הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שימוש במנתח שטף מטבולי של תאים בזמן אמת לניטור ביו-אנרגיה של אוסטאובלסט

3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63142

⸱

1 במרץ 2022

 ,  , 
1Vanderbilt Center for Bone Biology, Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Medicine, Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt University Medical Center, 3Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University

במאמר זה

סיכום

בדיקת שטף מטבולי של תאים בזמן אמת מודדת את קצב צריכת החמצן ואת קצב ההחמצה החוץ-תאית, המתאים לייצור אדנוזין טריפוספט מיטוכונדריאלי וגליקוליטי, באמצעות חיישני pH וחמצן. כתב היד מסביר שיטה להבנת מצב האנרגיה של אוסטאובלסטים ואפיון ופרשנות של המצב הביו-אנרגטי התאי.

תקציר

היווצרות עצם על ידי אוסטאובלסטים היא תהליך חיוני לרכישת עצם נכונה ותחלופת עצם כדי לשמור על הומאוסטזיס שלד, ובסופו של דבר, למנוע שבר. מתוך אינטרס הן לייעל את מסת העצם והן להילחם במחלות שלד-שריר שונות (כלומר, אוסטאופורוזיס לאחר גיל המעבר, אנורקסיה נרבוזה, סוכרת מסוג 1 ו-2), נעשו מאמצים מדהימים בתחום הביולוגיה של העצם לאפיין באופן מלא את האוסטאובלסטים לאורך תהליך ההתמיינות שלהם. בהתחשב בתפקידם העיקרי של אוסטאובלסטים בוגרים להפריש חלבוני מטריצה ושלפוחיות מינרליזציה, צוין כי תהליכים אלה לוקחים כמות מדהימה של אנרגיה תאית, או אדנוזין טריפוספט (ATP). מצב האנרגיה התאית הכולל מכונה לעתים קרובות ביו-אנרגיה תאית, והוא כולל סדרה של תגובות מטבוליות שחשות את זמינות המצע כדי להפיק ATP כדי לענות על הצרכים התאיים. לכן, השיטה הנוכחית מפרטת את התהליך של בידוד תאים סטרומליים ראשוניים, מח עצם מורין (BMSCs) וניטור מצבם הביו-אנרגטי באמצעות מנתח השטף המטבולי של התא בזמן אמת בשלבים שונים בהתמיינות אוסטאובלסט. חשוב לציין, נתונים אלה הראו כי הפרופיל המטבולי משתנה באופן דרמטי במהלך התמיינות אוסטאובלסט. לפיכך, שימוש בסוג תא רלוונטי מבחינה פיזיולוגית זה נדרש כדי להעריך באופן מלא כיצד המצב הביו-אנרגטי של התא יכול לווסת את התפקוד הכולל.

מבוא

היווצרות העצם על ידי האוסטאובלסט מלווה בהרס מתואם או ספיגה מחדש של עצמות על ידי אוסטאוקלסטים. האיזון בין היווצרות עצם אוסטאובלסטית לבין ספיגת אוסטאוקלסט הוא תהליך מצומד המתאר תחלופת עצם או שיפוץ, החיוני להומאוסטזיס של השלד. תפקוד לקוי של אוסטאובלסט מוביל לפגיעה ביצירת העצם וגורם למחלות שונות, כולל אוסטאופורוזיס 1,2,3. התמיינות Ex vivo/in vitro של תאי גזע סטרומליים של מח עצם (BMSCs) למבשרי אוסטאובלסטים ואוסטאובלסטים בוגרים גורמת להיווצרות ותצהיר של מטריצת העצם המינרלית בכלי התרבית לאורך זמן 4,5,6. היווצרות עצם זו על ידי האוסטאובלסט דורשת כמות משמעותית של אנרגיה תאית. באופן ספציפי, הוכח כי סינתזה והפרשת קולגן מסתמכות במידה רבה על ATP תאי: יחסי ADP, וככל הנראה, סחר בשלפוחית מינרלית והפרשתם דורשים תוספת ATP 7,8,9,10,11. חוקרים רבים הראו כי התהליך של אוסטאובלסטוגנזה ותפקוד אוסטאובלסט דורש אספקה מספקת של אנרגיה כדי לענות על הדרישה המטבולית של היווצרות עצם 12,13,14,15,16. לכן, המטרה של שיטה זו היא לאפיין את המצב הביו-אנרגטי של תאים סטרומליים ראשוניים, מורין, לאורך התמיינות אוסטאובלסט באמצעות מנתח השטף המטבולי של התא בזמן אמת. טכניקות אלה מסייעות בפיתוח הבנה טובה יותר של הומאוסטזיס שלד, אשר עשוי להוביל בסופו של דבר לפיתוח של אפשרויות טיפוליות חדשניות המסוגלות לשפר את הפרעות השלד.

ניתן להשתמש במנתח השטף המטבולי של התאים בזמן אמת כדי למדוד את קצב צריכת החמצן (OCR) ואת קצב ההחמצה החוץ-תאית (ECAR) של אוסטאובלסטים חיים, המתאימים לייצור ATP מיטוכונדריאלי וגליקוליטי, בהתאמה. היסוד למתודולוגיה זו הוא העובדה כי יון H+ אחד לכל לקטט משתחרר במהלך הגליקוליזה בהמרה של גלוקוז לקטט, מה שמשנה את ה- pH המדיה המשתקף בערכי ECAR. לעומת זאת, במהלך מחזור TCA (חומצה טריקרבוקסילית), זרחון חמצוני באמצעות המיטוכונדריה מייצר CO2 על ידי שימוש או צריכת חמצן, ולכן ניטור OCR משקף את התהליך המטבולי הזה. המנתח מודד הן את ה-OCR והן את ה-ECAR במיקרו-סביבה החוץ-תאית בו-זמנית ובזמן אמת, מה שמאפשר פוטנציאל עצום בחקר ביו-אנרגיה תאית 6,17. בנוסף, ביצוע בדיקות אלה הוא פשוט יחסית וניתן להתאמה אישית בקלות בהתאם למטרת הניסוי. טכניקות דומות הופעלו כדי להבין עוד יותר את הוויסות המטבולי של תאי T של מערכת החיסון18,19, התחלת סרטן והתקדמות20, יחד עם סוגי תאים רבים אחרים התורמים לתסמונות מטבוליות21,22.

היתרונות של מנתח שטף מטבולי בזמן אמת על פני טכניקות חלופיות כוללים (1) את היכולת למדוד ביו-אנרגיה תאית של תאים חיים בזמן אמת, (2) יכולת לבצע בדיקה עם מספר קטן יחסית של תאים (דורשת עד 5,000 תאים), (3) יציאות הזרקה כדי לתמרן במקביל טיפולים מרובים במערכת בעלת תפוקה גבוהה של 96 קידוחים, (4) שימוש בדימוי תאים אוטומטיים נטולי תוויות רדיואקטיביות לנורמליזציה18, 23,24. השיטות הבאות נועדו לספק תיאור כללי אך מפורט של ניטור ביו-אנרגיה תאית ב-Murine BMSCs לאורך התמיינות אוסטאובלסט באמצעות המנתח. הוא יכלול בדיקות המבוצעות באופן שגרתי; עם זאת, כמו בטכניקות ושיטות רבות, מומלץ מאוד שמעבדות בודדות יקבעו פרטים ספציפיים לניסויים שלהן.

מבחר של בדיקות וסוגים שונים של בדיקות זמינות: מגוון רחב של ערכות בדיקה וריאגנטים זמינים כדי לחקור את הביו-אנרגיה של התאים תוך הבטחת האמינות והעקביות של תוצאות הניסוי. בנוסף, תוכנת שולחן העבודה מציעה גם תבניות בדיקה שניתן להתאים אישית בקלות. ניתן להגדיר את הבדיקה על סמך צרכי המשתמש למדוד פרמטרים מטבוליים שונים. ניתן לשנות מבחנים אלה בדרכים שונות על סמך המטרה הניסויית ו/או השאלה המדעית. לדוגמה, עם ארבע יציאות הזרקה, ניתן להזריק מספר תרכובות למדיית הבדיקה כדי לנתח את התגובה התאית הספציפית לכל מסלול מטבולי.

בדיקת פנוטיפ של אנרגיית התא: בדיקה זו מודדת את הפנוטיפ המטבולי של התאים החיים ואת הפוטנציאל המטבולי שלהם. בדיקה זו מומלצת גם כצעד ראשון לקבלת מושג כללי על חילוף חומרים ספציפי למסלול. תערובת של אוליגומיצין A-מעכב של ATP סינתאז וקרבוניל ציאניד 4-(טריפלואורומתוקסי) פניל-הידרזון (FCCP)-סוכן מיטוכונדריאלי ללא שיתוף פעולה מוזרק כדי להבין את פוטנציאל האנרגיה של התא. הזרקת אוליגומיצין A מעכבת את הסינתזה של ATP, וכתוצאה מכך עלייה בקצב הגליקוליזה (ECAR) כדי לאפשר לתאים לעמוד בדרישות האנרגיה שלהם; מצד שני, הזרקה של FCCP גורמת ל- OCR גבוה יותר עקב דה פולריזציה של הממברנה המיטוכונדרית. בעיקרו של דבר, מבחן זה מתאר נשימה מטבולית בסיסית, ובעקבות הזריקות הכפולות, דוחף או מדגיש, את התגובה המטבולית. בהתבסס על פרמטרים אלה, התוכנה מתווה OCR ו- ECAR של התאים על ידי סיווג התאים כמצב אירובי, שקט, גליקוליטי או אנרגטי לאורך זמן25,26.

בדיקת קצב ייצור בזמן אמת של ATP: זה מודד את ייצור ה-ATP התאי בו-זמנית מגליקוליזה ונשימה מיטוכונדריאלית. בדיקה זו מודדת באופן כמותי את השינויים המטבוליים משני מסלולי האנרגיה ומספקת נתונים על קצב הייצור של ATP המיטוכונדריה והגליקוליטי לאורך זמן. הבדיקה מקבלת נתוני OCR ו-ECAR בסיסיים ולאחר מכן חישוב קצב הייצור של ATP מיטוכונדריאלי באמצעות הזרקת אוליגומיצין A וקצב ייצור ATP גליקוליטי באמצעות הזרקת תערובת רוטנון + אנטימיצין A (עיכוב כולל של תפקוד המיטוכונדריה), וכתוצאה מכך החמצה מיטוכונדריאלית17,27.

מבחן מאמץ למיטוכונדריה של תאים (או מבחן מאמץ מיטו תאי): זה מודד את תפקוד המיטוכונדריה באמצעות נשימה הקשורה ל-ATP, מכמת ביו-אנרגיה תאית, מזהה תפקוד לקוי של המיטוכונדריה ומודד את תגובת התאים ללחץ. פרמטרים שונים, כולל יכולת נשימה בסיסית ורזרבית, נשימה הקשורה ל-ATP, נשימה מקסימלית וצריכת חמצן לא מיטוכונדריאלית, ניתן לקבל בבדיקה אחת. בדיקה זו כוללת זריקות עוקבות של אוליגומיצין A, FCCP (חומר מיטוכונדריאלי לא מיתוכונדריה), תערובת של מעכבי רוטנון/אנטימיצין A כדי לנתח ביעילות את ההשפעה של אלה על תפקוד המיטוכונדריה28.

גמישות מיטו דלק flex מבחן: זה מודד את קצב הנשימה המיטוכונדרית על ידי חמצון של שלושת הדלקים המיטוכונדריים העיקריים על ידי נוכחות והיעדר המעכבים שלהם. העיכוב הרציף של גלוקוז, גלוטמין וחומצות שומן מסייע במדידת התלות, הקיבולת והגמישות של התאים והתלות של התאים במסלולים תאיים שונים כדי לענות על הביקוש לאנרגיה. כאשר המיטוכונדריה אינה יכולה לעמוד בדרישות של מסלול העניין החסום על ידי חמצון דלקים אחרים, התאים נכנסים למצב תלות. יכולתם של התאים מחושבת על ידי עיכוב של שני המסלולים החלופיים האחרים ולאחר מכן עיכוב מסלול העניין. הגמישות של התאים מסייעת בהבנת היכולת של המיטוכונדריה לפצות ולענות על צורכי הדלק של המסלול המעוכב. הוא מחושב על ידי הפחתת התלות של תאים מקיבולת התאים. שלושה מעכבים שונים משמשים באופן עצמאי או כתערובת של שניים כדי לחשב ביעילות את הפרמטרים הבדיקה. 2-ציאנו-3-(1-פניל-1H-אינדול-3-yl)-2-חומצה פרופנואית (UK5099) מעכב את חמצון הגלוקוז על ידי חסימת נשא הפירובט בגליקוליזה. Bis-2-(5-phenylacetamido-1,3,4-thiadiazol-2-yl) (BPTES) אתיל סולפיד מעכב את מסלול החמצון של גלוטמין, ואטומוסיר מעכב את החמצון של חומצות שומן ארוכות שרשרת29.

figure-introduction-1
איור 1: ייצוג סכמטי של המתודולוגיה לגידול והכנת אוסטאובלסטים לניתוח. ה-BMSCs של מורין מבודדים מעצמות ארוכות, מתרבית ונזרעים בצלחות של 96 בארות בצפיפות של 25,000 תאים/בארות. התרבות תאים אלה במדיה הספציפית של אוסטאובלסט מתחילה כאשר הם מגיעים למפגש של 80%-100% כדי להתחיל את התמיינותם. הבדיקות מבוצעות בשלבים שונים של בידול. צלחות המחסניות מיובשות יום אחד לפני הבדיקה. ביום הבדיקה מוזרקים מעכבים שונים ליציאות של מחסניות החיישנים על סמך דרישות הבדיקה, ונוסף מאגר כיול ללוחית הכיול של 96 הבארות. לאחר הכיול, מתבצעת בדיקת השטף המטבולי של התא בזמן אמת, ולאחר מכן הדמיה של המיקרו-פלטה של תרבית התא באמצעות הדמיית המיקרו-פלטה כדי לנרמל את נתוני מנתח השטף המטבולי של התא בזמן אמת עם ספירת תאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הנהלים התבססו על ההנחיות והאישור של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים במרכז הרפואי של אוניברסיטת ונדרבילט.

1. הכנת ריאגנטים והתקנת בדיקה

  1. בידוד וגידול של תאים סטרומליים של מח עצם (ראו גם את המאמר הקודם30).
    1. הכינו מדיה מלאה של תרבית תאים חיונית אלפא מינימלית (αMEM) על ידי השלמת מדיה חיונית מינימלית עם שינוי אלפא עם 10% FBS (סרום בקר עוברי), 100 U/mL של פניצילין, ו-100 מיקרוגרם/מ"ל של סטרפטומיצין.
    2. הכן את צינור איסוף מח העצם על ידי קיצוץ הקצה של צינור microcentrifuge 0.6 מ"ל כך שהתאים יוכלו לעבור דרכו והכנסתו לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל המכיל 100 μL של αMEM שלם.
    3. המתת חסד את העכברים באמצעות טיפול CO2 כדלקמן. מניחים את החיה בתא ה-CO2 למשך 2-3 דקות או עד להפסקת הנשימה. המתן לפחות דקה אחת לאחר שהחיה הופכת מחוסרת הכרה כדי להוציא את העכברים מהחדר ולנתק את צוואר הרחם.
    4. באמצעות מלקחיים סטריליים וזוג מספריים, חותכים את הבטן התחתונה של העכברים המתים כדי ליצור חתך קטן. בודדו את העצמות הארוכות (עצם הירך, השוקה והסמל האיליאק) של העכברים.
    5. קצצו את העצמות הארוכות כדי להסיר את כל הרקמות הרכות. לאחר ניקוי העצם, חותכים כ-1-2 מ"מ מהקצוות הדיסטליים והפרוקסימליים כדי ליצור פתח למח השטף.
      הערה: פתח זה צריך להיות שמרני כדי למנוע אובדן מח עצם תוך מתן אפשרות לו לשטוף החוצה.
    6. הניחו את העצמות בצינור איסוף המכיל 100 μL של 1x PBS סטרילי (מלוחים עם חציצת פוספט) כדי לבודד את מח העצם הכולל.
    7. שטפו את המח על ידי צנטריפוגה ב-10,000 x גרם במשך 15-20 שניות בטמפרטורת החדר. כדוריות תאי מח עצם בתחתית הצינור.
    8. חזור על צנטריפוגה עד שחלל העצם נראה לבן ונטול רוב יסודות המוח. החייאת האוכלוסייה המעורבת של מח העצם על ידי צניחה עדינה למעלה ולמטה.
    9. תרבית את התאים מבעל חיים אחד (הן עצם הירך והן השוקה) בבקבוקון תרבית תאים בגודל 75 ס"מ2 ב-10 מ"ל של מדיה של תרביות תאים ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת תרביות תאים עם 5% CO2. אם אתם אוגרים תאים מ-2-3 בעלי חיים, השתמשו בבקבוקון תרבית תאים בגודל 150 ס"מ2 (מומלץ).
    10. לאחר 24-48 שעות של דגירה של האוכלוסייה המעורבת, שאפו לאוכלוסיית התאים ההמטופוייטיים שאינם דבקים הכלולה במדיית התרבית ושטפו את התאים הדבקים עם 1x PBS.
  2. זריעת תאים מ-BMSCs והתמיינות אוסטאובלסט
    1. טריפסיניזציה של התאים הדבקים על ידי הוספת מספיק 0.25% טריפסין- EDTA (כ-3-4 מ"ל) כדי לכסות מעט את משטח הבקבוקון, ולאחר מכן דגירה של 3 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.
    2. הוסיפו 6-7 מ"ל של αMEM שלם לבקבוקון/טריפסין כדי להחיות את ה-BMSCs הדביקים על ידי צנרת קפדנית למעלה ולמטה. העברת מתלי BMSC לצינור צנטריפוגה חרוטית.
    3. הסר 50 μL aliquot של מתלה BMSC והוסף 50 μL של טריפאן כחול (1:1 דילול) אליו. ספירת המספר הכולל של תאים בני קיימא שאינם כוללים את הצבע על ידי צנרת 10 μL של תערובת זו על גבי המוציטומטר ותצפית בו מתחת למיקרוסקופ. אל תספור תאים מתים או לא בריאים שנראים בצבע כחול (<10% תאים).
    4. בהתבסס על ספירת התאים, חשב את נפח ההשעיה של התא ב-αMEM שלם הדרוש לריכוז סופי של 2.4 x 106 תאים/מ"ל עבור נפח כולל של לפחות 10 מ"ל לכל צלחת.

figure-protocol-1
איור 2: המיקרו-לוחית של תרבית התאים, שתוכננה במיוחד עבור המנתח. בארות אלה מכילות רק מדיית בדיקה ללא תאים. (B) הברקוד בצד הצלחת לסריקת הצלחת באמצעות קורא ההדמיה והמנתח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

  1. צנטריפוגה של התאים בצינור החרוטי ב-1,000 x g למשך 5 דקות והחזירו את התאים לריכוז הסופי הרצוי של 2.4 x 106 תאים/מ"ל.
  2. העבירו את תרחיף התא למאגר, ובאמצעות פיפטה רב-ערוצית, החיזרו בזהירות את התאים כדי להבטיח תערובת הומוגנית של תאים.
  3. זרע 2.5 x 104 תאים לכל באר במיקרו-פלטה של תרבית תאים של 96 בארות עם 80 μL של αMEM מלא. אין לזרוע תאים בבארות תיקון הרקע (A1, A12, H1, H12); במקום זאת, פשוט הוסף את המדיום בארבע הבארות האלה.
    הערה: BMSCs עבור הבדיקות מצופים במיקרו-פלטת תרבית תאים של 96 בארות המיועדת עבור המנתח בשילוב עם מחסניות החיישנים. שטח הפנים של לוחות אלה שונה מצלחת רגילה של 96 בארות. שטח הפנים של כל באר בצלחת הוא 0.106 ס"מ2, שהם כ -40% משטח הלוח הטיפוסי של 96 בארות. צפיפות זריעת תאים אופטימלית נבחרת על סמך סוג התא. בדרך כלל, המנתח יכול לזהות בין 0.5-4 x 104 תאים לכל באר. אוסטאובלסטים צריכים להיות במגע כדי להבדיל ביעילות; לשם כך, נבחר ציפוי בין 2.0 x 10 4-3.0 x 104 BMSCs/ באר ב- 80 μL של αMEM שלם.
  4. עצבו בעדינות את הצלחת כדי להבטיח התפלגות שווה של תאים בבארות ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. בדוק את הצמיחה של התאים ואת מפגש התאים תחת המיקרוסקופ לאחר 48 שעות. שנה את המדיה של תרבית התאים במידת הצורך.
  5. בהתאם למטרת הבדיקה, כאשר BMSCs הם 60%-80% מפגש (בדרך כלל 48-72 שעות), ליזום התמיינות אוסטאובלסטית על ידי שינוי המדיה של תרביות התאים למדיית התמיינות אוסטאובלסט (αMEM שלם בתוספת 5 mM β-גליצרול פוספט ו-50 מיקרוגרם/מ"ל של חומצה L-אסקורבית).
  6. אם יש לנתח תאים סטרומליים לא מובחנים (יום 0), שמרו על תאים תחת αMEM מלא.
  7. שנה את אמצעי התמיינות האוסטאובלסט כל יומיים ודמיין את התאים שמתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שהם בריאים עד יום הבדיקה. רצוי, 24 שעות לפני הבדיקה המתוכננת, לשנות את המדיה ולשמור על לוח זמנים עקבי לשינוי בינוני (מומלץ).
    הערה: שנה בזהירות את המדיה על ידי הטיה קלה של הלוחות בזווית; זה מונע מגע מקרי של קצות פיפטה ללוחות תרבית התאים ושיבוש של החד-שכבתי של התאים.

2. הכנת מחסנית חיישן לכיול שטף חוץ-תאי

  1. הקפידו על מחסניות החיישן מתוך ערכת הבדיקה החוץ-תאית לפני יום הבדיקה. הסר את מחסניות החיישן (לוחית ירוקה) והנח את החיישנים במהופך.
  2. באמצעות צינור רב-ערוצי, הוסף 200 μL של H2O לכל באר של לוח השירות. הניחו בזהירות את מחסניות החיישן בחזרה על לוחית השירות ודגרו את הצלחת למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
    הערה: היצרן ממליץ לדגום את מחסניות החיישן באינקובטור שאינו CO2 37 °C למשך הלילה. עם זאת, אידוי משמעותי של מחסניות החיישנים יכול להתרחש. אם זה קורה, ניתן לדוגר מחסניות חיישנים בטמפרטורת החדר. לוחות אלה צריכים להיות דגירה למשך מינימום של 4 שעות ומקסימום של 72 שעות.
  3. ביום הבדיקה, יש להשליך את H2O מלוח השירות ולהוסיף 200 μL של קליברנט. דגירה של צלחת השירות למשך שעה אחת לפחות לפני הבדיקה.

3. הכנת מדיה של מנתח שטף מטבולי של תאים בזמן אמת

  1. השתמש במדיית DMEM ללא אדום פנול עם pH מותאם מראש של 7.4 (מומלץ) כדי להפעיל את הבדיקה עם BMSCs.
  2. הכן 80 מ"ל של מדיה לבדיקה על ידי תוספת למדיית DMEM עם 1 mM נתרן פירובט, 2 mM גלוטמין, 10 mM גלוקוז, 10 mM גלוקוז, 200 ננומטר אינסולין, 50-200 μM חומצה אולאית BSA.
  3. דגירה של מדיית הבדיקה המלאה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבטיית מים.

4. הכנת תרכובות למחסניות החיישן

  1. הפשרת אוליגומיצין A, רוטנון ואנטימיצין A על קרח. פיפטה למעלה ולמטה כדי לבודד את התרכובות לפני השימוש.
  2. הוסף 3 מ"ל של מדיום בדיקה מוכן לכל צינור, ואחריו תוספת של צינור התרכובת המתאימה A: 26.4 μL של 2.5 mM oligomycin A; צינור B: 3.1 μL של 12.67 mM רוטנון + 4.1 μL של 9.4 mM אנטימיצין A + 30 μL כתם Hoechst.
  3. טען ריכוז של פי 10 של מעכבים אלה ביציאה המתאימה. הריכוז הסופי של תמיסות ההזרקה הדרושות הוא 2 μM של אוליגומיצין A, 1 μM של רוטנון, ו-4.1 μM של אנטימיצין A.
    הערה: Hoechst נוסף ליציאת ההזרקה הסופית לצורך צביעה פלואורסצנטית של הגרעינים למטרות הדמיה ונורמליזציה. ניתן לייעל ריכוזים אלה על סמך סוג התא.
  4. טען 20 μL של תרכובות אלה לתוך התאים ב 180 μL של מדיה בדיקה.

5. הכינו מיקרו-פלטה של תרבית תאים לבדיקה

  1. הסר את המיקרו-פלטה של תרבית התאים מהחממה של 37 °C והתבונן בתאים מתחת למיקרוסקופ.
  2. מוציאים את מדיום הבדיקה מאמבט המים.
  3. יש לשטוף בעדינות את התאים עם 200 μL של מדיום בדיקה פעמיים ולהוסיף 200 μL של מדיית בדיקה לכל באר.
    הערה: לאחר הוספת מדיית הבדיקה הסופית לתאים, הזמן עד שהלוחות נכנסים למנתח הוא קריטי. לכן, אל תתחיל להחליף את המדיה עד לביצוע השלבים הבאים תוך שעה אחת.
  4. בדקו את התאים שמתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים נשארים דבוקים לבארות.
  5. ודאו שהתאים ב-D5 וב-E8 נדבקים לחד-שכבתי עקבי ולא נשטפים במהלך שלב הכביסה. תוכנת הדמיה של תאים משתמשת בשתי בארות אלה להגדרת המיקוד האוטומטי והחשיפה האוטומטית.
    הערה: היצרן ממליץ לדגום את הצלחת בחממה שאינה CO2 37 °C למשך שעה אחת; ניתן לדלג על שלב זה אם מעדיפים הדמיה אוטומטית. לדוגמה, מדמיית המיקרו-פלטה שומרת על אותם תנאים בתא סגור, וניתן לדמות תאים תחת שדה בהיר.

6. הגדרת הבדיקה וההדמיה

figure-protocol-2
איור 3: תוכנת הבקר. התוכנה מוודאת שהציוד מחובר ומוגדר ל-37 מעלות צלזיוס. ניתן לבחור את קבצי התבנית עבור מבחנים שונים שניתן לבצע עם מנתח השטף החוץ-תאי כדי להתאים אישית את הבדיקה הלאה על סמך מטרות הניסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

  1. פתח את תוכנת שולחן העבודה במחשב שליד הציוד.
  2. בדוק את מצב החיבור בפינה הימנית התחתונה של תוכנת הבקר.
  3. עבור אל תבניות ובחר את קובץ התבנית XF ATP Rate Assay או את תבנית הבדיקה המתאימה.
  4. בחר הגדרות קבוצה בחלק העליון של המסך והגדר את הקבוצות.
  5. בחר את פריסת מפת הלוח והקצה את הבארות בהתאם לקבוצות שהוגדרו.
  6. אמת את פרוטוקול המכשיר, ודא שהתרכובות שנוספו מפורטות כראוי וכלול את פרטי הפרוייקט עבור הפניות עתידיות.
  7. לחץ על הפעל Assay; פעולה זו תבקש את הבחירה של מיקום אחסון הקבצים של התוצאה.
  8. בחר את המיקום כדי לשמור את קובץ התוצאה.
  9. שמור את הקובץ עם תאריך הבדיקה ולחץ על התחל הפעלה.
  10. הנח את מחסנית החיישן ואת לוחית השירות על המגש ולחץ על אני מוכן להתחיל את הכיול.
  11. לפני תחילת הכיול , ודא שמכסה המחסנית מוסר, ומחסנית החיישן ממוקמת בכיוון הנכון בלוח השירות. שלב זה ייקח 10-20 דקות, ולאחר השלמתו, התוכנה תציג את תיבת הדו-שיח Load Cell Plate .

7. השג תמונות בשדה בהיר

הערה: שלב זה הוא אופציונלי. אם אין ציוד הדמיה זמין, דלג לשלב 8.

figure-protocol-3
איור 4: תוכנת ההדמיה התאית מתקשרת לקורא ההדמיה דרך המחשב. ניתן לדמות את התאים במיקרו-פלטה לפני ואחרי הבדיקה, וספירת התאים/באר מתקבלת לאחר הבדיקה כדי לנרמל את הנתונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

  1. פתח את תוכנת ההדמיה של התאים במחשב.
  2. ודא שמצלמת המיקרו-פלטה מופעלת והיציאות מחוברות למחשב.
  3. בדוק את שורת המצב בפינה השמאלית התחתונה של המסך כדי לוודא שהטמפרטורה מוגדרת ל- 37 °C (77 °F) ושמצב החיבור צריך להיות מודגש בירוק כמוכן.
  4. סרוק את ברקוד הצלחת כדי להתחיל בתהליך ההדמיה.
  5. ספק שם ללוחית התא ולחץ על שמור (זהו השם שבו יישמרו גם תמונות שדה בהיר וגם תמונות פלורסנטיות). לחץ על בצע סריקת ברייטפילד.
  6. המסך, הצלחת ותפריט הסריקה הבאים, מציגים את האפשרויות להדמיה. לפני הבדיקה, בחר התחל סריקת ברייטפילד.
  7. מניחים את המיקרו-פלטה של תרבית התאים יחד עם כיסוי/מכסה הצלחת על מחזיק המגש ומיישרים היטב את A1 עם סימן A1. לחץ על סגור מגש.
  8. המסך הבא, רכישת תמונה ברייטפילד, עם מפת צלחת מופיע. לחץ על Scan All Wells, אשר יוזם את תהליך אתחול המערכת ואחריו 30 עד 35 דקות של סריקה.
  9. לאחר סריקת ה-brightfield, הסר את המיקרו-פלטה של תרבית התא והנח אותה במנתח כדי לבצע את הבדיקה.

8. הרצת הבדיקה

  1. לאחר השלמת הכיול, התוכנה מציגה את תיבת הדו-שיח Load Cell Plate .
  2. לחץ על פתח את המגש כדי להחליף את מגש השירות במיקרו-לוחית של תרבית תאים. ודא שהמכסה מוסר וה- A1 של הצלחת מתאים בכיוון הנכון.
  3. לאחר מכן, לחץ על טען צלחת תא כדי ליזום את הבדיקה. מחסנית החיישן תישאר בתוך המנתח עבור זריקות הבדיקה.
  4. המתן עד שהבדיקה תתחיל ותציג את זמן ההשלמה המשוער.
  5. עם השלמת הבדיקה, התוכנה מציגה את תיבת הדו-שיח של מחסנית חיישן הפריקה . לחץ על פלטה והסר את המיקרו-פלטה של תרבית התאים מהמנתח.
  6. הסר בזהירות את מחסנית החיישן והחלף את מכסה לוחית התא. התאים מוכנים להדמיה פלואורסצנטית ולספירת תאים.
  7. לאחר הסרת לוחית התא ומחסנית החיישן, מופיעה תיבת הדו-שיח Assay Complete .
  8. לחץ על הצג תוצאות כדי לפתוח את קובץ תוצאת הבדיקה ולנרמל את הנתונים באופן מיידי או לחץ על בית.

9. השג תמונות פלואורסצנטיות ונרמל

הערה: שלב זה הוא שיטה אופציונלית אך מועדפת לנורמליזציה של BMSCs ואוסטאובלסטים. אם אין ציוד הדמיה זמין, יש לבצע שיטת נורמליזציה נוספת, כגון בידוד וכימות חלבונים או DNA.

figure-protocol-4
איור 5: תמונות מייצגות מתוכנת ההדמיה המשמשת לנורמליזציה של נתונים מהבדיקה. (B) תמונה פלואורסצנטית תפורה המציגה גרעינים מוכתמים ב-Hoechst של אוסטאובלסטים המשמשים לספירת מספרי תאים כדי לנרמל את תוצאות הבדיקה. אלה הם אוסטאובלסטים לאחר 7 ימים של התמיינות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

  1. לאחר השלמת הבדיקה, סרוק את ברקוד הצלחת עם קורא הברקוד הידני. אם הצלחת כבר צולמה, היא לא תדרוש שם חדש.
  2. בחר פלואורסצנציה וספירת תאים, מקם את לוחית התא על מחזיק המגש ולחץ על סגור מגש.
  3. בחלון רכישת התמונה, בחר סרוק את כל הבארות כדי להתחיל בהדמיה. הדמיה פלואורסצנטית אורכת כ-15-20 דקות כדי לסרוק את הצלחת כולה. שימו לב לסימן הסימון הירוק המציין כי הסריקה הושלמה.
  4. סקור את התמונות הפלואורסצנטיות ואת ספירת התאים ביישום ההדמיה וההדמיה של התאים על ידי לחיצה אקראית על כמה מהבארות.
    הערה: קיימת אפשרות להציג תאים שנספרו בפינה השמאלית התחתונה של המסך. אפשרות זו מציגה תמונה עם מסיכה, המסמנת את האובייקטים שנספרו.
  5. לאחר השלמת ההדמיה הפלואורסצנטית, ייצא את התמונות להפניות נוספות.
  6. לאחר השלמת ההדמיה וספירת התאים, פתח את קובץ התוצאות ולחץ על נרמל. מסך הנורמליזציה ייתן את פריסת הלוחית ואפשרות לייבא את ספירת התאים.
  7. לחץ על ייבוא ובחר הגש בקשה לתוכנת שולחן העבודה כדי לנרמל את הבדיקה באמצעות ספירת תאים באופן אוטומטי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

figure-results-1
איור 6: גרפים מייצגים לבדיקות המבוצעות באופן שגרתי כדי להבין את הפרופיל הביו-אנרגטי התאי של קבוצת הביקורת לעומת קבוצת הטיפול עם שגיאות התקן המתאימות שלהם. העלילה מייצגת את הגליקוליזה (ECAR) לעומת הנשימה המיטוכונדריאלית (OCR) של הביקורת לעומת שתי קבוצות טיפול (n = 3). הזרקת אוליגומיצין A ו- FCCP גורמי עקה מגבירה את הפעילות הבס...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מנתח השטף המטבולי של התא בזמן אמת יכול לשמש כדי לחקור את האנרגטיקה התאית בתנאים שונים. הפרוטוקול ממחיש את הבידוד היעיל של BMSCs, תאי התרבות בלוחות תרבית תאים מתאימים, ואת התמיינותם לאוסטאובלסטים בוגרים, אשר יכולים לשמש לבדיקות שונות באמצעות מנתח השטף החוץ-תאי. יתר על כן, השלבים הקריטיים של בדיקת שטף מטבולי של תאים בזמן אמת, כולל הידרציה של מחסניות חיישנים, טעינת יציאות ההזרקה, ביצוע הבדיקה, נורמליזציה של הנתונים וניתוח נתונים, מוסברים גם הם בפירוט. בדיקה זו מעריכה את התגובה של אוסטאובלסטים למעכבים מיטוכונדריאליים וגליקול...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) המכון הלאומי לדלקת פרקים ומחלות שריר-שלד ועור (NIAMS) מענק AR072123 והמכון הלאומי להזדקנות (NIA) מענק AG069795 (ל- ERR).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.25% טריפסין EDTAסיגמא-אולדריץ'T4049
2-ציאנו-3-(1-פניל-1H-אינדול-3-יל)-2-פרופנואית חומצהסיגמא - אולדריץ'PZ0160UK5099
אנטימיצין Aסיגמא - אולדריץ'A8674
חומצה אסקורביתסיגמא-אולדריץ'A4544-100G
ביס-2-(5-פנילאצטמידו-1,3,4-תיאדיאזול-2-יל)אתיל סולפידסיגמא - AldrichSML0601BPTES
קרבוניל ציאניד 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazoneSigma - AldrichC2920FCCP
Cytation 5 קורא הדמיהBioTekN/AMicroplate imager
Etomoxir נתרן מלחהידרט סיגמא - AldrichE1905
Hoechst 33342 תמיסה (20 מ"מ)Thermo Scientific62249
אינסוליןסיגמא - AldrichI6634
חומצה אולאית-אלבומין מסרום בקרסיגמא - AldrichO3008
אוליגומיצין A - 5 מ"גסיגמא - Aldrich75351
רוטנוןסיגמא - AldrichR8875-1G
Seahorse XF 1.0 M תמיסת גלוקוזAgilent Technologies103577-100
Seahorse XF 100mM פירובט פתרוןAgilent Technologies103578-100
Seahorse XF 200mM תמיסת גלוטמיןAgilent Technologies103579-100
Seahorse XF DMEM mediaAgilent Technologies103575-100DMEM בדיקת מדיה eith 5mM HEPES, pH 7.4, ללא פנול אדום, נתרן ביקרבונט, גלוקוז, פירובט ו-L-גלוטמין
Seahorse XFe96Analyzer Agilent TechnologiesS7800Bמנתח שטף מטבולי בזמן אמת
Seahorse XFe96 FluxPakAgilent Technologies102416-100כולל מחסניות חיישן XFe96, מיקרו-לוחות תרבית תאים ותמיסת קליברנט Seahorse XF
תוכנת הדמיית התא 1.1.0.11 AgilentTechnologies - תוכנת BioTek
Wave 2.6.1Agilent Technologies
β-glycerol phosphateסיגמא-אולדריץ'G9422-50G

מקורות

  1. Rodan, G. A. Bone homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (23), 13361-13362 (1998).
  2. Nakahama, K. I. Cellular communications in bone homeostasis and repair. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (23), 4001-4009 (2010).
  3. Kim, J. M., Lin, C., Stavre, Z., Greenblatt, M. B., Shim, J. H. Osteoblast-osteoclast communication and bone homeostasis. Cells. 9 (9), 2073(2020).
  4. Gao, J., et al. SIRT3/SOD2 maintains osteoblast differentiation and bone formation by regulating mitochondrial stress. Cell Death and Differentiation. 25 (2), 229-240 (2018).
  5. Baron, R. Molecular mechanisms of bone resorption by the osteoclast. The Anatomical Record. 224 (2), 317-324 (1989).
  6. Tian, L., Rosen, C. J., Guntur, A. R. Mitochondrial Function and Metabolism of Cultured Skeletal Cells. Methods in Molecular Biology. 2230, Clifton, N.J. 437-447 (2021).
  7. Zanotelli, M. R., et al. Regulation of ATP utilization during metastatic cell migration by collagen architecture. Molecular Biology of the Cell. 29 (1), 1-9 (2018).
  8. Gonzales, S., Wang, C., Levene, H., Cheung, H. S., Huang, C. Y. C. ATP promotes extracellular matrix biosynthesis of intervertebral disc cells. Cell and Tissue Research. 359 (2), 635-642 (2015).
  9. Kruse, N. J., Bornstein, P. The metabolic requirements for transcellular movement and secretion of collagen. Journal of Biological Chemistry. 250 (13), 4841-4847 (1975).
  10. Rendina-Ruedy, E., Guntur, A. R., Rosen, C. J. Intracellular lipid droplets support osteoblast function. Adipocyte. 6 (3), 250-258 (2017).
  11. Sinnott-Armstrong, N., et al. A regulatory variant at 3q21.1 confers an increased pleiotropic risk for hyperglycemia and altered bone mineral density. Cell Metabolism. 33 (3), 615-628 (2021).
  12. Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).
  13. Borle, A. B., Nichols, N., Nichols, G. Metabolic studies of bone in vitro: I. Normal bone. Journal of Biological Chemistry. 235, 1206-1210 (1960).
  14. Borle, A. B., Nichols, N., Nichols, G. Metabolic studies of bone in vitro: II. The metabolic patterns of accretion and resorption. Journal of Biological Chemistry. 235, 1211-1214 (1960).
  15. Adamek, G., Felix, R., Guenther, H. L., Fleisch, H. Fatty acid oxidation in bone tissue and bone cells in culture. Characterization and hormonal influences. The Biochemical Journal. 248 (1), 129-137 (1987).
  16. Frey, J. L., et al. Wnt-Lrp5 signaling regulates fatty acid metabolism in the osteoblast. Molecular and Cellular Biology. 35 (11), 1979-1991 (2015).
  17. Romero, N., Rogers, G., Neilson, A., Dranka, B. P. Quantifying cellular ATP production rate using agilent seahorse XF technology. , (2018).
  18. vander Windt, G., Chang, C., Pearce, E. Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse Extracellular Flux Analyzer. Current Protocols in Immunology. 113, 1(2016).
  19. Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (117), e54918(2016).
  20. Noel, P., et al. Preparation and metabolic assay of 3-dimensional spheroid co-cultures of pancreatic cancer cells and fibroblasts. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (126), e56081(2017).
  21. Nicholls, D., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2511(2010).
  22. Sakamuri, S. S. V. P., et al. Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 Analyzer: applications for aging research. GeroScience. 40 (3), 347-356 (2018).
  23. What are the advantages of using Seahorse XF technology. , Available from: https://www.agilent.com/en/support/cell-analysis/advantages-of-using-xf-tech (2018).
  24. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. O. Review: Quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. Journals of Gerontology - Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  25. XF cell energy phenotype test. , Available from: https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740884 (2021).
  26. Leung, D. T. H., Chu, S. Measurement of oxidative stress: Mitochondrial function using the seahorse system. Methods in Molecular Biology. 1710, Clifton, N.J. 285-293 (2018).
  27. XF ATP rate assay. , Available from: https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740889 (2021).
  28. XF cell mito stress test. , Available from: https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740885 (2021).
  29. XF cell mito fuel flex test. , Available from: https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740888 (2021).
  30. Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors from mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56750(2018).
  31. Wei, J., et al. Glucose uptake and Runx2 synergize to orchestrate osteoblast differentiation and bone formation. Cell. 161 (7), 1576-1591 (2015).
  32. Zoch, M. L., Abou, D. S., Clemens, T. L., Thorek, D. L. J., Riddle, R. C. In vivo radiometric analysis of glucose uptake and distribution in mouse bone. Bone Research. 4, 16004(2016).
  33. Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).
  34. Kam, Y., Jastromb, N., Clayton, J., Held, P., Dranka, B. Normalization of agilent seahorse XF data by in-situ cell counting using a BioTek cytation 5 application note. , (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

קצב ייצור ATPתאי סטרומה של מחית השגרהוביבוא של אוסטאובלסטיםנשימה מיטוכונדריאליתקצב גליקוליזהאנרגטיקה תאיתXF ATP Rate Assayדימיון פלואורסצנטי
שימוש במנתח שטף מטבולי של תאים בזמן אמת לניטור ביו-אנרגיה של אוסטאובלסט
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.