פרוטוקול זה מתאר אסטרטגיות לזיהוי והעשרה של מצב התא בתרביות תאי גזע עצביים ראשוניים של עכברים בוגרים על ידי הדמיה אוטופלואורסצנטית באמצעות i) מיקרוסקופ קונפוקלי, ii) ממיין תאים מופעל פלואורסצנטי לביצוע דימות עוצמה, או iii) מיקרוסקופ מולטיפוטון לביצוע הדמיה פלואורסצנטית לכל החיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
סיווג מצב הפעלת תאי גזע עצביים במבחנה באמצעות אוטופלואורסנציה
במאמר זה
סיכום
תקציר
תאי גזע עצביים (NSCs) מתחלקים ומייצרים תאי עצב שזה עתה נולדו במוח הבוגר באמצעות תהליך שנקרא נוירוגנזה של מבוגרים. תאי גזע עצביים בוגרים הם בעיקר שקטים, מצב תאים הפיך שבו הם יצאו ממחזור התא (G0) אך נשארים מגיבים לסביבה. בשלב הראשון של נוירוגנזה בוגרת, תאי גזע עצביים שקטים (qNSCs) מקבלים אות ומפעילים, יוצאים מהשקט ונכנסים מחדש למחזור התא. לפיכך, הבנת הרגולטורים של יציאת המל"ל היא קריטית לאסטרטגיות עתידיות המכוונות לנוירוגנזה של מבוגרים. עם זאת, הבנתנו את השקט של NSC מוגבלת על ידי אילוצים טכניים בזיהוי NSCs שקטים (qNSCs) ו- NSCs מופעלים (aNSCs). פרוטוקול זה מתאר גישה חדשה לזיהוי והעשרה של qNSCs ו- aNSCs שנוצרו בתרביות חוץ גופיות על ידי הדמיה של NSC autofluorescence. ראשית, פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במיקרוסקופ קונפוקלי כדי לזהות סמנים אוטופלואורסצנטיים של qNSCs ו- aNSCs כדי לסווג את מצב ההפעלה של NSC באמצעות עוצמת הפלואורסצנטיות האוטופלואורסצנטית. שנית, פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש בממיין תאים מופעלים פלואורסצנטיים (FACS) כדי לסווג מצב הפעלה של NSC ולהעשיר דגימות עבור qNSCs או aNSCs באמצעות עוצמת אוטופלואורסצנטיות. שלישית, פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במיקרוסקופ מולטיפוטון כדי לבצע דימות חיים פלואורסצנטי (FLIM) ברזולוציה של תא יחיד, לסווג את מצב ההפעלה של NSC ולעקוב אחר הדינמיקה של יציאה שקטה באמצעות עוצמות אוטופלואורסצנטיות ותקופות חיים פלואורסצנטיות. לפיכך, פרוטוקול זה מספק ערכת כלים לרזולוציה של תא חי, ללא תוויות, עבור חקר השקט של NSC ויציאת השקט.
מבוא
תאי גזע עצביים נוצרים במהלך החיים באורגניזמים רבים בתהליך המכונה נוירוגנזה של מבוגרים 1,2. כדי לייצר נוירונים שזה עתה נולדו, qNSC תחילה חייב לפעול, להיכנס למחזור התא כדי להרחיב את האוכלוסייה ולייצר אבות עצביים 3,4,5,6. למרות שידוע רבות על השקט של המל"ל, היכולת שלנו לזהות באופן מלא את הנהגים והרגולטורים של המל"ל מוגבלת על ידי מגבלות טכניות הקיימות כדי לבודד ולזהות qNSCs והמעבר שלהם להפעלה. הדמיה אוטופלואורסצנטית הצליחה בעבר לחקור שינויים במצב התא בסוג....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים בפרוטוקול זה מאושרים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון.
1. שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי לצילום PAF ב-qNSCs וב-aNSCs לזיהוי מצב תאי NSC
- צור qNSCs ו- aNSCs במבחנה מתרביות NSC ראשוניות.
- תרבית NSCs מטוהרים ממוחות עכברים בוגרים במדיום שגשוג לצורך הרחבה (טבלה 1)18,20,21. לכן, כברירת מחדל, תרבויות NSC במבחנה הן aNSCs.
- כדי ליצור qNSCs, השתמש בפרוטוקול הבא כדי לצלחת aNSCs על כלי זכוכית מצ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הדמיה אוטופלואורסצנטית קונפוקלית להפרדת מצב תאי NSC (איור 1)
כדי להשתמש במיקרוסקופ קונפוקלי כדי לפתור את מצב ההפעלה של NSC, qNSCs ו- aNSCs נוצרו במבחנה באמצעות מדיום הפעלה או מדיום שקט, כפי שתואר קודם לכן 10,13,17,18. כדי לזהות PAF ב-NSCs, qNSCs חיים ו-aNSCs צולמו באמצעות אותה חשיפה במיקרוסקופ קונפוקלי (לדוגמה: 405 ננומטר, Em: 580-620 נ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מתאר טכניקת רזולוציה חד-תאית חיה, נטולת תוויות, לא הרסנית, המאפשרת סיווג של מצב תאי NSC במבחנה באמצעות הדמיה של אותות אוטופלואורסצנטיים בתאי גזע עצביים. גישה זו מזהה שינויים מטבוליים המתרחשים במהלך יציאת השקט של המל"ל, המשפיעים על התכונות האופטיות של גורמים משלימים מטבוליים, כגון NAD(P)H, ומציעה יתרונות רבים על פני טכנולוגיות קיימות לחקר השקט של המל"ל. לדוגמה, טכניקות קונבנציונליות רבות לחקר qNSCs ו- aNSCs, כגון תיוג עם סמני מחזור התא כמו EdU, דורשות קיבוע של דגימות........
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.
תודות
אנו מודים לליבת ציטומטריית הזרימה של UW-Madison (P30 CA014520 ו- 1S10RR025483-01), ולחברי מעבדת מור וקהילת UW-Madison על תרומתם. אנו מודים למקורות המימון שלנו: NIH T32 T32GM008688 (ל- C.S.M.), מלגת דיאנה ג'ייקובס קלמן מ- AFAR (ל- C.S.M.), מלגת בוגר ויסקונסין (ל- C.S.M.), DP2 NIH New Innovator Award (1DP2OD025783, ל- D.L.M.), Vallee Scholar Award (ל- D.L.M.), NIH 1R56NS130450 (ל- D.L.M ו- M.C.S.), R01 CA185747 (ל-M.C.S.), R01 CA205101 (ל-M.C.S.), R01 CA211082 (ל-M.C.S.), ומענק הקרן הלאומית למדע מס' CBET-1642287 (ל- M.C.S).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| עדשת אובייקט מים 40x | עדשת אובייקטיבית Nikon | MRD77410 | בשימוש במיקרוסקופ רב-פוטוני בחלק 3 |
| 8 באר קובטה | Ibidi | 80826-90 | להדמיית aNSCs/qNSCs |
| מד כוח אנלוגי | Thorlabs | PM100A | משמש במיקרוסקופ מולטיפוטון בחלק 3 |
| אנטיביוטיקה-אנטימיקוטית (100X) (PSF) | תרמו פישר | 15240062 | אנטיביוטיקה למדיה NSC |
| B-27 | Invitrogen | 17504044 | תוסף תזונה למדיה |
| NSC BMP4 | Fisher Scientific | 5020BP010 | גורם להשראת שקט |
| אלבומין סרום בקר | סיגמא | A4919-25G | BMP4 |
| Chameleon | בשימוש במיקרוסקופ מולטיפוטון בחלק 3 | ||
| מיקרוסקופ | קונפוקלימיקרוסקופ C2 של Nikon | המשמש לחלק 1 | |
| DMEM/F-12 (ללא GlutaMAX) | Invitrogen | 11320033 | עבור NSCs |
| DNAse | Sigma | D5025-15KU | נוסף למעכב טריפסין |
| ערכת בדיקת EdU | Invitrogen | C10337 | בדיקת התפשטות לתרבית תאים |
| EGF | PeproTech | AF-100-15-500UG | גורם גדילה למדיית NSC |
| FGF | PeproTech | 100-18B | גורם גדילה למדיה NSC |
| ממיין תאים מופעל פלואורסצנטי | BD | FACSAria | ממיין תאים מופעל פלואורסצנטי המשמש לחלק 2 |
| Heparin | Sigma | H3149-50KU | למדיה |
| NSC L-15 | Invitrogen | 21083027 | להכנת תמיסת מעכב טריפסין |
| Laminin | Sigma | L2020-1MG | לציפוי כלי זכוכית |
| Nikon TiE מיקרוסקופ הפוך | Nikon | N/A | מסגרת מיקרוסקופ המשמשת לחלק 3 |
| PLO | Sigma | P3655-100MG | לציפוי כלי זכוכית |
| SPC-150 אלקטרוניקה לספירת פוטונים בודדים | בקר והיקל | N/A | משמש במיקרוסקופ מולטיפוטון בחלק 3 |
| טריפסין (לניסיון כדורים של aNSCs שגדלו ככדורים או חד-שכבתיים) | Gibco | 15090046 | לטריפסיניזציה של נוירוספרות או aNSCs דבקים |
| טריפסין (לטריפסיניזציה של qNSCs) | Gibco | 25200072 | לניסיון qNSCs דבקים |
| מעכב טריפסין | Sigma | T6522-100MG | לעיכוב טריפסיניזציה של |
| גבישי אוריאה | Sigma | U5128-5G | המשמש לאיסוף IRF |
| Versene | Thermo Fisher | 15040066 | להכנת טריפסין |
מקורות
- Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. Adult neurogenesis in the hippocampus: From stem cells to behavior. Cell. 167 (4), 897-914 (2016).
- Kuhn, H. G., Dickinson-Anson, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-r....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
