הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

סיווג מצב הפעלת תאי גזע עצביים במבחנה באמצעות אוטופלואורסנציה

1.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63110

⸱

12 באפריל 2024

 ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, University of Wisconsin-Madison, 2Morgridge Institute for Research, 3Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר אסטרטגיות לזיהוי והעשרה של מצב התא בתרביות תאי גזע עצביים ראשוניים של עכברים בוגרים על ידי הדמיה אוטופלואורסצנטית באמצעות i) מיקרוסקופ קונפוקלי, ii) ממיין תאים מופעל פלואורסצנטי לביצוע דימות עוצמה, או iii) מיקרוסקופ מולטיפוטון לביצוע הדמיה פלואורסצנטית לכל החיים.

תקציר

תאי גזע עצביים (NSCs) מתחלקים ומייצרים תאי עצב שזה עתה נולדו במוח הבוגר באמצעות תהליך שנקרא נוירוגנזה של מבוגרים. תאי גזע עצביים בוגרים הם בעיקר שקטים, מצב תאים הפיך שבו הם יצאו ממחזור התא (G0) אך נשארים מגיבים לסביבה. בשלב הראשון של נוירוגנזה בוגרת, תאי גזע עצביים שקטים (qNSCs) מקבלים אות ומפעילים, יוצאים מהשקט ונכנסים מחדש למחזור התא. לפיכך, הבנת הרגולטורים של יציאת המל"ל היא קריטית לאסטרטגיות עתידיות המכוונות לנוירוגנזה של מבוגרים. עם זאת, הבנתנו את השקט של NSC מוגבלת על ידי אילוצים טכניים בזיהוי NSCs שקטים (qNSCs) ו- NSCs מופעלים (aNSCs). פרוטוקול זה מתאר גישה חדשה לזיהוי והעשרה של qNSCs ו- aNSCs שנוצרו בתרביות חוץ גופיות על ידי הדמיה של NSC autofluorescence. ראשית, פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במיקרוסקופ קונפוקלי כדי לזהות סמנים אוטופלואורסצנטיים של qNSCs ו- aNSCs כדי לסווג את מצב ההפעלה של NSC באמצעות עוצמת הפלואורסצנטיות האוטופלואורסצנטית. שנית, פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש בממיין תאים מופעלים פלואורסצנטיים (FACS) כדי לסווג מצב הפעלה של NSC ולהעשיר דגימות עבור qNSCs או aNSCs באמצעות עוצמת אוטופלואורסצנטיות. שלישית, פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במיקרוסקופ מולטיפוטון כדי לבצע דימות חיים פלואורסצנטי (FLIM) ברזולוציה של תא יחיד, לסווג את מצב ההפעלה של NSC ולעקוב אחר הדינמיקה של יציאה שקטה באמצעות עוצמות אוטופלואורסצנטיות ותקופות חיים פלואורסצנטיות. לפיכך, פרוטוקול זה מספק ערכת כלים לרזולוציה של תא חי, ללא תוויות, עבור חקר השקט של NSC ויציאת השקט.

מבוא

תאי גזע עצביים נוצרים במהלך החיים באורגניזמים רבים בתהליך המכונה נוירוגנזה של מבוגרים 1,2. כדי לייצר נוירונים שזה עתה נולדו, qNSC תחילה חייב לפעול, להיכנס למחזור התא כדי להרחיב את האוכלוסייה ולייצר אבות עצביים 3,4,5,6. למרות שידוע רבות על השקט של המל"ל, היכולת שלנו לזהות באופן מלא את הנהגים והרגולטורים של המל"ל מוגבלת על ידי מגבלות טכניות הקיימות כדי לבודד ולזהות qNSCs והמעבר שלהם להפעלה. הדמיה אוטופלואורסצנטית הצליחה בעבר לחקור שינויים במצב התא בסוגי תאים רבים ושונים, כגון תאי מיקרוגליה ותאי T, על ידי פתרון עיצוב מחדש מטבולי, המשפיע על התכונות האופטיות של גורמים משלימים מטבוליים אוטופלואורסצנטיים כגון ניקוטין-אמיד אדנין דינוקלאוטיד פוספט (NAD(P)H ופלבין אדנין דינוקלאוטיד (FAD)7,8. NSCs משפצים באופן משמעותי את הרשתות המטבוליות שלהם כשהם עוברים יציאה שקטה 9,10,11,12,13,14. לכן, כדי לנצל הבדלים אלה, NSC autofluorescence שימש לאחרונה כדי לזהות ולהעשיר את מצב ההפעלה NSC על ידי זיהוי שינויים autofluorescence המיוחסים remodeling מטבולי המתרחשת כאשר NSCs לצאת quiescence15. הדמיה אוטופלואורסצנטית מספקת מספר יתרונות טכניים: i) היא אינה דורשת תוספת של תוויות אקסוגניות, אשר יכולות להשפיע על התנהגות התא; ii) הוא יכול לספק נתונים ברזולוציה גבוהה של תא בודד על מצב ההפעלה של NSC; (ג) היא אינה דורשת את השמדת התא 7,16. פרוטוקול זה מתאר שלוש אסטרטגיות לרתימת האוטופלואורסנציה של NSC לחקר מצבי התא השקט והמופעל של NSC15.

לאחרונה, NSCs שבודדו מעכברים זכרים בני 6 שבועות מהאזור התת-גרעיני של ההיפוקמפוס, שגודלו בתרבית והוכנסו באופן הפיך לשקט במבחנה 10,13,17,18,19,20,21, נמצאו כבעלי רמות מוגברות של ניקוב אוטופלואורסצנטי (PAF) המלהיבים בין 400-600 ננומטר ופולטים בין 500-700 ננומטר. אות זה היה ספציפי ל-qNSCs בהשוואה ל-NSCs15 מופעלים. היכולת להפריד חזותית בין שתי אוכלוסיות אלה ללא שימוש בסמני נוגדנים נוספים או בכתבים שימושית לשאלות ניסוייות רבות על אופי qNSCs ויציאות שקטות. לפיכך, ראשית, פרוטוקול זה מתאר אסטרטגיות להדמיה של PAF ב- qNSCs באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, שניתן להשתמש בו כדי לזהות את מצב ההפעלה של NSC. שנית, פרוטוקול זה מתאר אסטרטגיות לזיהוי PAF באמצעות מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) ומתאר גם כיצד למיין בהתבסס על אות זה כדי להעשיר qNSCs או aNSCs. אסטרטגיות אלה מספקות מדד אחד שניתן להשתמש בו כדי לקבץ ולהפריד NSCs בהתבסס על מצב התא.

כדי לפתח שיטה ברזולוציה גבוהה יותר להפרדת NSCs לא רק במצבים נפרדים אלא גם כאשר הם עוברים דרך יציאת שקט לקראת הפעלה מלאה, דימות חיים פלואורסצנטי (FLIM) בוצע באמצעות מיקרוסקופ מולטיפוטון כדי לצלם NAD(P)H (המכונה ערוץ 1) autofluorescence ו autofluorescence ירוק (המכונה ערוץ 2; אשר מזהה הן FAD autofluorescence ו PAF ב qNSCs) חיים יחד עם העוצמה שלהם. גישה זו מנצלת את העובדה שהתכונות האופטיות של מולקולות בתא תלויות בתכונותיהן הפיזיקליות 16,22. לדוגמה, NAD(P) (NAD ו-NADP אינם ניתנים להבחנה אופטית, ולכן NAD(P) משמש להתייחסות לשני המינים) אינו אוטופלואורסצנטי במצב מחומצן אלא אוטופלואורסצנטי במצבו המופחת (NAD(P)H)23. יתר על כן, תכונות פיזיקליות נוספות של מולקולות אוטופלואורסצנטיות, כגון מצב הקישור שלהן לאנזימים, ניתנות לאקסטרפולציה על ידי ביצוע הדמיית חיים פלואורסצנטית 7,22,24. לדוגמה, ל-NAD(P)H יש אורך חיים פלואורסצנטי קצר יותר כאשר הוא אינו קשור לאנזים22. מכיוון שמולקולות אוטופלואורסצנטיות כגון NAD(P)H, המעורבות במאות תגובות מטבוליות, משמשות באופן שונה תאים המתקדמים דרך מצבים שונים או התנהגויות תאים שונות, ניתן לזהות ולכמת שינויים אלה באמצעות מיקרוסקופ מולטיפוטון המזהה חיים אוטופלואורסצנטיים23. יחד עם השפע, או העוצמה, של האוטופלואורסצנטיות, אמצעים אלה מספקים מידע רב-ממדי להפרדת תאי גזע עצביים למצב תא זה או אחר ובאמצעות המעברים הדינמיים בין מצבים. שלישית, פרוטוקול זה מתאר ביצוע, ניתוח ופירוש של מדדי FLIM ועוצמה של אותות ערוץ 1 (NAD(P)H) וערוץ 2 (PAF) באמצעות מיקרוסקופ רב-פוטונים. לסיכום, פרוטוקול זה מתאר ערכת כלים ללא תוויות של תאים חיים לחקר מצב NSC המספקת נתונים ברזולוציה גבוהה של תא בודד על מצב NSC.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים בפרוטוקול זה מאושרים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון.

1. שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי לצילום PAF ב-qNSCs וב-aNSCs לזיהוי מצב תאי NSC

  1. צור qNSCs ו- aNSCs במבחנה מתרביות NSC ראשוניות.
    1. תרבית NSCs מטוהרים ממוחות עכברים בוגרים במדיום שגשוג לצורך הרחבה (טבלה 1)18,20,21. לכן, כברירת מחדל, תרבויות NSC במבחנה הן aNSCs.
    2. כדי ליצור qNSCs, השתמש בפרוטוקול הבא כדי לצלחת aNSCs על כלי זכוכית מצופים ולאחר מכן לטפל בהם עם מדיום qNSC כדי לגרום שקט במשך 3 ימים.
    3. הכינו כלי זכוכית עם מקדם שבירה המתאים לטבילה בשמן מטרות להדבקת NSCs על ידי ציפוי תחילה בתמיסת פולי-L-אורניתין (אש"ף; 10 מ"ג/מ"ל במים לפלסטיק, 50 מ"ג/מ"ל במים לזכוכית) המספיקה לכיסוי תחתית הצלחת (לקובט הדמיה בגודל 1 ס"מ2 , השתמשו ~ 150 μL) למשך שעה אחת ב-37°C ב-ddH2O.
    4. הסר את תמיסת אש"ף ושטוף 3 פעמים במי מלח חוצצי פוספט (PBS).
    5. מצפים בתמיסת למינין (5 מ"ג/מ"ל) מספיק כדי לכסות את תחתית המנה (לקובט הדמיהבגודל 1 ס"מ 2 היטב, יש להשתמש ~ 150 μL) ב-PBS ולדגור לפחות במשך 3 שעות ב-37°C, או למשך הלילה.
    6. הסר את תמיסת הלמינין, ולאחר מכן הוסף מדיום תרבית מספיק כדי לכסות את תחתית המנה (עבור קובטת הדמיה 1 ס"מ2 , השתמש ~ 150 μL).
    7. הכן את התאים עבור טריפסיניזציה על ידי צנטריפוגות aNSCs (הם יכולים להתחיל כמו monolayers או neurospheres) ב 120 x גרם במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר (RT, ~ 25 ° C).
    8. טריפסיניזציה של aNSCs כדוריים מהשלב הקודם בתערובת טריפסין של 100 מיקרוליטר למשך 5 דקות ב-37°C ולאחר מכן הרוו את הטריפסיניזציה עם 200 מיקרוליטר של תערובת מעכבי טריפסין (טבלה 1).
    9. הניחו למלש"בים לשבת במשך 2 דקות, ולאחר מכן טריטורו אותם באופן מכני על ידי פיטום למעלה ולמטה 10 פעמים.
    10. הוסף 5 מ"ל של תווך aNSC, ולסובב את התאים ב 120 x גרם במשך 4 דקות.
    11. השהה מחדש את ה- NSCs ב- 1 מ"ל של תווך aNSC וצלחת את התאים במפגש של 10%-20% בתווך aNSC. לדוגמה, צלחת ~ 5,000 תאים לתוך באר אחת של 1 ס"מ2 cuvette cuvette עם 150 μL בינוני.
    12. לאחר מתן 24 שעות עבור aNSCs להיצמד לפני השטח של המנה, להסיר את התווך aNSC ולהחליף אותו עם מדיום qNSC מספיק כדי לכסות את החלק התחתון של הצלחת (עבור קובטת הדמיה 1 ס"מ2, להשתמש ~ 150 μL; טבלה 1- כפי שתואר לעיל 10,13,17,18) בבארות שבהן תיווצר שקט.
    13. שנה את מדיום aNSC ו- qNSC לפחות פעם ביומיים. לאחר 3 ימים בתווך qNSC, NSCs שקטים וניתן להשתמש בהם לניסויי הדמיה.
  2. השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי כדי לצלם qNSCs חיים ו- aNSCs במבחנה.
    הערה: לכל מיקרוסקופ יש תוכנה קניינית משלו; לכן, בצע את השלבים הבאים על ידי ביצוע פעולות מקבילות כדי להגדיר מיקרוסקופ מסוים. פרוטוקול זה יספק הוראות לעבודה ב- NIS-Elements.
    1. הגדר את המיקרוסקופ הקונפוקלי להדמיית אוטופלואורסצנטיות.
      1. לחץ על לייזר 405 והקלד בחלון הפליטה בתפריט לייזר 405 . לחץ על TD כדי לאסוף תמונת אור משודרת ולהגדיר את ערך HV כדי להמחיש את הדגימה.
      2. הגדר את עוצמת הלייזר ל -3.5% והרווח ל -75. הגדר את גודל התצוגה ל- 2. הגדר את פרמטרי הסריקה הקונפוקלית, הגדר את השתהות הפיקסלים ל- 0.5 והגדר את הרזולוציה ל- 2048 x 2048 פיקסלים.
    2. הבא את התאים למיקוד תחת עדשה אובייקטיבית של ~60x טבילת שמן באמצעות שדה בהיר כדי להתמקד.
    3. עבור למצב סריקה קונפוקלית על-ידי לחיצה על יציאת עיניים, כדי לוודא שנתיב האור עובר כעת לראש הסריקה ושאין קוביית מסנן בנתיב האור.
    4. PAF מועשר ב-qNSCs והוא מעורר ופולט באופן נרחב (ראו איור 1). בחר את התצורה האופטית הטובה ביותר בהתבסס על יכולות המערכת באמצעות איור 1 כמדריך. לקבלת האות החזק והנקי ביותר, התרגש עם לייזר בין ~ 400-500 ננומטר, אסוף ~ 580-620 ננומטר, והשתמש בעדשה אובייקטיבית טבילת שמן ~ 60x.
      הערה: הדמיה אוטופלואורסצנטית דורשת כוחות לייזר גבוהים יותר כדי לעורר מאשר ניסויי הדמיה טיפוסיים דורשים. אם אתם מדמים מולקולות אוטופלואורסצנטיות אחרות או תוויות אחרות יחד עם PAF, תכננו בקפידה את התצורה האופטית כדי למנוע גלישה לתעלות אוטופלואורסצנטיות.
    5. רכוש תמונות של autofluorescence ב qNSCs ו aNSCs. לחץ על סריקה, התמקד בתמונה ולאחר מכן לחץ על לכידה. לקבלת התמונות הטובות ביותר, אסוף תמונות חד-מישוריות עם הציטופלסמה של התאים (בהתבסס על אוטופלואורסצנטיות עמומה המפוזרת באופן מפוזר ברחבי התא) כדי לקבל חתך מייצג של כל תא.
    6. השתמש בתצורה אופטית זהה (למשל, אותה עוצמת לייזר) ובדגימות תמונה באותו יום אם ברצונך להשוות ישירות בין תמונות שונות.
    7. הכוחות המדויקים של הלייזר והגלאי יהיו תלויים בכל מערכת ספציפית. התחל על ידי שימוש בכוחות לייזר נמוכים ולאחר מכן לאט לאט להגדיל את העוצמה עד האות ניתן לזהות מבלי להיות רווי.
  3. נתח PAF ב- qNSCs חיים ו- aNSCs במבחנה.
    1. לאחר רכישת תמונות אוטופלואורסצנטיות ב- qNSCs או aNSCs, כמת את התמונות על ידי פתיחת קובץ ב- ImageJ25.
    2. השתמש באפשרות Process > Filters > Gaussian Blur (Sigma: 2) בתמונה של qNSC/aNSC autofluorescence כדי להחליק פיקסלים לא אחידים.
    3. השתמש ב- Image > Adjust > Threshold לבחירת פיקסלים המייצגים PAF (ביטול פיקסלים ברקע) ולחץ על Apply. השתמש באותם פרמטרי סף עבור כל התמונות שיושוו ישירות.
    4. השתמש בתהליך > קו פרשת מים בינארי > כדי להפריד PAFs בסמיכות מרחבית.
    5. באמצעות עכבר המחשב, צייר אזור עניין (ROI) סביב התא, כפי שנקבע על-ידי התבוננות בתמונת שדה בהיר או על-ידי התבוננות באוטופלואורסצנטיות מפוזרת הקיימת באופן שווה בכל הציטופלסמה של התא.
      הערה: זה בדרך כלל בסדר להוציא תהליכים היקפיים דקים ולכלול את הגרעין כמו autofluorescence בדרך כלל לא קיים במקומות אלה ולכן לא ישבש את הניתוח.
    6. השתמש בניתוח > ניתוח חלקיקים (גודל: 0.1-אינסוף מיקרומטר; מעגליות: 0-1) עם סיכום מסומן.
      הערה: לאחר מכן ImageJ יפיק חלון פלט עם נתונים על החלקיקים באזור העניין, המאפשר טבלה של מספר PAF בכל תא. ניתן לשלב מולקולות פלואורסצנטיות אחרות עם PAF הדמיה. עם זאת, מכיוון ש-PAF הוא אות עמום יחסית, חשוב לוודא שפלואורופורים אחרים אינם מדממים לתוך תעלת PAF. בדרך כלל, ניתן לשלב פלואורופורים הקולטים 600+ ננומטר ופולטים 650+ ננומטר עם PAF הדמיה, כגון LipidSpot 610.

2. שימוש ב- FACS להעשרה למצב הפעלת NSC ב- NSCs מתורבתים המבוססים על אוטופלואורסנציה

  1. צור qNSCs ו- aNSCs כמתואר בסעיף 1.
  2. מיין תערובת של qNSCs חיים ו- aNSCs בהתבסס על autofluorescence.
    הערה: לדוגמה, פרוטוקול זה ידון כיצד להעשיר aNSCs או qNSCs במדגם שנוצר על ידי ערבוב qNSCs ו- aNSCs ביחס של 1:1.
    1. לפני טריפסיניזציה ומיון תאים, תייג את התאים המתקדמים דרך שלב S על ידי הוספת 10 μM 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU; אנלוג תימידין המשלב בתאים סינתזה DNA, כגון בשלב S של מחזור התא) למדיום תרבית התא למשך שעה אחת.
    2. טריפסיניזציה של qNSCs ו-aNSCs כפי שנדון בשלבים 1.1.8, השהה מחדש ב-0.5 מ"ל של מאגר FACS (טבלה 1) ולאחר מכן הנח על קרח.
      הערה: qNSCs נצמדים מאוד למנה. במפגש גבוה יחסית, qNSCs יכולים להיות מנותקים מכנית מהמנה. עם זאת, אם qNSCs נמצאים במפגש נמוך יחסית או שקשה להסיר אותם מהתבשיל באופן מכני על ידי פיפט, השתמש בטריפסין כדי להסיר אותם מהמנה.
      1. הסר את מדיום התרבית מ qNSCs ולהוסיף 0.25% טריפסין מספיק כדי לכסות את החלק התחתון של הצלחת (עבור1 ס" מ 2 קובטה הדמיה היטב, להשתמש ~ 150 μL), דגירה במשך 3 דקות ב 37 ° C.
      2. לאחר הדגירה, הרוו את תגובת הטריפסין על ידי הוספת מדיום המתאים לכל סוג תא השווה לנפח הטריפסין שנוסף. מנתקים באופן מכני תאים מהצלחת לפני איסוף וצנטריפוגה.
    3. באמצעות זרבובית ~130 מיקרומטר, נתחו qNSCs ו-aNSCs באמצעות ציטומטר זרימה או FACS עם תנאים אופטיים בהתבסס על יכולות המכשיר וזהו PAF כפי שמוצג באיור 1. לדוגמה, השתמש בלייזר 405 ננומטר כדי לעורר את הדגימה והשתמש במסנן 580-620 ננומטר לזיהוי.
    4. אסוף לפחות 10,000 qNSCs ו- aNSCs סינגלט בקובץ נתונים ולאחר מכן השתמש בהם כדי לתכנן שערים לאיסוף העשרה של qNSCs או aNSCs. לדוגמה, הגדר שערים לאיסוף 25% העליונים או 25% התחתונים של NSCs בהתבסס על עוצמת הפלואורסצנטיות האוטומטית במדגם המעורב aNSC:qNSC (1:1).
    5. לאחר קביעת שערים למיון סינגלים עם אוטופלואורסצנטיות בהירה או עמומה יותר כמתואר לעיל, מיין את התאים לבארות מצופות אש"ף, למינין מלאות בתווך aNSC (10,000 תאים לסמ"ק2, ראה שלב 1.1.3).
    6. לאחר FACS, לאפשר NSCs לשבת במשך 3 שעות באינקובטור. תקן את התאים על ידי טיפול בהם עם 4% paraformaldehyde מספיק כדי לכסות את החלק התחתון של הצלחת (עבור 1 ס"מ2 קובטת הדמיה היטב, להשתמש ~ 150 μL) במשך 15 דקות ב RT.
      הערה: כדי להמחיש EdU בתאים, הכי קל להשיג ערכה מסחרית לזיהוי EdU ולעקוב אחר הפרוטוקול המומלץ של היצרן.
    7. ראשית, לחדור את התאים על ידי טיפול עם 0.25% טריטון PBS במשך 15 דקות ב RT.
    8. לאחר מכן, טפל בתאים עם תמיסת צביעה EdU ב- RT למשך 30 דקות.
      הערה: ההרכב המדויק של תמיסת צביעת EdU ישתנה בהתאם למקור הריאגנטים, אך מורכב בערך ממאגר תגובה, תוסף חיץ תגובה, נחושת גופרתית ומולקולה מעובדת אלקין או אזיד. עיין בטבלת החומרים לקבלת ערכה מומלצת.
    9. לאחר הצביעה כדי לדמיין EdU, לשטוף את הדגימות 3 פעמים במשך 10 דקות עם PBS.

3. שימוש במיקרוסקופ מולטיפוטון לאיתור אוטופלואורסנציה של ערוץ 1 וערוץ 2 וביצוע FLIM על NSCs in vitro לזיהוי אוכלוסיות ומעברים של תאי NSC

הערה: לכל מיקרוסקופ יש תוכנה קניינית משלו; לכן, בצע את השלבים הבאים על ידי ביצוע פעולות מקבילות כדי להגדיר מיקרוסקופ מסוים. פרוטוקול זה יספק הוראות לעבודה בתצוגת ערבה.

  1. צור qNSCs ו- aNSCs כמתואר בסעיף 1.
  2. הגדר את המיקרוסקופ הרב-פוטוני להדמיית חיים פלואורסצנטית.
    1. השתמש בעדשת אובייקט עם הגדלה של 40x ומעלה (~ 1.15 NA).
    2. השתמש במיקרוסקופ רב-פוטוני עם המרכיבים הבאים, או שווה ערך: לייזר מהיר במיוחד, צינור מכפיל אור (PMT) בעל מעבר ארוך של 720 ננומטר, צינור פוטו-מכפיל פוספיד גליום ארסניד (GaAsP), אלקטרוניקה לספירת פוטונים בודדים בקורלציה בזמן ומד הספק אנלוגי.
    3. עבור הדמיה ערוץ 1, הגדר את הלייזר המתכוונן ל- 750 ננומטר והשתמש בקוביית מסנן פליטה של 440/80 ננומטר. עבור הדמיה ערוץ 2, הגדר את הלייזר ל- 890 ננומטר והשתמש בקוביית מסנן פליטה של 550/100 ננומטר.
      הערה: כבו את אורות החדר לפני שה-PMT נדלק.
  3. פונקציית תגובת מכשיר
    1. לכוד פונקציית תגובת מכשיר (IRF) על ידי הדמיה של גביש אוריאה כתוש כדי להסביר את התגובה הטמפורלית של המכשיר בדעיכה הנמדדת.
      הערה: IRF מפותל עם הדעיכה כדי לחשב במדויק את עקומת התאמת הדעיכה. לצורך רכישה, הלייזר מוגדר ל 890nm, ואת קוביית מסנן פליטה 440/80 ננומטר משמש. GaAsP PMT מוגדר על רווח של 800, ואת pockels (כוח לייזר) נקבעים נמוך מאוד בהתחלה, בדרך כלל 1.
    2. בחר שדה ראייה עם אוריאה גבישית והגדל מעט את הפוקלים (עד מקסימום של 15).
    3. לאחר מכן, רכוש תמונה באמצעות אותם פרמטרים המשמשים להדמיית תאים: מבחין שבר קבוע (CFD) 1 x 104 - 1 x 105, רזולוציה של 256 x 256, זמן שהייה שנקבע על 4.8 μs, זום אופטי מוגדר על 1.5x וזמן אינטגרציה של 60 שניות.
  4. ביצוע דימות פלואורסצנטי לכל החיים והדמיית עוצמה עבור אוטופלואורסצנטיות של ערוץ 1 וערוץ 2 על qNSCs חיים ו- aNSCs במבחנה
    1. מצא שדה ראייה לתמונה: השתמש באוקולרים כדי למצוא שדה ראייה מתאים ושנה את נתיב האור לדגימה במיקרוסקופ כדי לאפשר הדמיה.
      הערה: תמונה של ערוץ 1 תירכש תחילה, ואחריה תמונה של ערוץ 2 של אותו שדה ראייה.
    2. הגדרה לאיסוף תמונת ערוץ 1: לחץ על הכרטיסייה Power/Gain והגדר את הרווח ב- PMT ל- 800, לחץ על לשונית לייזר 2-P ובחר 750 ננומטר עבור הלייזר, וודא שנעשה שימוש בקוביית המסנן המתאימה (440/80 ננומטר).
    3. אסוף תמונה של ערוץ 1.
      1. הפעל את מצב תצוגה מקדימה על-ידי מעבר לכרטיסייה הפעלה/רווח והגדרת Pockels ל- 30, ולאחר מכן עבור למקטע סריקה במסך זה ולחיצה על סריקה חיה.
      2. הגדל את Pockels כדי למצוא שדה ראייה טוב בעוצמת לייזר נמוכה (מתחת 3.6 mW). לאחר מציאת שדה הראייה, כוונן את הפוקלים כך שמד הכוח יקרא ~ 3.6 mW על ההספק שאחרי תא הפוקל, ומפלה השברים הקבוע (CFD) בכרטיסייה שיעורי ספירה מודד 1 x 104 - 1 x 105.
    4. עבור אל המקטע סריקה ולחץ על סריקה יחידה לאחר עמידה בפרמטרים אלה. זה ירכוש תמונה של ערוץ 1 מעל 60 שניות.
    5. כדי לאסוף תמונת ערוץ 2, לחץ על לשונית לייזר 2-P ובחר 890 ננומטר עבור הלייזר, החלף את קוביית המסנן לקוביית הפליטה של ערוץ 2 (550/100 ננומטר).
    6. הפעל את מצב התצוגה המקדימה כמתואר ב- 3.4.3, הגדל את ה- Pockels עד שמד החשמל יקרא ~ 7 mW, וספירות CFD הן שוב 1 x 104 -1 x 105.
    7. עבור אל החלק סריקה ולחץ על סריקה יחידה ברגע שפרמטרים אלה מתקיימים. זה ירכוש תמונה של ערוץ 2 מעל 60 שניות.
    8. רכישת תמונות נוספות - לאחר רכישת תמונה של ערוץ 1 וערוץ 2, מצא שדה ראייה חדש וחזור על שלבים 3.4.2 - 3.4.4. בדרך כלל, איסוף 4-6 שדות ראייה לתמונה ~ 50-100 תאים מספיק לתנאי אחד בניסוי.
      הערה: ניתן להשתמש ב-mCherry כתווית פלואורסצנטית נוספת ללא גלישה לערוצי ערוץ 1 וערוץ 2.
  5. נתח את התמונות הפלואורסצנטיות לכל החיים.
    1. צור מטריצות דעיכה עבור תמונות פלואורסצנטיות לכל החיים ב- SPCImage לאחר שלבים 3.5.2-3.1.14.
      הערה: לקבלת מידע נוסף, עיין בספרי ההדרכה המעודכנים הזמינים באופן חופשי באינטרנט26.
    2. פתח את SPCImage ופתח את תמונת IRF FLIM שנאספה בסעיף 3.3.
    3. התאם את הפסים השחורים האנכיים בהיסטוגרמה כך שיהיו מוגבלים לעקומת הדעיכה של IRF. בשורת התפריטים העליונה, לחץ על IRF > העתק ללוח.
    4. פתח קובץ תמונה FLIM בתוך ערכת הנתונים לניתוח, המתקבלת בסעיף 3.4.
    5. בשורת התפריטים העליונה, לחץ על IRF > הדבק מהלוח.
    6. בפינה השמאלית התחתונה של התוכנה, הגדר את רכיבים לערך 2.
    7. בשורת התפריטים העליונה של התוכנה, לחץ על אפשרויות > דגם. לאחר מכן בחר MLE עבור שיטת התאמה, איגוד מרחבי לריבוע, סף לשיא, ותחת הגדרות, בחר דעיכה רב-מעריכית.
    8. בפינה השמאלית התחתונה של התוכנה, הגדל את הסל עד שספירת הפוטון תהיה לפחות 100 בפיקסלים ציטופלזמיים מייצגים בשיא ספירת הפוטון מיד לאחר העירור.
    9. בפינה השמאלית התחתונה של התוכנה, הגדר את הסף. עבור ערוץ 1 השתמש בסף של "50". עבור ערוץ 2, השתמש בסף של "0".
    10. בשורת התפריטים העליונה של התוכנה (פרוטוקול זה מתאר כיצד להפעיל את גרסה 8.3), לחץ על חישוב > Decay Matrix.
      הערה: ודא שערכי Chi2 הם ~0.8-1.2 בכל התמונה. זה מאשר כי הנתונים יהיו חזקים על ידי אימות מודלים דו-מעריכיים של דעיכה.
    11. בשורת התפריטים העליונה, לחץ על קובץ > שמור.
    12. בשורת התפריטים העליונה של התוכנה, לחץ על File > Export, וייצא את הפריטים הבאים:
      ערך מקודד בצבע, T1, T2, Chi2, עוצמות פיקסלים, A1 [%], A2 [%] ותמונה מקודדת בצבע (עם מקרא)
      הערה: כעת SPCImage מוגדר לבצע תהליך אצווה, ניתוח כל התמונות של ערוץ נתון (נתח תמונות FLIM של ערוץ 1 יחד ולאחר מכן חזור על כך החל משלב 3.5.2 עבור תמונות FLIM של ערוץ 2).
    13. כדי לבצע תהליך אצווה, לחץ על חישוב עיבוד אצווה > ובחר את תמונות FLIM לעיבוד.
    14. בשורת התפריטים העליונה, לחץ על File > Export > Batch Export ובחר את מטריצות הדעיכה לייצוא (שנוצרו בשלב הקודם).
    15. השתמש ב- CellProfiler ליצירת מסיכות ציטופלזמיות לפי שלבים 3.5.16-3.5.24.
      הערה: לשם כך, גרעינים יהיו באופן ידני סביב תמונות בעוצמה של ערוץ 1, כאשר הגרעין שחור ונראה בבירור. לאחר מכן, צינור CellProfiler manual_segmentation.cpproj27 (קובץ משלים 1) יפיק באופן אוטומטי תא שלם ומסיכה ציטופלזמית, לפי הוראות המסכה הגרעינית. לחלופין, ניתן לסמן גרעינים ב-mCherry ולצלם אותם לצד האוטופלואורסצנטיות של ערוץ 1 וערוץ 2 כדי לספק את היכולת להפוך את זיהוי הגרעינים לאוטומטי. צבעים גרעיניים קונבנציונליים רבים, לעומת זאת, ידממו באופן ספקטרלי לתוך התעלות האוטופלואורסצנטיות ולכן אינם תואמים לטכניקה זו.
    16. ב- R Studio, השתמש ב- R_ASCtoTIFF.rmd27 (קובץ משלים 2) כדי להמיר את קובצי X_photons.asc , כאשר X הוא שם התמונה שנרכשה מערכת התמונות של ערוץ 1 לקובצי TIF.
    17. פתח את Cell Profiler ופתח את manual_segmentation.cpproj.
    18. טען ב- TIFs פוטון ערוץ 1 שנוצרו בשלב 3.5.16 בשלב התמונות בחלק העליון של הצינור.
    19. בשלושת השלבים התחתונים בצינור שכותרתו SaveImages, הגדר נתיב שמירה עבור המסכות ש- CellProfiler ייצר.
    20. לחץ על התחל מצב בדיקה בפינה השמאלית התחתונה של CellProfiler.
    21. לחץ על הפעל בפינה השמאלית התחתונה של CellProfiler. כאשר CellProfiler יגיע לשלב IdentifyObjectsManually , יופיע חלון המציג את תמונת ערוץ 1 הנוכחית המעובדת.
    22. לחץ על מקש F בלוח המקשים ולאחר מכן צייר באופן ידני עקבות של גרעיני תא אחד תוך החזקת לחצן העכבר השמאלי לחוץ. לאחר מעקב אחר גרעינים, שחרר את לחצן הלחיצה השמאלית על העכבר. חזור על שלב זה עבור כל התאים בתמונה.
    23. לחץ על בוצע בפינה השמאלית התחתונה של החלון הנפתח עם תמונת העוצמה. התוכנה תסיים כעת את הצינור ותיצא מסכות ציטופלזמיות, גרעיניות וטוטאליות של תאים.
    24. בפינה השמאלית התחתונה, לחץ על Next Image Set וחזור על שלבים 3.5.21-3.5.23 עבור כל התמונות של ערוץ 1 TIF.
    25. השתמש בסקריפט R (שילוב מטריצות דעיכה ומסכות ציטופלזמיות.rmd) כדי לשלב מטריצות דעיכה שנוצרו בשלבים 3.5.2-3.5.14 ומסיכות ציטופלזמיות שנוצרו בשלבים 3.5.15-3.5.24 כדי לקבל משתני הדמיה פלואורסצנטיים ממוצעים לכל החיים עבור הציטופלסמה של כל תא על-ידי ביצוע שלבים 3.5.26-3.5.30
    26. באמצעות גיליון אלקטרוני (לדוגמה, Microsoft Excel), צור מסמך .csv בשם test_key27 [קובץ משלים 3] [קובץ משלים 3] לדוגמה) עם 3 עמודות.
    27. תן כותרת לעמודות כתיקיה, NADH ו - FAD. מלא את הטבלה כדי לרשום את מיקום התיקיה בתיקיה, ולאחר מכן קידומת כותרת תמונה ב- NADH וב - FAD, בהתאמה, כדי לקשר כל תמונה של ערוץ 1 לכל תמונה של ערוץ 2 (ראה נתונים לדוגמה - טבלה 2).
  6. ב-R Studio, פתח את שלב מטריצות ריקבון ומסכות ציטופלזמיות.rmd27(קובץ משלים 4).
    1. קבעו את נתיבי הקבצים הבאים כמבוארים בסקריפט: Set Working Directory, Channel 1 file location, FAD file location, mask file location and output file location and name.
    2. הפעל את הסקריפט כולו. עם סיום מוצלח של הסקריפט, ייווצר קובץ פלט, כולל מטא נתונים ומשתני FLIM ממוצעים.
    3. בצע את הניתוח באמצעות autofluorescence FLIM data.rmd27 (קובץ משלים 5) או באמצעות כל תוכנת ניתוח אחרת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הדמיה אוטופלואורסצנטית קונפוקלית להפרדת מצב תאי NSC (איור 1)
כדי להשתמש במיקרוסקופ קונפוקלי כדי לפתור את מצב ההפעלה של NSC, qNSCs ו- aNSCs נוצרו במבחנה באמצעות מדיום הפעלה או מדיום שקט, כפי שתואר קודם לכן 10,13,17,18. כדי לזהות PAF ב-NSCs, qNSCs חיים ו-aNSCs צולמו באמצעות אותה חשיפה במיקרוסקופ קונפוקלי (לדוגמה: 405 ננומטר, Em: 580-620 נ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מתאר טכניקת רזולוציה חד-תאית חיה, נטולת תוויות, לא הרסנית, המאפשרת סיווג של מצב תאי NSC במבחנה באמצעות הדמיה של אותות אוטופלואורסצנטיים בתאי גזע עצביים. גישה זו מזהה שינויים מטבוליים המתרחשים במהלך יציאת השקט של המל"ל, המשפיעים על התכונות האופטיות של גורמים משלימים מטבוליים, כגון NAD(P)H, ומציעה יתרונות רבים על פני טכנולוגיות קיימות לחקר השקט של המל"ל. לדוגמה, טכניקות קונבנציונליות רבות לחקר qNSCs ו- aNSCs, כגון תיוג עם סמני מחזור התא כמו EdU, דורשות קיבוע של דגימות....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

תודות

אנו מודים לליבת ציטומטריית הזרימה של UW-Madison (P30 CA014520 ו- 1S10RR025483-01), ולחברי מעבדת מור וקהילת UW-Madison על תרומתם. אנו מודים למקורות המימון שלנו: NIH T32 T32GM008688 (ל- C.S.M.), מלגת דיאנה ג'ייקובס קלמן מ- AFAR (ל- C.S.M.), מלגת בוגר ויסקונסין (ל- C.S.M.), DP2 NIH New Innovator Award (1DP2OD025783, ל- D.L.M.), Vallee Scholar Award (ל- D.L.M.), NIH 1R56NS130450 (ל- D.L.M ו- M.C.S.), R01 CA185747 (ל-M.C.S.), R01 CA205101 (ל-M.C.S.), R01 CA211082 (ל-M.C.S.), ומענק הקרן הלאומית למדע מס' CBET-1642287 (ל- M.C.S).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
עדשת אובייקט מים 40xעדשת אובייקטיבית NikonMRD77410בשימוש במיקרוסקופ רב-פוטוני בחלק 3
8 באר קובטהIbidi80826-90להדמיית aNSCs/qNSCs
מד כוח אנלוגיThorlabsPM100Aמשמש במיקרוסקופ מולטיפוטון בחלק 3
אנטיביוטיקה-אנטימיקוטית (100X) (PSF)תרמו פישר15240062אנטיביוטיקה למדיה NSC
B-27Invitrogen17504044תוסף תזונה למדיה
NSC BMP4Fisher Scientific5020BP010גורם להשראת שקט
אלבומין סרום בקרסיגמאA4919-25GBMP4
Chameleonבשימוש במיקרוסקופ מולטיפוטון בחלק 3
מיקרוסקופקונפוקלימיקרוסקופ C2 של Nikonהמשמש לחלק 1
DMEM/F-12 (ללא GlutaMAX)Invitrogen11320033עבור NSCs
DNAseSigmaD5025-15KUנוסף למעכב טריפסין
ערכת בדיקת EdUInvitrogenC10337בדיקת התפשטות לתרבית תאים
EGFPeproTechAF-100-15-500UGגורם גדילה למדיית NSC
FGFPeproTech100-18Bגורם גדילה למדיה NSC
ממיין תאים מופעל פלואורסצנטיBDFACSAriaממיין תאים מופעל פלואורסצנטי המשמש לחלק 2
HeparinSigmaH3149-50KUלמדיה
NSC L-15Invitrogen21083027להכנת תמיסת מעכב טריפסין
LamininSigmaL2020-1MGלציפוי כלי זכוכית
Nikon TiE מיקרוסקופ הפוךNikonN/Aמסגרת מיקרוסקופ המשמשת לחלק 3
PLOSigmaP3655-100MGלציפוי כלי זכוכית
SPC-150 אלקטרוניקה לספירת פוטונים בודדיםבקר והיקלN/Aמשמש במיקרוסקופ מולטיפוטון בחלק 3
טריפסין (לניסיון כדורים של aNSCs שגדלו ככדורים או חד-שכבתיים)Gibco15090046לטריפסיניזציה של נוירוספרות או aNSCs דבקים
טריפסין (לטריפסיניזציה של qNSCs)Gibco25200072לניסיון qNSCs דבקים
מעכב טריפסיןSigmaT6522-100MGלעיכוב טריפסיניזציה של
גבישי אוריאהSigmaU5128-5Gהמשמש לאיסוף IRF
VerseneThermo Fisher15040066להכנת טריפסין
להכנת לייזר קוהרנטי מדיית בסיס תוסף

מקורות

  1. Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. Adult neurogenesis in the hippocampus: From stem cells to behavior. Cell. 167 (4), 897-914 (2016).
  2. Kuhn, H. G., Dickinson-Anson, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. J Neurosci. 16 (6), 2027-2033 (1996).
  3. Silva-Vargas, V., Maldonado-Soto, A. R., Mizrak, D., Codega, P., Doetsch, F. Age-dependent niche signals from the choroid plexus regulate adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 19 (5), 643-652 (2016).
  4. Urban, N., Blomfield, I. M., Guillemot, F. Quiescence of adult mammalian neural stem cells: A highly regulated rest. Neuron. 104 (5), 834-848 (2019).
  5. Urban, N., et al. Return to quiescence of mouse neural stem cells by degradation of a proactivation protein. Science. 353 (6296), 292-295 (2016).
  6. Kalamakis, G., et al. Quiescence modulates stem cell maintenance and regenerative capacity in the aging brain. Cell. 176 (6), 1407-1419 (2019).
  7. Walsh, A. J., et al. Classification of T-cell activation via autofluorescence lifetime imaging. Nat Biomed Eng. 5 (1), 77-88 (2021).
  8. Sagar, M. A. K., et al. Microglia activation visualization via fluorescence lifetime imaging microscopy of intrinsically fluorescent metabolic cofactors. Neurophotonics. 7 (3), 035003(2020).
  9. Knobloch, M., et al. Metabolic control of adult neural stem cell activity by Fasn-dependent lipogenesis. Nature. 493 (7431), 226-230 (2013).
  10. Knobloch, M., et al. A fatty acid oxidation-dependent metabolic shift regulates adult neural stem cell activity. Cell Rep. 20 (9), 2144-2155 (2017).
  11. Knobloch, M., et al. SPOT14-positive neural stem/progenitor cells in the hippocampus respond dynamically to neurogenic regulators. Stem Cell Reports. 3 (5), 735-742 (2014).
  12. Shin, J., et al. Single-cell RNA-Seq with waterfall reveals molecular cascades underlying adult neurogenesis. Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).
  13. Leeman, D. S., et al. Lysosome activation clears aggregates and enhances quiescent neural stem cell activation during aging. Science. 359 (6381), 1277-1283 (2018).
  14. Beckervordersandforth, R. Mitochondrial metabolism-mediated regulation of adult neurogenesis. Brain Plast. 3 (1), 73-87 (2017).
  15. Morrow, C. S., et al. Autofluorescence is a biomarker of neural stem cell activation state. Cell Stem Cell. , (2024).
  16. Kolenc, O. I., Quinn, K. P. Evaluating cell metabolism through autofluorescence imaging of NAD(P)H and FAD. Antioxid Redox Signal. 30 (6), 875-889 (2019).
  17. Mira, H., et al. Signaling through BMPR-IA regulates quiescence and long-term activity of neural stem cells in the adult hippocampus. Cell Stem Cell. 7 (1), 78-89 (2010).
  18. Morrow, C. S., et al. Vimentin coordinates protein turnover at the aggresome during neural stem cell quiescence exit. Cell Stem Cell. 26 (4), 558-568 (2020).
  19. Martynoga, B., et al. Epigenomic enhancer annotation reveals a key role for NFIX in neural stem cell quiescence. Genes Dev. 27 (16), 1769-1786 (2013).
  20. Bin Imtiaz, M. K., Jessberger, S. Isolation of adult mouse hippocampal neural stem cells for fluorescence loss in photobleaching assays. STAR Protoc. 2 (3), 100695(2021).
  21. Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nat Protoc. 7 (11), 2005-2012 (2012).
  22. Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Johnson, M. L. Fluorescence lifetime imaging of free and protein-bound NADH. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (4), 1271-1275 (1992).
  23. Blacker, T. S., Duchen, M. R. Investigating mitochondrial redox state using NADH and NADPH autofluorescence. Free Radic Biol Med. 100, 53-65 (2016).
  24. Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications. J Biomed Opt. 25 (7), 1-43 (2020).
  25. ImageJ. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/ (2021).
  26. Becker & Hichl Handbooks. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/ (2024).
  27. GitHub Materials. , Available from: https://github.com/chrismorrow5/Neural-Stem-Cell-Autofluorescence-Analysis/ (2024).
  28. Codega, P., et al. Prospective identification and purification of quiescent adult neural stem cells from their in vivo niche. Neuron. 82 (3), 545-559 (2014).
  29. Llorens-Bobadilla, E., et al. Single-cell transcriptomics reveals a population of dormant neural stem cells that become activated upon brain injury. Cell Stem Cell. 17 (3), 329-340 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

תאי גזע עצבייםהפעלת NSCנוירוגנזה בבגרותשקיקה של NSCדימוי אוטופלואורסצנציהמיקרוסקופיה קונפוקליתציטומטריה של זרימהדימוי זמן חיים של פלואורסצנציהסיווג מצבי תאאנליזה של תאים חיים
סיווג מצב הפעלת תאי גזע עצביים במבחנה באמצעות אוטופלואורסנציה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.