מאמר שיטה

כימות של פרמטרי כלי דם ברשתיות הר שלמות של עכברים עם רטינופתיות שאינן מתרבות ושגשוגות

DOI:

10.3791/63126

⸱

12 במרץ 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Departamento de Bioquímica Clínica, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Córdoba, 2Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología (CIBICI), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), 3Vitreo-retinal Department, Centro Privado de Ojos Romagosa-Fundación VER, 4Unidad de Investigación y Desarrollo en Tecnología Farmacéutica (UNITEFA), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET)

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מתאר בדיקת כתמי לציטין מבוססת וניתן לשחזור עבור כל ההכנות לרשתית ההר ואת הפרוטוקולים הנדרשים למדידה כמותית של פרמטרים וסקולריים משתנים לעתים קרובות ברטינופתיות שגשוג ולא מתרבות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רטינופתיות הן קבוצה הטרוגנית של מחלות המשפיעות על הרקמה הנוירו-חושית של העין. הם מאופיינים על ידי ניוון עצבי, גליוזיס ושינוי הדרגתי בתפקוד כלי הדם ובמבנה. למרות תחילת הרטינופתיות מאופיינת בהפרעות עדינות בתפיסה החזותית, השינויים בקליעת כלי הדם הם הסימנים הראשונים שזוהו על ידי קלינאים. היעדר או נוכחות של ניאווסקולריזציה קובע אם הרטינופתיה מסווגת כלא-התפשטות (NPDR) או להתרבות (PDR). במובן זה, מספר מודלים של בעלי חיים ניסו לחקות תכונות כלי דם ספציפיות של כל שלב כדי לקבוע את המנגנונים הבסיסיים המעורבים בשינויים אנדותל, מוות עצבי ואירועים אחרים המתרחשים ברשתית. במאמר זה, אנו נספק תיאור מלא של ההליכים הנדרשים למדידת הפרמטרים של כלי הדם ברשתית אצל מבוגרים ועכברי לידה מוקדמת ביום שלאחר הלידה (P)17. אנו נפרט את הפרוטוקולים לביצוע כתמי כלי דם ברשתית עם Isolectin GSA-IB4 בהרים שלמים להדמיה מיקרוסקופית מאוחרת יותר. צעדים מרכזיים לעיבוד תמונה עם תוכנת Image J Fiji מסופקים גם הם, ולכן, הקוראים יוכלו למדוד את צפיפות כלי הדם, הקוטר והטורטואוזיות, הסתעפות כלי הדם, כמו גם אזורים וסקולריים וניאווסקולריים. כלים אלה מועילים מאוד כדי להעריך ולכמת שינויים בכלי הדם הן רטינופתיות שאינן מתרבות והן התפשטות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העיניים ניזונות משני מערכת עורקים-ורידים: כלי הדם הכורואידיים, רשת כלי דם חיצונית המשקה אפיתל פיגמנטי ברשתית ופוטותרפטורים; ואת כלי הדם הנוירו-רשתיים המשקים את שכבת תאי הגנגליון ואת השכבה הגרעינית הפנימית של הרשתית1. כלי הדם ברשתית היא רשת מאורגנת של כלי שיט המספקים חומרים מזינים וחמצן לתאי הרשתית ומוצרי פסולת קציר כדי להבטיח העברת איתות חזותית נכונה. כלי דם זה יש כמה תכונות ברורות, כולל: חוסר innervation אוטונומי, הרגולציה של טון כלי הדם על ידי מנגנוני רשתית פנימית והחזקת מחסום דם רשתית מורכב2. לכן, כלי דם ברשתית היה המוקד של חוקרים רבים אשר חקרו בהרחבה לא רק vasculogenesis במהלך הפיתוח, אלא גם את השינויים ואת אנגיוגנזה פתולוגית כי כלי אלה עוברים במחלות3. השינויים הסקולריים הנפוצים ביותר שנצפו ברטינופתיות הם הרחבת כלי דם, ניאווסקולריזציה, אובדן ארבוריזציה וסקולרית ועיוות של כלי הדם הראשיים ברשתית, מה שהופך אותם יותר זיגאגי4,5,6. אחד או יותר מהשינויים המתוארים הם הסימנים המוקדמים ביותר שזוהו על ידי רופאים. הדמיה וסקולרית מספקת שיטת סינון מהירה, לא פולשנית וזולה7. המחקר הנרחב של השינויים שנצפו בעץ כלי הדם יקבע אם הרטינופתיה אינה מתרבה או מתרבה והטיפול הנוסף. רטינופתיות שאינן מתרבות יכולות להתבטא עם מורפולוגיה כלי דם חריגה, ירידה בצפיפות כלי הדם, נימים תאיים, מוות pericytes, בצקת מקולרית, בין היתר. בנוסף, רטינופתיות שגשוג גם לפתח חדירות כלי דם מוגברת, שיפוץ חוץ תאי, ואת היווצרות של tufts כלי דם לכיוון חלל הזגוגית כי בקלות התמוטטות או לגרום ניתוק רשתית8.

לאחר שזוהה, ניתן לעקוב אחר רטינופתיה באמצעות שינויי כלי הדם שלה9,10. התקדמות הפתולוגיה ניתן לעקוב אחר שינויים מבניים של כלי הדם, אשר מגדירים בבירור את שלבי המחלה11. הכימות של שינויים בכלי הדם במודלים אלה אפשר לתאם שינויים בכלי הדם ומוות עצבי ולבדוק טיפולים תרופתיים לחולים בשלבים שונים של המחלה.

לאור ההצהרות לעיל, אנו רואים כי ההכרה והכימות של שינויים בכלי הדם הם בסיסיים במחקרי רטינופתיה. בעבודה זו, נראה כיצד למדוד פרמטרים שונים של כלי הדם. כדי לעשות זאת, נשתמש בשני מודלים של בעלי חיים. אחד מהם הוא מודל העכבר רטינופתיה המושרה חמצן12, אשר מחקה רטינופתיה של פגות וכמה היבטים של רטינופתיה סוכרתית מתרבה13,14. במודל זה, נמדוד אזורים וסקולריים, אזורים ניאו-וסקולריים והרחבה וטורטואוזיות של כלי הדם העיקריים. במעבדה שלנו, פותח מודל עכבר תסמונת מטבולית (MetS), אשר גורם רטינופתיה לא שגשוג15. כאן, נעריך את צפיפות כלי הדם ואת ההסתעפות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עכברי C57BL/6J טופלו על פי הנחיות של הצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה. הליכי הניסוי תוכננו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (CICUAL) של הפקולטה למדעי הכימיה, האוניברסיטה הלאומית של קורדובה (מיל' HCD 1216/18).

1. הכנת פתרונות חוצצים ורגנטים

  1. הכנת תמיסת מלח חוצצת פוספט 1x (PBS): הוסף 8 גרם של נתרן כלורי (NaCl), 0.2 גרם של אשלגן כלורי (KCl), 14.4 גרם של דיהידראט דיסודיום-מימן-פוספט (Na2HPO4 2H2O) ו 0.24 גרם של אשלגן-דיהידרוגן פוספט (KH2PO4) עד 800 מ"ל של מים מזוקקים. מערבבים את התמיסה עד לפירוק מלא של המלחים. כווננו את ה-pH ל-7.4 עם חומצת כלוריד (HCl) והתאמו את עוצמת הקול ל-1 ליטר עם מים מזוקקים נוספים. סנן את הפתרון ואחסן אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  2. הכנה של 4% paraformaldehyde (PFA): להוסיף 40 גרם של PFA מוצק ל 800 מ"ל של PBS מוכן טרי. מערבבים את התמיסה בצלחת חימום בטמפרטורה קבועה של 60 °C (60 °F). הוסף 1 M נתרן הידרוקסיד (NaOH) עד PFA מומס לחלוטין, בדיקה כי ה- pH נשמר בטווח של 7.2-7.4. מלאו את עוצמת הקול ל-1,000 מ"ל עם PBS וערבבו. כבה את צלחת החימום וסנן את הפתרון כאשר הטמפרטורה שלו היא מתחת ל -35 מעלות צלזיוס. יש לאחסן את הפתרון בטמפרטורה של 4 °C °C (4 °F) למשך עד 3 ימים.
    אזהרה: PFA מזיק אם נבלע או אם בשאיפה והוא כנראה תרכובת מוטגנית. השתמשו בכפפות ומסכת פנים לאורך כל התהליך ועבדו בתא בטיחות.
  3. הכנת תמיסת מלח 1x טריס-חוצץ (TBS): להוסיף 6.1 גרם של טריס ו 9 גרם של NaCl ל 800 מ"ל של מים מזוקקים. מערבבים את התמיסה עד לפירוק מלא של המלחים. כווננו את רמת החומציות ל-7.4 עם HCl והתאמו את עוצמת הקול ל-1 ליטר עם מים מזוקקים נוספים. סנן את הפתרון ואחסן אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  4. הכנת TBS- 0.1% טריטון X-100: הוסף 0.1 מ"ל של TritonX-100 עד 100 מ"ל של TBS. יש לערבב בעדינות ולאחסן אותו בטמפרטורה של 4 °C (60 °F) למשך עד שבוע אחד.
    הערה: כמו טריטון הוא חומר ניקוי צפוף מאוד, לחתוך מעט את המסוף של הקצה עבור צינורות טובים יותר.
  5. הכנה של TBS-5%-Bovine סרום אלבומין (BSA) -0.1% טריטון-X-100: לשקול 5 גרם של BSA ולהוסיף TBS- 0.1% טריטון X-100 פתרון עד נפח סופי של 100 מ"ל. מערבבים בעדינות. Aliquot ולאחסן ב -20 °C (50 °F) עד 2 חודשים.
  6. איזולקטין GSA-IB4 Alexa fluor-488 מצומד (Isolectin GSA-IB4): משקל 36.75 מ"ג סידן כלוריד דיהידרט (CaCl2·2H2O) והוסף אותו ל-500 מ"ל של PBS טרי. מערבבים את התמיסה עם מוט ערבוב. Pipette 500 μL של הפתרון של CaCl2/PBS ולהוסיף אותו בקבוקון המכיל 500 מיקרוגרם של אבקת איזולקטין GSA-IB4 ליופיליזציה. מערבבים בעדינות ומערבבים את התמיסה בצינורות של 0.5 מ"ל. יש לאחסן אותם בטמפרטורה של 20 °C (60 °F) מוגנים מפני אור.
  7. פולי(ויניל אלכוהול) בגליצרול/טריס: שקול 2.4 גרם פולי (אלכוהול ויניל), להוסיף 6 גרם של גליצרול ומערבבים בעדינות. לאחר מכן, מוסיפים 6 מ"ל של מים וממשיכים לערבב במשך כמה שעות בטמפרטורת החדר. יש להוסיף 12 מ"ל של תמיסת 0.2 מ' טריס שחוממה מראש (pH: 8.5) ולחמם בטמפרטורה קבועה של 50 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולערבב מדי פעם. לבסוף, צנטריפוגה הפתרון ב 5,000 x g במשך 15 דקות להבהרה.
    הערה: תן את הפתרון להתקרר בטמפרטורת החדר, aliquot אותו ולאחסן אותו ב -20 °C (60 °F).

2. כתמי לציטין פלואורסצנטיים

  1. על עגלים להקריב על ידי פחמן דו חמצני (CO2) שאיפה, לפתות את העיניים עם מספריים16. תקן את העיניים המובחרות עם 4% PFA טרי מוכן למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר (RT).
    הערה: קיבעון יכול להתבצע גם על ידי דגירה של העיניים ב 4% PFA לילה (ON) ב 4 °C (60 °F). עכברים הוקרבו על פי הנחיות הצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וחזון והוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (CICUAL) של הפקולטה למדעי הכימיה, האוניברסיטה הלאומית של קורדובה (מיל' HCD 1216/18).
  2. תחת המיקרוסקופ המנתח, להסיר את הקרניות עם מספריים על ידי חיתוך לאורך הלימבוס ולנתח את הרשתיות כולה. השלך את המקטע הקדמי של העין ולאחר מכן הפרד את הרשתית מה- RPE-Choroid.
    הערה: הקפד להסיר את שאר הפסולת וכלי היאלויד מהרשתית עם מלקחיים.
  3. מניחים את הרשתיות ב 200 צינורות μL. לאחר מכן, לחסום ולחלחל את הרשתיות ב 100 μL של תמיסת מלח חוצץ Tris (TBS) פתרון המכיל 5% בקר סרום אלבומין (BSA) ו 0.1% טריטון-X-100 במהלך 6 שעות ב 4 °C עם תסיסה עדינה בשייקר.
    הערה: ניתן לבצע שלב זה במשך 2 שעות ב- RT.
  4. לאחר מכן, הפוך את הצינור כדי למקם את הרשתית בכובע ולהסיר את פתרון החסימה עם פיפטה.
  5. הוסף 100 μL של הפתרון המכיל 0.01 מיקרוגרם / μL של Isolectin GSA-IB4 (GSA-IB4). לעטוף את הצינורות עם רדיד אלומיניום כדי להגן על הדגימות מפני אור. לדגור את הרשתיות עם פתרון לציטין על ב 4 °C (50 °F) או עבור 2 שעות ב RT עם תסיסה עדינה בשייקר.
  6. לשטוף את הרשתית עם 100 μL של TBS המכיל 0.1% טריטון-X-100 במשך 20 דקות עם תסיסה עדינה בשייקר. לכביסה נכונה, מניחים את הרשתית בכובע הצינור על ידי היפוךו. להחזיר את הצינור למצב העמידה שלה ולהסיר את המדיום שנותר במיכל. חזור על שלב זה שלוש פעמים.
  7. מניחים את הרשתית בשקופית ומוסיפים טיפה של PBS. תחת המיקרוסקופ המנתח, בצע ארבעה חתכים רחוקים באותה מידה משולי הרשתית לכיוון עצב הראייה.
  8. כדי לפתוח את עלי הכותרת של הרשתית, השתמש מלקחיים או חתיכות קטנות של נייר מסנן. ודא שצד קולטן האור פונה כלפי מטה.
  9. הסר את ה- PBS הנותר של השקופית עם נייר סינון. לאחר מכן, מוסיפים מדיום הרכבה (פולי (אלכוהול ויניל) בגליצרול / טריס) וכיסוי. תן לו להתייבש במשך 1 שעות ב RT.
  10. אחסן שקופיות בטמפרטורה של 4 °C °C (60 °F) מוגנות מפני אור.
    הערה: ניתן לאחסן את הרשתיות גם ב- PBS בטמפרטורה של 4 °C (4 °F) עד הדמיה מיקרוסקופית קונפוקלית.

3. הדמיה מיקרוסקופית קונפוקלית ורכישת מיקרופוטוגרפיה

  1. לפני הדמיה, לדגור על השקופיות במשך 10 דקות ב RT מכוסה מאור.
  2. במיקרוסקופ הקונפוקלי, מקם את השקופית בצלחת עם הפנים כלפי מטה.
  3. למקד את מקלעת מעולה של כלי הרשתית ולבחור אזור כדי להתחיל את רכישת התמונה.
  4. הגדר פרמטרי לייזר כלליים בתוכנה: אורך גל: 488 ננומטר; עוצמת לייזר; ח"ו; היסט; לקבל.
    הערה: עוצמת הלייזר, PMT, היסט ורווח עשויים להשתנות בהתאם לתנאים ולשימוש במנורה. ההגדרות האופטימליות מספקות תמונה ברורה של כלי הדם הימנעות הרוויה ברגישות של צינור photomultiplier יש קשר ליניארי עם אות פלואורסצנטיות.
  5. הגדר פרמטרי רכישה אחרים: מצב; גודל; אובייקטיבי, ללא זום; אין קלמן; גודל צעד.
    הערה: יש להשתמש בתנאי רכישה זהים להדמיית השליטה ודגימות ניסיוניות.
  6. הגדרת הקואורדינטות בציר x ו- y: סרוק את הרשתית במוקד 2x. אם האזור מציג כלי שיט, בחר אותו על-ידי לחיצה כפולה על השטח כדי לסמן אותו לרכישת תמונה מאוחרת יותר.
    הערה: מומלץ מאוד לבחור אזור רשתית על ידי ביצוע מקלעת כלי הדם מעולה כמו פלואורסצנטיות של כלי גדול יותר הוא גבוה יותר.
  7. מעבר ברשת לריבוע שכן, מיקוד הרשתית ובחר את האזור אם הוא מתאים. חזור על שלב זה עד שהאזור שנבחר יכלול את הרשתית כולה.
  8. בחר אזור אחד והגדר את הקואורדינטות בציר z כדי להגדיר את מידת העובי לסריקה. לשם כך, דמיין את הרשתית במוקד 2x; עם המיקרומטר, עבור לראש הרשתית ולחץ על הגדר במיקום התחל. לאחר מכן, עבור לתחתית הרשתית ולחץ על הגדר במיקום הקצה.
  9. חזור על שלב 3.8 בכל אזור שנבחר ברשת.
    הערה: כדי לאמת את האזור הסרוק לעומק, הקש Go במיקום התחל. אם כלי הדם עדיין דמיינו, התאם מחדש את המיקום על-ידי הזזת המיקרומטר ולאחר מכן לחץ על Set. חזור על התהליך במיקום הקצה.
  10. אתחל סריקה אוטומטית.
  11. לאחר סיום תהליך הסריקה, פתח את התמונה.
  12. בחר בתבנית סידרה כדי להקליט את התמונה כפסיפס ולשמור אותה עם ההרחבה המועדפת. לבסוף, התמונה התפורה תוצג על המסך.

4. עיבוד תמונה

  1. בתוכנת ImageJ FIJI, עבור לשורת התפריטים ולחץ על קובץ > פתח. בחר את התמונה לעיבוד. בחלון 'אפשרויות ייבוא של תבניות ביולוגיות' , בחרו במטה-נתונים של Display OME-XML ולחצו על הלחצן 'אשר'.
    הערה: יש לשמור תמונות עם שם דומה בתיקיות נפרדות.
  2. בחלון המטה-נתונים של OME , חפשו את מידע גודל הפיקסלים, הנקרא PhysicalSizeX, PhysicalSizeY ו-PhysicalSizeZ. העתק נתונים אלה.
  3. לכיול תמונה, עברו לשורת התפריטים ובחרו 'מאפייני > תמונה'. העתק את פרטי התמונה בשלב 4.2 ולחץ על אישור. התמונה נפתחת כחלון עם מספר תמונות, כאשר כל אחת מהן מייצגת את המיקרופוטוגרפיות שנרכשו בציר z.
  4. הקצו לוץ מועדף לתמונה כדי להעביר צבע לתווית הפלואורסצנט. לשם כך, עבור אל שורת התפריטים ולחץ על סמל LUT .
  5. להצגה חזותית של כל הערימות בתמונה אחת, עבור/י לשורת התפריטים ובחר /י ״תמונה > ערימות > Z Project״.
  6. בחלון הקרנת Z המוצג, בחר את כל הערימות שבהן מוצגים כלי שיט. בסוג הקרנה, בחרו ' עוצמה ממוצעת' ולחצו על הלחצן 'אשר'.
    הערה: התוצאה של סכום הערימות תוצג בתמונה חדשה בשם AVG (שם תמונה).
  7. התאם את הבהירות והניגודיות בתמונה המתקבלת כדי להפחית את כלי הרקע וההדגשה. עבור לשורת התפריטים ולחץ על תמונה> התאמה> בהירות/ניגודיות. בחלונות B ו- C להזיז את הסורגים עד עוצמה טובה יותר הוא ציין. לחץ על החל ושמור את השינויים.
  8. העתק את הפרמטרים שנבחרו עבור בהירות/חדות; אלה חייבים להיות זהים עבור כל התמונות.
  9. לפני כימות התמונה, הגדר את הפרמטרים שעומדים להימדד. בשורת התפריטים, עבור אל ניתוח > הגדרת מידות. בהליכים המתוארים כאן, יהיה צורך להשיג שטח והיקף (זה בסופו של דבר גם נדרש כדי למדוד מרחקים). לחץ על אישור.
  10. הורד את התוסף הדרוש לכימות צפיפות כלי השיט17 ובצע את הוראות ההתקנות המסופקות על ידי התוסף.
  11. המשך בכימות של פרמטר כלי דם ספציפי.

5. כימות של אזורי כלי דם

  1. בשורת התפריטים, בחרו בכלי השרביט. בחר את אזור הרשתית שחסרים לו כלי שיט.
    הערה: ניתן לבחור אזורים גדולים או קטנים יותר בהתאם לסובלנות. כדי להתאים את הסבילות, לחץ פעמיים על סמל כלי השרביט. מצב מועסק: מורשת.
  2. הקש על אות T בלוח המקשים כדי להקליט את האזור הנבחר במנהל ההחזר על ההשקעה. חזור על שלבים 5.1 ו 5.2 עם כל אזורי כלי הדם של הרשתית.
  3. לחץ על מדידה במנהל החזר ההשקעה כדי לקבל את המידע על אזור כלי הדם. התוכנית תציג חלון חדש עם המידע הנדרש. העתק את הנתונים בתוכנית אחרת או שמור את הקובץ.
    הערה: בתמונות מסוימות, ייתכן שתעדיף לבחור את אזורי כלי הדם באופן ידני. במקרה זה, בחרו בכלי בחירת מצולע, ציירו מרחקים קצרים סביב אזור כלי הדם ולחצו על התמונה כשמרחק חדש עומד להתחיל. סגור את האזור הנבחר על-ידי לחיצה על הנקודה הראשונה.
  4. חזור על שלבים 5.1, 5.2 ו- 5.3 כדי למדוד את השטח הכולל של הרשתית.
  5. חשב את אזור כלי הדם של הרשתית כסכום של כל אזורי כלי הדם הנמדדים חלקי השטח הכולל של הרשתית.

6. כימות של אזורים ניאו-וסקולריים

  1. בשורת התפריטים, בחרו בכלי שרביט.
  2. הגדל את התצוגה של התמונה כדי לדמיין טוב יותר את neovessels. בחר את neovesselsels אחד אחד עם הכלי שרביט.
    הערה: התאם את הסבילות לא יותר מ- 20 כדי להבטיח את הבחירה של neovessel יחיד. רמת סובלנות זו חייבת להישאר קבועה במהלך כל כימות התמונה.
  3. הקש על אות T בלוח המקשים כדי להקליט את האזור הנבחר במנהל ההחזר על ההשקעה. חזור על שלבים 6.1 ו 6.2 עם כל האזורים הניאו-וסקולריים של הרשתית.
  4. לחץ על מדידה במנהל ההחזר על ההשקעה כדי לקבל את נתוני האזור. התוכנית תציג חלון חדש עם המידע הנדרש. העתק את הנתונים בתוכנית אחרת או שמור את הקובץ.
  5. חזור על שלבים 6.1, 6.2 ו- 6.3 כדי לכמת את השטח הכולל של הרשתית.
  6. חשב את האזור הניאו-וסקולרי של הרשתית כסכום של כל האזורים של neovessels נמדד חלקי השטח הכולל של הרשתית.

7. כימות קוטר כלי השיט

  1. בשורת התפריטים, בחרו בכלי קו ישר.
  2. הגדל את התצוגה של התמונה כדי לדמיין טוב יותר את קיר כלי השיט. בצע שלושה קווים חוצים לכלי הראשי לפני הענף הראשון. זה חייב להיעשות על ידי ציור קו מגבול של קיר אחד של הכלי להפך.
    הערה: הקו חייב להיות מאונך באופן מושלם לכלי הקיר כדי למנוע שגיאות כימות.
  3. הקש על אות T בלוח המקשים כדי להקליט את האזור הנבחר במנהל ההחזר על ההשקעה. חזור על שלבים 7.1 ו 7.2 בכל כלי השיט שיש לכמת.
  4. לחץ על מדידה במנהל ההחזר על ההשקעה כדי לקבל את נתוני המרחק. התוכנית תציג חלון חדש עם המידע הנדרש. העתק את הנתונים בתוכנית אחרת או שמור את הקובץ.

8. כימות של טורטואוזיות כלי שיט

  1. בשורת התפריטים, לחץ על סמל הכלי קו ישר עם הכפתור הימני של העכבר ובחר קו מקוטע או קו חופשי. צייר קו בתוך הכלי מעצב הראייה עד להשלכות הכלי הראשון בעקבות צורת כלי הדם.
    הערה: הקו חייב לעקוב אחר צורת כלי הדם כדי למנוע שגיאות כימות.
  2. הקש על אות T בלוח המקשים כדי להקליט את האזור הנבחר במנהל ההחזר על ההשקעה.
  3. בשורת התפריטים, בחרו בכלי קו ישר. צייר קו מעצב הראייה עד השלכות כלי השיט הראשון.
  4. הקש על אות T בלוח המקשים כדי להקליט את האזור הנבחר במנהל ההחזר על ההשקעה.
  5. לחץ על מדוד במנהל החזר ההשקעה כדי לקבל את נתוני המרחקים. התוכנית תציג חלון חדש עם המידע הנדרש. העתק את הנתונים בתוכנית אחרת או שמור את הקובץ.
  6. חשב את מדד הטורטואוזיות כדלקמן: מרחק המתקבל עם קו מקוטע חלקי המרחק המתקבל בקו ישר.

9. כימות הסתעפות כלי הדם

  1. בעזרת הכלי הסגלגל של שורת התפריטים, הגדר אזור המוחל באופן שווה על כל תנאי הניסוי. האזור שנבחר חייב להיות עיגול קונצנטרי שצויר סביב עצב הראייה.
  2. הקש על אות T בלוח המקשים כדי להקליט את האזור הנבחר במנהל ההחזר על ההשקעה.
    הערה: במקרה זה, מומלץ לשמור את ההחזר על ההשקעה מכיוון שהכימות איטי ויש להשתמש בהחזר ההשקעה הזהה בכל התמונות. לשם כך, במנהל החזר ההשקעות לחץ על עוד > שמור.
  3. באופן ידני, ספור את מספר הענפים הראשיים הנובעים מכלי שיט עיקריים בתוך אזור הבחירה.
  4. חזור על שלבים 9.2 ו-9.3 באזורים הסמוכים, תוך שמירה על הקריטריונים של עצב הראייה בפריפריה.

10. כימות צפיפות כלי הדם

  1. הפכו את התמונה למצב של 8 סיביות.
  2. עבור אל תוספים בשורת התפריטים, בחר ניתוח כלי > צפיפות כלי הדם.
  3. הגדר אזור באמצעות הכלי ריבועי של שורת התפריטים, שבו יש למדוד את צפיפות כלי השיט. לחץ על אישור.
  4. התוכנית תציג חלון חדש עם המידע הנדרש. העתק את הנתונים בתוכנית אחרת או שמור את הקובץ.
  5. חזור על שלבים 10.2, 10.3 ו- 10.4 באזורים הסמוכים, תוך שמירה על ההחזר על ההשקעה אך הצבתו תשע פעמים המקיפה את הפריפריה ומרכז הרשתית כולה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כפי שמתואר בסעיף הפרוטוקול, מתוך בדיקת כתמים פלואורסצנטית אחת אתה יכול להשיג את המורפולוגיה של כלי הדם ולהעריך כמה פרמטרים של עניין כמותי. החיפוש אחר שינוי מסוים יהיה תלוי בסוג הרטינופתיה שנחקרה. במאמר זה, אזורים וסקולריים וניאו-וסקולריים, טורטואוזיות והרחבה הוערכו במודל עכבר של רטינופתיה מתרבה, ואילו הסתעפות כלי הדם והצפיפות נותחו במודל עכבר MetS, מה שגורם לרטינופתיה לא מתרבות.

בדוגמה הניסיונית הראשונה, מודל העכבר רטינופתיה המושרה בחמצן (OIR), הועסק, הדומה לרטינופתיה של פגות וכמה תכונות של הש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מודלים מן החי של רטינופתיות הם כלים רבי עוצמה לחקר התפתחות כלי הדם, שיפוץ או אנגיוגנזה פתולוגית. ההצלחה של מחקרים אלה בתחום מסתמכת על הגישה הקלה לרקמה המאפשרת לבצע מגוון רחב של טכניקות, ומספקת נתונים מ- in vivo ועכברים לאחר המוות26,27. יתר על כן, נמצא מתאם רב בין מחקרי vivo וניתוח קליני, מתן עקיבות מוצקה ואמינות למודלים אלה28. במאמר זה, אנו מציגים תיאור פשוט וחזק של השלבים לאפיון רשת כלי הדם במודלים של עכבר של מח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים שיכולים להתפרש כניגוד אינטרסים פוטנציאלי.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לקרלוס מאס, מריה פילאר קרספו וססיליה סמפדרו מ- CEMINCO (Centro de Micro y Nanoscopía Córdoba, CONICET-UNC, קורדובה, ארגנטינה) על הסיוע במיקרוסקופיה קונפוקלית, לסולדד מירו וויקטוריה בלנקו על טיפול מסור בבעלי חיים ולורה גטיקה על סיוע היסטולוגי. אנו מודים גם לויקטור דיאז (פרו-מזכיר התקשורת המוסדית של FCQ) על הפקת הווידאו והמהדורה ופול הובסון על הקריאה הביקורתית שלו ותיקון השפה של כתב היד.

מאמר זה מומן על ידי מענקים מ Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (all to M.C.S.).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
רדיד
בקר סרום אלבומיןMerckA4503איכות
סידן כלוריד דיהידראטMerckC3306
חומצה הידרוכלוריתBiopack9632.08
מיקרוסקופ קונפוקלי FV1200אולימפוסFV1200עם צלחת ממונעת
כיסוייםPaul Marienfeld GmnH & ושות'.111520
מיקרוסקופ מנתחNIKONSMZ645
דיסודיום-מימן-פוספט דיהידראטMerck119753
200 ומיקרו; L  שפופרתMerckZ316121
נייר סינוןMerckWHA5201090
Incubator shaker GyroMiniLabNet InternationalS0500
Isolectin GS-IB4 מבית Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 ConjugateInvitrogenI21411
Poly(ויניל אלכוהול) (Mowiol 4-88)Merck475904
ParaformaldehydeMerck158127
pHmeterSANXINPHS-3D-03
אשלגן כלוריMerckP9541
אשלגן-דימימן פוספטMerck1,04,873
שקופיותפישר סיינטיפיק12-550-15
נתרן כלוריMerckS3014
נתרן הידרוקסידMerckS5881
TrisMerckGE17-1321-01
Triton X-100MerckX100-1GA
ניתוח כלי דם תוכנת פיג'יMai Elfarnawanyhttps://imagej.net/Vessel_Analysis
אלומיניום

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).
  2. McDougal, D. H., Gamlin, P. D. Autonomic control of the eye. Comprehensive Physiology. 5 (1), 439-473 (2015).
  3. Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. Retinal vasculature development in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).
  4. Wei, Y., et al. Age-related alterations in the retinal microvasculature, microcirculation, and microstructure. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (9), 3804-3817 (2017).
  5. Lavia, C., et al. Reduced vessel density in the superficial and deep plexuses in diabetic retinopathy is associated with structural changes in corresponding retinal layers. PLoS One. 14 (7), 0219164(2019).
  6. Rosenblatt, T. R., et al. Key factors in a rigorous longitudinal image-based assessment of retinopathy of prematurity. Scientific Reports. 11 (1), 5369(2021).
  7. Edwards, A. L. Funduscopic examination of patients with diabetes who are admitted to hospital. Canadian Medical Association Journal. 134 (11), 1263-1265 (1986).
  8. Lechner, J., O'Leary, O. E., Stitt, A. W. The pathology associated with diabetic retinopathy. Vision Research. 139, 7-14 (2017).
  9. Sun, Z., et al. angiography metrics predict progression of diabetic retinopathy and development of diabetic macular edema: A prospective study. Ophthalmology. 126 (12), 1675-1684 (2019).
  10. Jia, Y., et al. Quantitative optical coherence tomography angiography of vascular abnormalities in the living human eye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 2395-2402 (2015).
  11. Pauleikhoff, D., Gunnemann, F., Book, M., Rothaus, K. Progression of vascular changes in macular telangiectasia type 2: comparison between SD-OCT and OCT angiography. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (7), 1381-1392 (2019).
  12. Gammons, M. V., Bates, D. O. Models of oxygen induced retinopathy in rodents. Methods in Molecular Biology. 1430, 317-332 (2016).
  13. Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).
  14. Han, N., Xu, H., Yu, N., Wu, Y., Yu, L. MiR-203a-3p inhibits retinal angiogenesis and alleviates proliferative diabetic retinopathy in oxygen-induced retinopathy (OIR) rat model via targeting VEGFA and HIF-1α. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 47 (1), 85-94 (2020).
  15. Paz, M. C., et al. Metabolic syndrome triggered by fructose diet impairs neuronal function and vascular integrity in ApoE-KO mouse retinas: Implications of autophagy deficient activation. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 573987(2020).
  16. Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).
  17. Zarb, Y., et al. Ossified blood vessels in primary familial brain calcification elicit a neurotoxic astrocyte response. Brain. 142 (4), 885-902 (2019).
  18. Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
  19. Subirada, P. V., et al. Effect of autophagy modulators on vascular, glial, and neuronal alterations in the oxygen-induced retinopathy mouse model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 279(2019).
  20. Lutty, G. A., McLeod, D. S. Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).
  21. Kim, C. B., D'Amore, P. A., Connor, K. M. Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).
  22. Guaiquil, V. H., et al. A murine model for retinopathy of prematurity identifies endothelial cell proliferation as a potential mechanism for plus disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5294-5302 (2013).
  23. Mezu-Ndubuisi, O. J. In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery. Optometry and Vision Science: Official Publication of the American Academy of Optometry. 93 (10), 1268-1279 (2016).
  24. Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR). Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).
  25. Kim, A. Y., et al. Quantifying microvascular density and morphology in diabetic retinopathy using spectral-domain optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 362(2016).
  26. Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
  27. Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).
  28. Kern, T. S., Antonetti, D. A., Smith, L. E. H. Pathophysiology of diabetic retinopathy: Contribution and limitations of laboratory research. Ophthalmic Research. 62 (4), 196-202 (2019).
  29. Lorenc, V. E., et al. IGF-1R regulates the extracellular level of active MMP-2, pathological neovascularization, and functionality in retinas of OIR mouse model. Molecular Neurobiology. 55 (2), 1123-1135 (2018).
  30. Ma, N., Streilein, J. W. Contribution of microglia as passenger leukocytes to the fate of intraocular neuronal retinal grafts. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (12), 2384-2393 (1998).
  31. Mazzaferri, J., Larrivée, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model. Scientific Reports. 8 (1), 3916(2018).
  32. Milde, F., Lauw, S., Koumoutsakos, P., Iruela-Arispe, M. L. The mouse retina in 3D: quantification of vascular growth and remodeling. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro (Camb). 5 (12), 1426-1438 (2013).
  33. Yang, T., et al. Pericytes of indirect contact coculture decrease integrity of inner blood-retina barrier model in vitro by upgrading MMP-2/9 activity. Disease Markers. 2021, 7124835(2021).
  34. Huang, Q., Wang, S., Sorenson, C. M., Sheibani, N. PEDF-deficient mice exhibit an enhanced rate of retinal vascular expansion and are more sensitive to hyperoxia-mediated vessel obliteration. Experimental Eye Research. 87 (3), 226-241 (2008).
  35. Jiang, H., Zhang, H., Jiang, X., Wu, S. Overexpression of D-amino acid oxidase prevents retinal neurovascular pathologies in diabetic rats. Diabetologia. 64 (3), 693-706 (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Whole MountImageJ Fiji

מאמרים קשורים