אנו מציגים פרוטוקול לקביעת כיראליות רב-תאית במבחנה, תוך שימוש בטכניקת המיקרו-פטרינג. בדיקה זו מאפשרת כימות אוטומטי של הטיות שמאל-ימין של סוגים שונים של תאים וניתן להשתמש בה למטרות סינון.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
כיראליות היא תכונה תאית פנימית, המתארת את האסימטריה במונחים של קיטוב לאורך ציר שמאל-ימין של התא. מכיוון שתכונה ייחודית זו מושכת תשומת לב גוברת בשל תפקידיה החשובים הן בהתפתחות והן במחלות, שיטת כימות סטנדרטית לאפיון כיראליות תאים תקדם את המחקר ואת היישומים הפוטנציאליים. בפרוטוקול זה אנו מתארים בדיקה של אפיון כיראליות רב-תאית המשתמשת במערכים מיקרו-פטרתיים של תאים. מיקרו-פטרנים סלולריים מיוצרים על שקופיות זכוכית מצופים טיטניום/זהב באמצעות הדפסה מיקרו-קונקרטית. לאחר זריעה על האיים המוגדרים באופן גיאומטרי (למשל, בצורת טבעת), המצופים בחלבון, התאים נודדים בכיוון ויוצרים יישור מוטה לכיוון הכיוון השעון או לכיוון נגד כיוון השעון, אותו ניתן לנתח ולכמת באופן אוטומטי על ידי תוכנית MATLAB שנכתבה בהתאמה אישית. כאן אנו מתארים בפירוט את הייצור של מצעים micropatterned, זריעת תאים, איסוף תמונות וניתוח נתונים ומציגים תוצאות מייצגות שהושגו באמצעות תאי NIH/3T3. פרוטוקול זה אומת בעבר במספר מחקרים שפורסמו והוא כלי יעיל ואמין לחקר כיראליות תאים במבחנה.
מבוא
אסימטריה שמאל-ימין (LR) של התא, הידועה גם בשם ידיים תאיות או כיראליות, מתארת את קוטביות התא בציר LR ומוכרת כתכונה ביופיזית בסיסית, שמורה, 1,2,3,4,5. כיראליות התא נצפתה הן in vivo והן in vitro במספר קשקשים. ממצאים קודמים חשפו מערבולת כיראלית של שלד אקטין ציטוסקלטון בתאים בודדים שנזרעו באיים עגולים6, נדידה ויישור מוטים של תאים בתוך גבולות מוגבלים 7,8,9,10,11, ולולאה א-סימטרית של צינור חום....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. ייצור חותמות פולידימתילסילוקסן (PDMS)16
- ציירו מערך של טבעות בקנה מידה זעיר באמצעות תוכנת CAD, עם קוטר פנימי של 250 מיקרומטר וקוטר חיצוני של 450 מיקרומטר. התבנית המשמשת בפרוטוקול זה היא מערך של 10 x 10 עם מרחק של 850 מיקרומטר בין טבעות.
- הדפס מסכת שקיפות של התבנית ברזולוציה הרצויה באמצעות שירות הדפסת המסכות של חברת המיקרו-פבריקציה (ראה טבלת חומרים).
הערה: הממדים שסופקו של הטבעת הוכחו כעובדים עבור סוגי תאים רבים7. - ביצוע פוטוליתוגרפיה אולטרה סגולה (UV) באמצעות המסכה המכילה את התכונות הרצויות ליצירת תבנית פוטורסיסטית שלילית (כגון SU-8)8.
- כסו ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
רבע שעה לאחר זריעת תאי NIH/3T3, הידבקות התאים בתבנית הטבעת אושרה חזותית על ידי הדמיית ניגודיות פאזה. לאחר תרבית מאוחרת יותר של 24 שעות, התאים על התבניות התכנסו והתארכו עם יישורים א-סימטריים בעליל, מוטים לכיוון הכיוון השעון (איור 2). נדידה כיוונית של תאים מחוברים נרשמת על ידי הדמיה בהילוך מהיר, ניתן לכמת את תנועתיות התאים ואת המורפוגנזה באמצעות ניתוחים נוספים של הסרטון. כדי לבצע ניתוח כיראליות, תמונות של ניגודיות פאזה ברזולוציה גבוהה נלקחות לאחר הקיבוע (איור 2A-C.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בדיקת התבניות בצורת טבעת המתוארת כאן מספקת כלי קל לשימוש לאפיון כמותי של כיראליות רב-תאית, המסוגלת להפיק תוצאות אמינות ביותר וניתנות לחזרה. ייצור מהיר של מיקרו-סביבה מוגדרת זהה וניתוח בלתי מוטה מאפשר עיבוד אוטומטי בתפוקה גבוהה של דגימות בגודל גדול. פרוטוקול זה דן בייצור המיקרו-פטרנים הטבעתיים, בתבניות התאים ובניתוח אוטומטי של יישור התאים המוטה ותנועת הכיוון. שיטה זו תואמת לטכניקות הדמיה חיות לחקר תנועתיות התאים והמורפוגנזה הכיראלית, וניתן לשלב אותה באופן פוטנציאלי בתוכנות אחרות לזיהוי רעילות9 או ל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (OD /NICHD DP2HD083961 ו- NHBLI R01HL148104). ליאו ק. וואן הוא חוקר פיו במדעים ביו-רפואיים (PEW 00026185), הנתמך על ידי נאמנויות הצדקה של פיו. האוקאנג ג'אנג נתמך על ידי מלגת קדם-דוקטורט של איגוד הלב האמריקאי (20PRE35210243).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 200 הוכחה אתנול | Koptec | DSP-MD-43 | |
| BZX מערכת מיקרוסקופ | Keyence | BZX-600 | |
| מדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM), מאייד | Gibco | ||
| Temscal | BJD-1800 | ציפוי סרט זהב-טיטנום | |
| סרום בקר עוברי | VWR | 89510-186 | |
| פיברונקטין מפלזמת בקר | סיגמא | F1141-5MG | |
| שקופיות מיקרוסקופ זכוכית | VWR | 10024-048 | |
| פינצטה מזכוכית | Exelta | 390BSAPI | |
| כדורי אידוי זהב | חומרים מתקדמים בינלאומיים | AU18 | |
| HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3) | Prochimia | TH 001-m11.n3-0.2 | |
| MATLAB | Mathworks | MATLAB_R2020b | |
| תאי NIH/3T3 ATCC | CRL-1658 | ||
| OAI יישור מגע | OAI | 200 | פוטוליתוגרפיה UV |
| אוקטדקנתיול (C18) | Sigma | O1858-25ML | |
| שייקר אורביטלי | VWR | 89032-088 | |
| מי מלח חוצץ פוספט (PBS) | מוצר מחקר בינלאומי | P32080-100T | |
| פולידימתילסילוקסן סילגארד 184 | דאו קורנינג | DC4019862 | |
| רקיק אוניברסיטת | רקיק סיליקון | מזהה #809 | |
| נתרן פירובט | תרמו פישר מדעי | 11360-070 | |
| SU-8 3050 פוטו-רזיסט | MicroChem | Y311075 0500L1GL | |
| כדורי אידוי טיטניום | בינלאומי מתקדם חומרים | מסכת שקיפות TI14 | |
| (עם תכונה) | Outputicity.com | שירות | הדפסת מסכות |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo fisher scientific | 25200-072 |
מקורות
- Wan, L. Q., Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P. Cell chirality: emergence of asymmetry from cell culture. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371, 20150413(2016).
- Rahman, T., Zhang, H., Fan, J., Wan, L. Q.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
