץ על לחצן הוסף כדי לציין את נתיב הקובץ לקובץ FASTA.
    4. בממשק התוכנה של MaxQuant, ציין את קבצי ספקטרום המסה הגולמית שנרכשו שיש לנתח על-ידי מעבר ללוח Raw Data ולחיצה על לחצן טען ובחר את הקבצים הגולמיים.
    5. כוונן פרמטרי חיפוש כפי שמוצג בטבלה 1. אפשר כימות ללא תוויות (LFQ) במידת הצורך.
    6. המתן להשלמת החיפוש ואתר את מספר ההתאמות בספקטרום הפפטיד (PSMs) העוברות את סף ה- FDR של 1% בקובץ msms.txt בתיקיה /combined/txt.
      הערה: בהשוואות שבוצעו כאן עבור סעיף התוצאות הייצוגיות, PSMs מופו לחלבונים מרובים סוננו החוצה, ו- PSMs הממופים לחלבון ייחודי אחד נשמרו כדי לספור את מספר ה- PSMs, הפפטידים והחלבונים (איור 4 ואיור 5).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

שלושה סקריפטים Python מסופקים כאן התואמים לרובוט OT-2, ומבצעים הכנה מדגמית עבור פרוטאומיקה ספקטרומטרית מסה עם אלבומין סרום בקר סטנדרטי חלבון יחיד (טכני משכפל n = 5 עיכולים) ודגימת ליסט לב אנושי המכילה חומר ניקוי (n = 5 עיכולים). כל מוצר תקציר מחולק לשתי תגובות ניקוי פפטיד. מספר ההתאמות המזוהות בספקטרום הפפטיד (PSMs), הפפטידים והחלבונים בכל ריצה של דגימות ה-BSA והלב מוצג באיור 4 ובאיור 5. חציון של 728 PSMs ו 65 פפטידים זוהו עם מדגם BSA, עם 5.2% ו 3.2% מקדמי וריאצ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שלבים קריטיים בפרוטוקול
לקבלת הביצועים הטובים ביותר, יש להשתמש בתוכנות מעבדה מאומתות של Opentrons, מודולים וחומרים מתכלים התואמים ל- OT-2. תוכנות מעבדה מותאמות אישית ניתן ליצור בעקבות ההוראה של Opentrons ב Reference14. הקפד לכייל את סיפון OT-2, פיפטות, ו labware בעת שימוש בפעם הראשונה. זה גם קריטי לעקוב אחר הנחיות מיצרן חרוזי SP3 כדי להכין חרוזים לניקוי פפטיד וחלבון. ראוי לציין, במהלך תגובת מחייב חרוז ופפטיד, נפח האצטוניטריל בתגובה המחייבת צריך להיות ≥95%, וריכוז החרוזים צריך ל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין קונפליקטים להצהיר.

תודות

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי פרסי NIH F32-HL14919191 ל- YH; R00-HL144829 לאל על; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 ל- MPL. איור 1, איור 2, איור 3 נוצרים בעזרת כלי איור מדעי מבוסס אינטרנט, BioRender.com.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
300 ומיקרו; קצות פיפטה LOpentrons
סט מתלה צינורות 4 ב-1Opentronsכל סט כולל 2 מעמדי בסיס ו-4 צמרות מחזיק צינורות 1.5 מ"ל, 2 מ"ל, 15 מ"ל + 50 מ"ל, 15 מ"ל ו-50 מ"ל. אנו משתמשים ב-2 מ"ל ו-15 מ"ל + 50 מ"ל במחקר זה.
שבחים PepMap 100 C18 HPLC עמודתרמו מדעי#1645683 μ חלקיק m; 100 וארינג; נקבוביות; 75 μ m x 150 מ"מ
אצטוניטריל LC-MS כיתהVWR
סט בלוקים מאלומיניוםOpentronsסט בלוקים זה כולל 3 צמרות התואמות לצינורות 96 בארות, 2.0 מ"ל ורצועת PCR לשימוש עם מודול הטמפרטורה OT-2. אנו משתמשים במחזיק הצינור של 2.0 מ"ל בכתב היד הזה.
אמוניום ביקרבונטסיגמא-אולדריץ'# A6141
סרום בקר אלבומין סטנדרטי, 2 מ"ג / מ"לתרמו מדעי# 23210
דימתילסולפוקסיד (DMSO) LC-MS כיתהתרמו מדעי# 85190
דיתיותרייטולסיגמא-אולדריץ'#D5545
עמודות HPLC EASY-Sprayתרמו מדעי#ES800A
EasynLC 1200 Nano LCThermo Scientific#LC140
הוכחת אתנול 195-200Fisher#04-355-720
חומצה פורמית LC-MS כיתהThermo Scientific#85178
ליזאט לב אנושיNovus BiologicalsNB820-59217
יודואצטמידסיגמא-אולדריץ'#I1149
מתלהצינור מגנטיThermo Scientific#MR02
MAXQuant v.1.6.10.43Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/)
mySPIN 6 מיני צנטריפוגהThermo Scientific#75004061מיני צנטריפוגה ספסל לסיבוב מהיר
NEST 2 מ"ל 96 בארות צלחת באר עמוקה, V תחתוןOpentrons
OT-2 מודול מגנטיOpentronsGEN1
OT-2 P300 פיפטה חד ערוץOpentronsGEN1
OT-2 P50 פיפטה חד ערוציתOpentronsGEN1
OT-2 רובוט פיפטינגרובוט OpentronsOT-2
OT-2 מודול טמפרטורהOpentronsGEN1
פירס כמותי בדיקת פפטיד קולורימטריתרמו מדעי#23275
צינורות חלבון LoBind 2.0 מ"לEppendorf#022431102
מסד נתונים של רצף חלבוניםUniProt/SwissProthttps://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640%
20ביקורת:כן
Sera-Mag SpeedBead חלקיקים מגנטיים שעברו שינוי קרבוקסילאט, HydrophobicCytiva#65152105050250
Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified חלקיקים מגנטיים, HydrophylicCytiva#45152105050250
SpeedVacThermo Scientificמאייד ואקום
Thermo Q אקסאקטיבי HF ספקטרומטר מסהתרמו מדעי#IQLAAEGAAPFALGMBFZ
טריפסין MS כיתהתרמו מדעי# 90057
מים LC-MS כיתהVWR#BDH83645.400
#JT9829

מקורות

  1. Geyer, P. E., et al. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942(2017).
  2. Coscia, F., et al. A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis. The Journal of Pathology. 251 (1), 100-112 (2020).
  3. Yeung, Y. -G., Neives, E., Angeletti, R., Stanley, E. R., et al. Removal of detergents from protein digests for mass spectrometry analysis. Analytical Biochemistry. 382 (2), 135-137 (2008).
  4. Addona, T. A., et al. Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma. Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).
  5. Lowenthal, M. S., Liang, Y., Phinney, K. W., Stein, S. E. Quantitative bottom-up proteomics depends on digestion conditions. Analytical Chemistry. 86 (1), 551-558 (2014).
  6. Elliott, K. C., Resnik, D. B. Scientific reproducibility, human error, and public policy. Bioscience. 65 (1), 5-6 (2015).
  7. Brown, A. W., Kaiser, K. A., Allison, D. B. Issues with data and analyses: Errors, underlying themes, and potential solutions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (11), 2563-2570 (2018).
  8. van den Broek, I., et al. Automated multiplex LC-MS/MS assay for quantifying serum apolipoproteins A-I, B, C-I, C-II, C-III, and E with qualitative apolipoprotein E phenotypic. Clinical Chemistry. 62 (1), 188-197 (2016).
  9. Müller, T., et al. Automated sample preparation with SP3 for low-input clinical proteomics. Molecular Systems Biology. 16 (1), 9111(2020).
  10. Fu, Q., et al. Highly reproducible automated proteomics sample preparation workflow for quantitative mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).
  11. Liu, X., Gygi, S. P., Paulo, J. A. A semiautomated paramagnetic bead-based platform for isobaric tag sample preparation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (6), 1519-1529 (2021).
  12. Poulsen, K. M., Pho, T., Champion, J. A., Payne, C. K. Automation and low-cost proteomics for characterization of the protein corona: experimental methods for big data. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 6543-6551 (2020).
  13. Liang, Y., et al. Fully automated sample processing and analysis workflow for low-input proteome profiling. Analytical Chemistry. 93 (3), 1658-1666 (2021).
  14. Web URL. , Available from: https://opentrons.com/ot-app/ (2021).
  15. Web URL. , Available from: https://docs.opentrons.com/v2/ (2021).
  16. Web URL. , Available from: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry (2021).
  17. Web URL. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275 (2021).
  18. Han, Y., Wright, J. M., Lau, E., Lam, M. P. Y. Determining alternative protein isoform expression using RNA sequencing and mass spectrometry. STAR Protocols. 1 (3), 100138(2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הכנת דגימותאוטומציה של מעבדהרובוט בקוד פתוחעיכול חלבוניםספקטרומטריית מסותמערכת לטיפול בנוזליםסקריפטים לאוטומציה ב-Pythonרדוקציית חלבוניםניקוי פפטידים
רובה ציד Proteomics עיבוד מדגם אוטומטי על ידי רובוט מעבדה קוד פתוח
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.