DetectSyn: שיטה פלואורסצנטית מהירה ובלתי משוחדת לזיהוי שינויים בצפיפות הסינפסה

Summary

DetectSyn הוא בדיקה פלואורסצנטית מהירה ובלתי משוחדת המודדת שינויים במספר הסינפסות היחסי (טרום ופוסט-סינפטי) בין טיפולים או מצבי מחלה. טכניקה זו משתמשת בטכניקת קשירת קרבה שניתן להשתמש בה הן בתאי עצב בתרבית והן ברקמות קבועות.

Abstract

סינפסות הן אתר התקשורת בין נוירונים. חוזק המעגל העצבי קשור לצפיפות הסינפטית, והתפרקות הסינפסות אופיינית למצבי מחלה כמו הפרעת דיכאון מז'ורי (MDD) ומחלת אלצהיימר. טכניקות מסורתיות לחקר מספרי סינפסות כוללות ביטוי גנטי של סמנים פלואורסצנטיים (למשל, חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)), צבעים הממלאים נוירון (למשל, צבע קרבוציאנין, DiI), וזיהוי אימונופלואורסצנטי של סמני עמוד שדרה (למשל, צפיפות פוסט-סינפטית 95 (PSD95)). אזהרה מרכזית לטכניקות פרוקסי אלה היא שהן מזהות רק שינויים פוסט-סינפטיים. עם זאת, סינפסה היא חיבור בין מסוף קדם-סינפטי לבין עמוד שדרה פוסט-סינפטי. תקן הזהב למדידת היווצרות/חיסול סינפסות דורש מיקרוסקופיית אלקטרונים גוזלת זמן רב או טכניקות טומוגרפיה של מערך. טכניקות אלה דורשות הכשרה מיוחדת וציוד יקר. יתר על כן, רק מספר מוגבל של נוירונים ניתן להעריך והם משמשים כדי לייצג שינויים באזור שלם במוח. DetectSyn היא טכניקה פלואורסצנטית מהירה המזהה שינויים בהיווצרות או חיסול סינפסות עקב מצב מחלה או פעילות תרופתית. DetectSyn משתמשת במבחן קשירת קרבה מהיר כדי לזהות חלבונים טרום-סינפטיים ופוסט-סינפטיים מעוותים ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית סטנדרטית, טכניקה הזמינה בקלות לרוב המעבדות. זיהוי פלואורסצנטי של הפנקטה המתקבלת מאפשר ניתוח מהיר ובלתי מוטה של ניסויים. DetectSyn מספקת תוצאות מייצגות יותר ממיקרוסקופיית אלקטרונים מכיוון שניתן לנתח אזורים גדולים יותר מאשר מספר מוגבל של נוירונים פלואורסצנטיים. יתר על כן, DetectSyn עובד עבור נוירונים בתרבית במבחנה ופרוסות רקמה קבועות. לבסוף, מסופקת שיטה לניתוח הנתונים שנאספו מטכניקה זו. באופן כללי, DetectSyn מציעה הליך לאיתור שינויים יחסיים בצפיפות הסינפסה בין טיפולים או מצבי מחלה, והיא נגישה יותר מטכניקות מסורתיות.

Introduction

סינפסות הן יחידת התקשורת הבסיסית בין נוירונים¹. סינפסות רבות בין נוירונים באותם אזורים יוצרות מעגלים המתווכים התנהגות². סינפסות מורכבות ממסוף קדם-סינפטי מתא עצב אחד המשחרר מוליכים עצביים או נוירופפטידים המעבירים מידע לקולטנים פוסט-סינפטיים של נוירון אחר. הסיכום של אותות קדם-סינפטיים קובע אם הנוירון הפוסט-סינפטי יפעיל פוטנציאל פעולה ויפיץ את המסר לנוירונים אחרים.

סינפטופתולוגיה, פירוק הסינפסות, מתעוררת במחלות ובהפרעות המסומנות בירידה בנפח העצבי, כמו מחלת אלצהיימר והפרעת דיכאון מז'ורי, וכתוצאה מכך מעגלים שכבר אינם מבצעים באופן אופטימלי ^3,4,5. שחזור צפיפות הסינפסה ככל הנראה עומד בבסיס היעילות של טיפולים פוטנציאליים להפרעות אלה. לדוגמה, לאחרונה הוכח כי הגדלת הסינפסות עומדת בבסיס היעילות ההתנהגותית של תרופות נוגדות דיכאון מהירות⁶. כדי לסנן במהירות טיפולים סינפטופתולוגיים אפשריים, חוקרים זקוקים לטכניקות שמזהות במהירות שינויים במספרי הסינפסות.

המתודולוגיות הנוכחיות גוזלות זמן רב ויקרות (מיקרוסקופיית אלקטרונים, טומוגרפיה של מערך), או שהן בוחנות רק שינויים פוסט-סינפטיים מבלי לשלב מעורבות קדם-סינפטית (ניתוח עמוד שדרה, אימונופלואורסצנציה/קולוקליזציה). צבעים כמו DiI או חלבונים פלואורסצנטיים כמו GFP עוזרים לדמיין נוירונים ולאפיין עמודי שדרה פוסט-סינפטיים. עם זאת, ניתוח עמוד השדרה משתמש ביחסים המוגדרים על ידי חוקר כדי לקבוע מורפולוגיה, אשר יכול להפחית את יכולת השכפול⁷. יתר על כן, האופן שבו שיעורי עמוד השדרה השונים מתייחסים לסינפסות תפקודיות עדיין נחשף⁸. היווצרות עמוד השדרה יכולה להיות חולפת ועשויה לשקף פלסטיות פוסט-סינפטית, אך ניתן לסלק את הקוצים האלה לפני שהם מתייצבים לסינפסה עם נוירון קדם-סינפטי⁹.

קולוקליזציה מספקת פרוקסי טוב יותר לסינפסות מאשר ניתוח עמוד שדרה מכיוון שניתן להגן על חיסונים עבור חלבונים קדם-סינפטיים ופוסט-סינפטיים. עם זאת, חלבונים סינפטיים עשויים להניב ערכי קולוקליזציה נמוכים מכיוון שהחלבונים משתלבים זה בזה וייתכן שאינם חופפים באופן עקבי. לפיכך, מכיוון שהחלבונים אינם עליונים לחלוטין, טכניקות קולוקליזציה עשויות שלא למדוד במדויק שינויים בהיווצרות הסינפסה בשל מידע חסר זה. לבסוף, למרות שגם מיקרוסקופיית אלקטרונים (EM) וגם טומוגרפיה של מערך מספקים תמונות ברזולוציה גבוהה של סינפסות, הן גוזלות זמן רב. EM דורש גם ציוד מיוחד, והחוקרים מוגבלים לכמויות קטנות של רקמות עבור כל ניסוי נתון. בעוד שטומוגרפיה של מערך מספקת באלגנטיות את היכולת לסנן חלבונים רבים על מקטעי אולטרה-טווין וניתן לשלב אותה עם EM¹⁰, טכניקה זו עשויה להיות עתירת עבודה מדי ומעבר להיקף הניסויים שצריכים לסרוק במהירות אחר שינויים ביצירת סינפסות.

DetectSyn הוא יישום ספציפי של מבחן הליגה של קרבת דואולינק. בדיקת PLA מאפשרת זיהוי כללי של אינטראקציות חלבון-חלבון. DetectSyn מגשר על מדדים פוסט-סינפטיים של פרוקסי על-ידי הגברת אות פלואורסצנטי הנפלט על-ידי חלבונים מתויגים לפני ואחרי-סינפטיים בטווח של 40 ננומטר זה מזה. אם החלבונים הסינפטיים נמצאים בטווח של 40 ננומטר, כמו בתוך שסע סינפטי, אז הנוגדנים המשניים, המכילים בדיקות דנ"א, יתאיימו לדנ"א מעגלי. הדנ"א המעגלי ההיברידי הזה מבטא בדיקה פלואורסצנטית, שלאחר מכן מוגברת ומתגלה באמצעות טכניקות סטנדרטיות של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית (ראו איור 1). באופן מכריע, שלא כמו EM וטומוגרפיה של מערך, טכניקה זו אינה דורשת ציוד מיוחד ולוקחת בערך את אותה כמות זמן כמו אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית. הנגישות של טכניקה זו, אם כן, מאפשרת לחוקרים מחוץ למוסדות עתירי מחקר להשתתף במחקר סינאפתולוגי. יתר על כן, טכניקה זו יכולה לבחון שינויים בצפיפות הסינפטית באזורי מוח מרובים בניסוי אחד, ומציעה ייצוג הוליסטי יותר של שינויים סינפטיים עקב מחלה או טיפול.

Protocol

בידודם של תאים ורקמות מבעלי חיים נעשה בהתאם למדריך של המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול בחיות מעבדה ולשימוש בהן ואושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים בוויק פורסט

הערה: פרוטוקול זה משמש בדגימות שכבר טופלו וקבועות לפי פרדיגמות ודרישות ניסיוניות ספציפיות. למטרות הדגמה, היווצרות סינפסה עקב טיפול מהיר בתרופות נוגדות דיכאון משמשת להדגשת טכניקת זיהוי סינפסה זו⁶. נוירונים שבעבר תרביתו בתרבית על קליפות כיסוי, טופלו, תוקנו ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) ואוחסנו ב-1x מלוחים עם מאגר פוספט (PBS) ישמשו להדגשת ההליכים במבחנה. רקמת ההיפוקמפוס שנחתכה בעבר (בעובי 25 מיקרומטר) מעכברים שטופלו, הוטבעה באופן טרנסקרדיאלי עם PBS קר כקרח ו-4% PFA, ולאחר מכן אוחסנה ב-cryoprotectant תשמש להדגשת הליכי הפרוסה. אנא ראה ^11,12 לקבלת מידע נוסף על אופן התרבית של נוירונים או תסיסה טרנסקרדיאלית של מכרסמים. ראו איור 1 לייצוג גרפי של הליך זה.

איור 1: ייצוג גרפי של מבחן DetectSyn. לאחר חדירת קרומי התאים, נוגדנים ראשוניים עבור Synapsin1 ו- PSD95 נקשרים לחלבונים סינפטיים אלה. משניות עם תגי אוליגונוקלאוטיד נקשרות לאחר מכן לנוגדנים הראשוניים. אם Synapsin1 ו- PSD95 נמצאים בטווח של 40 ננומטר, כמו בסינפסה, אז האוליגונוקלאוטידים מתקשרים זה עם זה, ותג פלואורסצנטי מוגבר. לאחר מכן ניתן לצלם את האות הפלואורסצנטי הזה באמצעות מיקרוסקופיה סטנדרטית ולנתח אותו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

1. שטפו דגימות

1. יש לשטוף את הדגימות ב-500 μL של 1x PBS + 0.75% גליצין למשך 5 דקות 3 פעמים עם תסיסה עדינה על שייקר מסלולי כדי להסיר שאריות PFA או מגן בהקפאה.

2. לחסום ולחלחל דגימות

1. הכינו תמיסת חסימה וחדירה (10% סרום חמורים רגיל, 0.25% Tween 20) ב-1x PBS. התכוננו מספיק כדי להשתמש בהן לדגירות חסימה, ראשוניות ומשניות.
2. לדגימות (למשל, כיסויים או פרוסות צפות בחופשיות) ב-24 לוחות באר, הוסיפו 500 μL של תמיסת חסימה וחדירה. ודא שכל באר מכילה דגימה שונה ומתויגת כראוי כדי למנוע החלפת דגימות.
3. דגירה של הדגימות בטמפרטורת החדר (RT) למשך 60 דקות עבור תאים בתרבית או 2 שעות עבור רקמות פרוסות. השתמש בשייקר מסלולי לתסיסה עדינה.

3. דגימות דגירה בנוגדנים ראשוניים

1. הכן נוגדנים ראשוניים במאגר חסימה:
   1. הכן צפיפות פוסט-סינפטית 95 (PSD95; 1:500, פוליקלונלי ארנב), סינפסין1 (1:500, חד שבטי עכבר), MAP2 (1:400, פוליקלונלי עוף)
   2. הכינו אליקוט בקרה שלילי המשמיט את אחד הזוגות הסינפטיים (למשל, ללא PSD95)
2. בזהירות להסיר את הפתרון חוסם עם פיפטה פסטר פלסטיק. נסו להסיר כמה שיותר מבלי להפריע לתאים או לקרוע רקמה.
3. עבור תאים בתרבית:
   1. מרפדים צלחת פטרי גדולה מפלסטיק בפרפילם. העבירו בזהירות כיסויים לפרפילם באמצעות מלקחיים.
   2. יש להוסיף בזהירות 60 μL של תמיסת הנוגדנים העיקרית לחלק העליון של הכיסויים. הקפידו לא לשפוך את תמיסת הנוגדנים העיקרית על צד הכיסוי.
   3. כדי לספק לחות ולמנוע מהדגימות להתייבש במהלך תקופת הדגירה, הוסיפו מים אולטרה-פוריים לצלחת פטרי קטנה יותר וסדרו בזהירות את צלחת הפטרי הקטנה סביב הכיסויים.
   4. מכסים את צלחת הפטרי הגדולה ומדגרים תאים בתרבית למשך שעה אחת ב-RT.
4. עבור רקמות פרוסות:
   1. יש להוסיף בזהירות 250 μL של תמיסת הנוגדנים העיקרית לפרוסות צפות בחופשיות בצלחת 24 באר.
   2. כסו את הצלחת ודגרו את הרקמה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה על שייקר מסלולי.

4. לשטוף דגימות, ואז לדוג בנוגדנים משניים

1. הכן נוגדנים משניים במאגר החוסם:
   1. הכן חמור נגד עכבר (1:5), חמור נגד ארנב (1:5), חמור נגד עוף (1:400).
   2. בשלב זה, ניתן להשיג בקרות טכניות נוספות על ידי הכנת אליקוט משני המשמיט את המשנה נגד עכבר או נגד ארנב.
2. עבור תאים בתרבית:
   1. בעזרת מלקחיים, הקש בזהירות על התמיסה העיקרית מכיסויים על מגבת נייר
   2. באמצעות מלקחיים, העבר בזהירות את הכיסויים בחזרה ללוחית הבאר המקורית שלהם 24 מלאה ב-500 μL של 1x PBS.
3. עבור רקמות פרוסות:
   1. הסר בזהירות את תמיסת הנוגדן העיקרית עם פיפטת פסטר פלסטית. נסו להסיר כמה שיותר מבלי לקרוע רקמות.
   2. הוסף 500 μL של 1x PBS
4. שטפו את הדגימות במשך 10 דקות 3 פעמים ב-1x PBS עם תסיסה עדינה על שייקר מסלולי. במהלך תקופה זו, הביאו את כל מאגרי הכביסה ל-RT.
   1. במהלך תקופה זו, שנה את הפרפילם בצלחת הפטרי הגדולה
5. עבור תאים בתרבית:
   1. באמצעות מלקחיים, מעבירים בזהירות את הכיסויים בחזרה לצלחת פטרי הגדולה הפרפילית
   2. יש להוסיף בזהירות 40 μL של תמיסת הנוגדנים המשנית לחלק העליון של הכיסויים. הקפידו לא לשפוך את תמיסת הנוגדן המשנית על דופן הכיסוי.
   3. במידת הצורך, הוסיפו עוד מים אולטרה-פוריים לצלחת פטרי קטנה יותר וסדרו בזהירות את צלחת הפטרי הקטנה סביב כיסויים.
   4. מכסים את צלחת הפטרי הגדולה
6. עבור רקמות פרוסות:
   1. הוסיפו בזהירות 250 μL של תמיסת הנוגדנים המשנית לפרוסות צפות בחופשיות בצלחת באר של 24.
   2. מכסים את הצלחת
      הערה: מכאן והלאה, הגן על דגימות מפני אור על ידי עטיפת החלק העליון של הלוחות בנייר כסף.
7. דגירה של הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת

5. קשירת קשרים

1. ערבבו את מלאי הקשירה 1:5 במים בדרגה מולקולרית.
2. כמו בסעיף 4, העבר בזהירות את הכיסויים והסר את התערובת המשנית מהרקמה הפרוסה.
3. שטפו את הדגימות ב-500 μL של מאגר שטיפה A
   1. עבור תאים בתרבית, לשטוף 2 פעמים במשך 5 דקות. עבור רקמות פרוסות, לשטוף 2 פעמים במשך 10 דקות. השתמשו בתסיסה עדינה על שייקר מסלולי עבור שניהם.
   2. במהלך תקופה זו, שנה את הפרפילם בצלחת הפטרי הגדולה
4. תוך כדי שמירה על הליגאז על בלוק קר, דיללו את הליגאז 1:40 במניה של הליגה משלב 5.1. בצע דילול זה מיד לפני הוספת הליגאז לדגימות.
5. כמו בסעיף 4, הסר כמה שיותר ממאגר הכביסה A מדגימות לפני הוספת הליגאז.
6. לתאים בתרבית: מעבירים כיסויים בחזרה לצלחת פטרי הפרפילמית. הוסיפו 40 μL מתערובת הקשירה לכיסויים, ארגנו כלי פטרי קטנים מלאים במים סביב הכיסויים, וכסו את צלחת הפטרי הגדולה.
7. עבור רקמות פרוסות: הוסיפו 250 μL מתערובת הקשירה משלב 5.4 לכל באר וכיסו את הצלחת.
8. דגירה של הדגימות במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

6. הגברה

1. מערבבים את מלאי ההגברה 1:5 במים ברמה מולקולרית.
2. כמו בסעיף 4, יש להעביר בזהירות את הכיסויים ולהסיר את תערובת הקשירה מהרקמה הפרוסה.
3. שטפו דגימות ב-500 μL של מאגר כביסה A
   1. עבור תאים בתרבית, לשטוף 2 פעמים במשך 2 דקות. עבור רקמות פרוסות, לשטוף 2 פעמים במשך 10 דקות. השתמשו בתסיסה עדינה על שייקר מסלולי עבור שניהם.
   2. במהלך תקופה זו, שנה את הפרפילם בצלחת הפטרי הגדולה
4. בצע דילול זה מיד לפני הוספת הפולימראז לדגימות. תוך שמירה על הפולימראז על גוש קר, דיללו את הפולימראז
   1. עבור תאים בתרבית, דיללו פולימראז 1:80 במלאי ההגברה משלב 6.1.
   2. עבור רקמה פרוסה, לדלל פולימראז 1:40 במלאי ההגברה משלב 6.1.
5. כמו בשלב 4, הסר כמה שיותר ממאגר הכביסה A מדגימות לפני הוספת הפולימראז.
6. עבור תאים בתרבית: העבירו את הכיסויים בחזרה לצלחת פטרי הפרפילמית. הוסיפו 40 μL של תערובת ההגברה משלב 6.4.1 לכיסויים, ארגנו כלי פטרי קטנים מלאים במים סביב הכיסויים, וכסו את צלחת הפטרי הגדולה. הדגירה של הדגימות למשך 100 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
7. עבור רקמות פרוסות: הוסיפו 250 μL של תערובת ההגברה משלב 6.4.2 לכל באר וכיסו את הצלחת. דגירה של הדגימות למשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס.
   הערה: במהלך תקופה זו, הכן ותייג שקופיות.

7. הרכבה

1. כמו בשלב 4, העבירו בזהירות את הכיסויים והסירו את תערובת ההגברה מהרקמה הפרוסה.
2. שטפו את הדגימות ב-500 μL של מאגר שטיפה B 2 פעמים במשך 10 דקות עם תסיסה עדינה על שייקר מסלולי.
3. שטפו את הדגימות ב-500 μL של 1% כביסו את מאגר B למשך דקה אחת עם תסיסה עדינה על שייקר מסלולי.
4. עבור תאים בתרבית:
   1. שחררו 3 μL של מדיית הרכבה על שקופית
   2. יש להקיש על מאגר שטיפה עודף מהכיסוי ולאחר מכן למקם את הכיסוי (עם תאים הפונים כלפי מטה) לתוך אמצעי ההרכבה. אטמו את הדפנות עם כמות קטנה של לק שקוף כדי לאטום את הכיסוי במקום.
5. עבור רקמות פרוסות:
   1. מעבירים בזהירות פרוסת טישו לשקופית המוכנה ומסדרים אותה, כך שהפרוסה שוכבת שטוחה. זרוק בין 5-10 μL של מדיית הרכבה (הכמות תהיה תלויה בגודל הפרוסה) על פרוסת הרקמה
   2. הניחו בזהירות כיסוי זכוכית מעל פרוסת טישו ואטמו עם כמות קטנה של לק שקוף לאורך הקצה כדי לאטום את הכיסוי במקום.
6. יש להמתין לפחות 15 דקות לפני הניתוח מתחת למיקרוסקופ, או לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.

8. קבל תמונות דיגיטליות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי

1. מטב את הגדרות הרכישה (למשל, הספק לייזר, רווח, היסט) על פני דגימות מכל הטיפולים. ודא שהאופטימיזציה כוללת הפחתת רעשי רקע ושיפור האות מבלי להפריז בעוצמת האותות הפלואורסצנטיים. לאחר קביעת ההגדרות, החל את אותן הגדרות רכישה על כל התמונות שהתקבלו.
   הערה: ניתן להשתמש בפרטי הרכישה הבאים עם מיקרוסקופ קונפוקלי של Nikon A1 ותוכנת Nikon NIS AR Elements.
2. הגדר את השקופית עם דגימה על הבמה ומצא את מישור המוקד של הדגימה באמצעות DAPI דרך העינית.
3. כבה את יציאת העין על-ידי לחיצה על יציאת Eye ובחר בלחצן תצורה אופטית כדי להתאים את ההגדרות.
4. התאם את כוח הרווח, ההיסט והלייזר עבור כל ערוץ פלואורסצנטי כדי להפחית את רעשי הרקע ולשפר את האות הפלואורסצנטי. ודא שהאות הפלואורסצנטי אינו רווי יתר על המידה כאמור בשלבים 8.5-8.6.
5. עקוב אחר אוברסטורציה באמצעות פסאודו-צבע עבור האות הפלואורסצנטי. בחלק התחתון של התמונה החיה, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הכרטיסייה המסומנת בערוץ הפלואורסצנטי הנמצא כעת בשימוש.
6. לאחר מכן, בחרו 'צביעת ערוצים' ובחרו פסאודו-צבע כמו Rainbow Dark כדי להמחיש את עוצמת הפלואורסצנציה בצבע פסאודו-צבע דמוי מפת חום. ב-Rainbow Dark, צבעים קרירים יותר מצביעים על פחות עוצמה פלואורסצנטית, וצבעים חמים יותר מצביעים על עוצמה פלואורסצנטית רבה יותר.
7. לאחר שכל ערוצי הפלורסנט ממוטבים, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על לחצן התצורה האופטית שנבחר בעבר ובחר הקצה את הגדרת המצלמה הנוכחית עבור לחצן זה.
8. ודא שההגדרות שנבחרו מספיקות עבור מדגם אקראי מכל קבוצת טיפול. אם ההגדרות שנבחרו מפריזות באחת מהדוגמאות הללו, חזור על שלב 8.4 כדי למנוע את ההגזמה.
9. עבור נוירונים בתרבית, בצע את השלבים 8.10-8.16.
10. באמצעות יציאת העין, חפש נוירון עם דנדריטים בעלי חפיפה מינימלית עם דנדריטים אחרים.
11. כבה את יציאת העין והשתמש בערוץ DAPI כדי לדמיין את גוף התא של הנוירון שנבחר. לחץ פעמיים על מרכז הסומא כדי למרכז את הנוירון באמצע שדה הראייה.
12. באמצעות ערוץ MAP2, מצא את מישור המיקוד הטוב ביותר עבור אות MAP2 בסריקה חיה.
13. תחת הכרטיסיה רכישת ND , לחץ על שמור בקובץ ובחר קובץ לשמירת התמונה תחת עיון. לאחר מכן, הזן את שם הקובץ.
14. תחת הכרטיסיה Z , בחר באפשרות מצב סימטרי המוגדר על-ידי טווח . הגדר את המיקוד למישור MAP2 הטוב ביותר ולחץ על לחצן יחסי כדי להגדיר מישור מוקד זה כמרכז מחסנית z.
15. הגדר את הטווח ל- 5 מיקרומטר עם שלבים של 1 מיקרומטר, והקפד לבדוק סגור תריס פעיל במהלך תנועת Z. תחת הכרטיסייה אורך גל , בחר את שם הלחצן האופטי עם הגדרות הרכישה שהוגדרו בעבר תחת Optical Conf. לאחר מכן, לחץ על הפעל כעת.
16. חזור על שלבים 8.1.10-8.1.15 עבור כ-10 תאי עצב לכל כיסוי/טיפול.
17. עבור רקמות פרוסות, בצע את השלבים 8.18-8.22.
18. באמצעות יציאת העין, חפש את אזור העניין. לדוגמה, אתר את CA1 של ההיפוקמפוס.
19. כבה את יציאת העין והשתמש בערוץ MAP2 כדי למצוא את מישור המיקוד הטוב ביותר עבור אות MAP2 בסריקה חיה.
20. תחת תפריט רכישה , בחר סרוק תמונה גדולה. לאחר מכן, בחר את שם הלחצן האופטי עם הגדרות הרכישה שהוגדרו קודם לכן תחת לוח הלכידה מהחלונית שנפתחת. כמו כן, הקפד לבחור את המטרה הנכונה בחלונית זו.
21. תחת החלונית Area והעינית, השתמש במקשי החצים כדי להגדיר את גבולות אזור העניין. לאחר מכן, לחץ על שמור תמונה גדולה לקובץ וצור שם קובץ נתיב שמירה עבור התמונה.
22. תחת החלונית Setup , ודא שהאפשרות 'לכידה רב-ערוצית' מסומנת ולאחר מכן בחר את שם הלחצן האופטי עם הגדרות הרכישה שהוגדרו בעבר תחת Optical Conf.
    הערה: מחסנית z עבור תמונה גדולה אפשרית אך תגדיל את זמן הסריקה.

9. ניתוח

1. בדומה להגדרות רכישה, השתמש בדגימות מכל הטיפולים כדי לייעל את הגדרות הסף. ודא שמיטוב הסף מתמקד בהפחתת רעשי הרקע ובשיפור האות מבלי להפריז בעוצמת האותות הפלואורסצנטיים. לאחר קביעת הגדרות אלה, החל את אותן הגדרות סף על כל התמונות המשמשות לניתוח כמתואר בשלבים 9.2-9.3.
2. ב- ImageJ, אפשרות הסף ממוקמת תחת התפריט > תמונה התאם > סף. בחר באפשרות רקע כהה אם התמונה כוללת רקע כהה.
3. לאחר מכן, התאם את הגבולות העליונים והתחתונים של הסף לפי הגדרות הסף הממוטבות שנקבעו קודם לכן, ולאחר מכן לחץ על החל.
4. עבור תאים בתרבית, השתמש בערוץ MAP2 ובכלי של אזור חופשי בעל עניין (ROI) כדי למשוך החזר על ההשקעה עבור כל נוירון, כולל דנדריטים וסומה. עבור רקמות פרוסות, ציירו החזר השקעה ביד חופשית בתוך תמונת הפרוסה שמכסה את אזור העניין (למשל, רדיאטום שכבה של ה-CA1 בתוך ההיפוקמפוס).
5. השג את שטח ההחזר על ההשקעה. ב- ImageJ, מדוד את האזור שמתחת לתפריט נתח > מדידה.
6. זהה את מספר הפונקטה בתוך כל ROI באמצעות כלי זיהוי אוטומטי כמו ניתוח חלקיקים ב- ImageJ בעקבות שלבים 9.7-9.9.
7. מצא את האפשרות ניתוח חלקיקים תחת התפריט נתח > לנתח חלקיקים. ראשית, הגדר את קוטר גודל הפונקטה, בדרך כלל 0.1-3 מיקרו-מ"ר.
8. לאחר מכן, בחר באפשרות מסיכות שכבה מתוך התפריט הנפתח הצג וסמן את האפשרות תוצאות תצוגה. לאחר מכן, לחץ על אישור.
9. אם פונקטה אינה מזוהה עם טווח הקוטר שנבחר, התאם את הטווח עד שכל הפונקטה תזוהה בניתוח זה. הקפד להשתמש באותן הגדרות ניתוח חלקיקים עבור כל התמונות.
10. חלק את מספר הפונקטה באזור של אזור עניין בודד על ידי ביצוע שלבים 9.11-9.13.
11. העתק והדבק את התוצאות עבור כל תמונה מהקופצה הנפתחת 'תוצאות' מ- ImageJ לגיליון אלקטרוני.
12. ראשית, זהה מאיזה קובץ ודגום את הנתונים שהתקבלו. לאחר מכן, חלקו את שטח ההחזר על ההשקעה במספר הפונקטה.
13. לאחר מכן, נקה את הנתונים מהחלון המוקפץ 'תוצאות', וחזור על שלבים 9.2-9.12.
14. נרמל את התוצאות כדי לשלוט בדגימות: ממוצע את התוצאות (מספר אזור puncta/ROI) עבור דגימות הבקרה. לאחר מכן, חלק את התוצאות המתקבלות של כל הדגימות בממוצע של הפקד כדי לקבל את התוצאות המנורמלות. הממוצע החדש של דגימות הבקרה צריך להיות שווה ל-1.

Results

נתונים ששונו מ- Heaney et ^al.6 מוצגים כדי להדגים ניסוי שבו צפויה היווצרות סינפסה מוגברת (ראה⁶ למידע נוסף ודיון מעמיק יותר במנגנון). בעבר, הוכח כי תרופות נוגדות דיכאון מהירות דורשות הפעלה של הקולטן המטבוטרופי המעכב, GABAB (תת-סוג של חומצה גמא-אמינו-בוטירית B), כדי להיות יעיל¹³. יתר על כן, נתונים קודמים הצביעו על כך שתרופות נוגדות דיכאון מהירות מגבירות את הסמנים הפוסט-סינפטיים¹⁴; לפיכך, DetectSyn שימש כדי לבחון את ההשערה שתרופות...

Discussion

DetectSyn הוא מבחן מהיר המשתמש במבחן קשירת קרבה כדי לזהות חלבונים בטווח של 40 ננומטר זה מזה, מה שמאפשר זיהוי של היווצרות סינפסות. טכניקה זו משפרת את המבחנים הפלואורסצנטיים הנוכחיים, המשמשים רק כמדידות פרוקסי להיווצרות סינפסות. DetectSyn מזהה שינויים הניתנים לכימות בחלבונים סינפטיים הממוקמים בטווח של 40 ננומטר, כלומר בתוך השסע הסינפטי, זה מזה. יתר על כן, DetectSyn הוא חסכוני יותר ולוקח פחות זמן מטכניקות, כמו מיקרוסקופיית אלקטרונים וטומוגרפיה של מערך, שנועדו למדוד סינפסות ומוגדרות באופן קלאסי כטכניקות תקן זהב.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x PBS	Fisher Scientific	BP39920	PBS תוצרת הבית, גם כן.
24 צלחות באר	פישר סיינטיפיק	FB012929	עבור פרוסות רקמות, צלחות מעוקרות מראש עשויות להיות מיותרות.
50 מ"ל צינורות חרוטיים	פישר סיינטיפיק	14-432-22
רדיד אלומיניום	פישר סיינטיפיק	15-078-290
עוף נגד MAP2 נוגדן	Abcam	ab5392
לק שקוף	פישר סיינטיפיק	NC1849418	גם לק שקוף אחר.
בלוק קר	פישר מדעי	13131012
מחשב תחנת עבודה	HP
קונפוקלי או פלואורסצנטי מיקרוסקופ	ניקון	A1R HD25
חמור נגד עוף FITC	פישר סיינטיפיק	SA1-72000
Duolink חמור נגד עכבר פלוס	סיגמא	DUO92001
Duolink חמור נגד ארנב מינוס	Sigma	DUO92005
Duolink ריאגנטים לזיהוי באתרם סיגמא אדום רחוק	DUO92013		מכיל מלאי קשירה, מלאי הגברה, ליגאז ופולימראז.
מדיום הרכבה Duolink באתרו עם מאגרי כביסה DAPI	Sigma
באתר, DUO82049 סיגמא פלואורסצנטי			מכיל מאגר כביסה A ומאגר כביסה B; לדלל את מאגר הכביסה B ל-1% ב-diH20 עבור מאגר כביסה 1%.
מברשת צבע עדינה	פישר סיינטיפיק	NC9691026	שיער סייבל, בגודל 00 או 000, ניתן למצוא גם בחנויות יצירה
משקפי כיסוי פישרברנד: מלבנים	פישר סיינטיפיק	12545MP	זכוכית כיסוי מיותרת לנוירונים מתורבתים שכבר נמצאים על כיסויי זכוכית.
שקופיות פישרברנד סופרפרוסט פלוס מיקרוסקופ	פישר סיינטיפיק	1255015	עבור נוירונים מתורבתים שכבר נמצאים על כיסויי זכוכית, מגלשות סופרפרוסט עשויות להיות מיותרות.
מקפיא, -20° C	VWR	76449-108
כיסויי זכוכית	Fisher Scientific	125480
Glycine	Fisher Scientific	BP381-1
תוכנת עיבוד תמונה	למשל NIS Elements, ImageJ
Incubator	Fisher Scientific	15-015-2633
צלחת פטרי גדולה, 100 מ"מ	Fisher Scientific	FB0875712
מים בדרגה מולקולרית	פישר סיינטיפיק	BP24701
עכבר אנטי-סינפסין1 נוגדן	מערכות סינפטיות	106-011
סרום חמור רגיל	ג'קסון אימונוסקר	017-000-121
שייקר אורביטלי	פישר סיינטיפיק	02-106-1013
פרפילם	פישר סיינטיפיק	13-374-10
טיפים לפיפטות	פישר סיינטיפיק	02-707-025
פיפטות	פישר סיינטיפיק	14-388-100	נפחי עבודה נעים בין 3 ומיקרו; L עד 500 ומיקרו; L
פיפטה פסטור פלסטיק	פישר סיינטיפיק	02-708-006
פינצטה מדויקת/foreceps	פישר סיינטיפיק	12-000-122
ארנב אנטי-PSD95 נוגדן	Abcam	ab18258	זוגות נוגדנים אחרים עשויים לעבוד, גם כן, עם אופטימיזציה.
מקרר	VWR	76470-402
צלחת פטרי קטנה, 60 מ"מ	פישר סיינטיפיק	FB0875713A
טיימר	פישר סיינטיפיק	14-649-17
טווין 20	פישר סיינטיפיק	BP337-100