מאמר שיטה

Drosophila melanogaster פרוטוקול הזרקת זחלים

DOI:

10.3791/63144

⸱

19 באוקטובר 2021

 ,  , 
1Infection and Innate Immunity Laboratory, Department of Biological Sciences, Institute for Biomedical Sciences, The George Washington University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זבובים בוגרים של Drosophila melanogaster נוצלו בהרחבה כאורגניזמים מודל כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס התגובות החיסוניות המולדות של המארחים ואסטרטגיות זיהום מיקרוביאליות. כדי לקדם את שלב הזחלים D. melanogaster כמערכת מודל נוספת או חלופית, מתוארת טכניקת הזרקת זחלים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השימוש במודלים לא קונבנציונליים לחקר חסינות מולדת וארסיות פתוגן מספק חלופה בעלת ערך למודלים של יונקים, אשר יכול להיות יקר ולהעלות סוגיות אתיות. דגמים לא קונבנציונליים הם זולים לשמצה, קלים לטיפול ותרבות, ואינם תופסים הרבה מקום. הם נוחים גנטית ובעלי רצפי גנום שלמים, והשימוש בהם אינו מציג שיקולים אתיים. זבוב הפירות Drosophila melanogaster, למשל, סיפק תובנות נהדרות על מגוון רחב של התנהגות, התפתחות, חילוף חומרים, ומחקר חסינות. ליתר דיוק, D. melanogaster זבובים בוגרים וזחלים להחזיק כמה תגובות הגנה מולדות המשותפות עם בעלי חוליות. המנגנונים המסדירים את התגובות החיסוניות נחשפו בעיקר באמצעות מחקרים גנטיים ומולקולריים במודל D. melanogaster . כאן מסופקת טכניקת הזרקת זחלים חדשנית, אשר תקדם עוד יותר חקירות של תהליכים חיסוניים מולדים בזחלי D. melanogaster ולחקור את הפתוגנזה של מגוון רחב של זיהומים מיקרוביאליים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila melanogaster כבר מנוצל מאוד במחקר ביולוגי וביו-רפואי במשך כמה עשורים, כמו המערך המתוחכם של כלים גנטיים ומולקולריים התפתחו בהתמדה לניתוח של מגוון רחב של מחקרים1,2,3,4. ההיבטים השמורים אבולוציונית של התפתחות, הומאוסטזיס וחסינות מולדת ב- D. melanogaster הפכו אותו לאורגניזם מודל בעל ערך לחקר מחלות אנושיות וחרקים שונות5,6. ראוי לציין, את התפקיד הבסיסי של מודל D. melanogaster לחקר חסינות כבר בא לידי ביטוי במידה רבה במחקרים זבובים למבוגרים. עם זאת, D. melanogaster זחלים מחקרים תרמו גם לידע הנוכחי בעיקר חקר תגובות חיסוניות הסלולר, במיוחד עבור צרעות וזיהומים נמטודות המתרחשים דרך קוטיקל חרק7,8,9,10. זחלי Drosophila melanogaster מחזיקים בשלושה סוגים שונים של תאי דם, הנקראים ביחד המוציטים: פלסמטוציטים, תאי קריסטל ולאמלוציטים11,12,13. תאים אלה יכולים להרכיב מערך של תגובות חיסוניות כאשר זחלי D. melanogaster נגועים בפתוגנים כגון חיידקים, פטריות, וירוסים וטפילים14,15,16. התגובות החיסוניות התאיות כוללות בליעה ישירה (פאגוציטוזיס) של מולקולות קטנות או חיידקים, מלניזציה, אנקפסולציה של פתוגנים גדולים יותר כגון ביצי טפילים, וייצור של מינים חמצן תגובתי (ROS) וסינתיסייזרים תחמוצת החנקן (NOS)17,18,19.

לעומת זאת, פחות מחקרים פורסמו על השימוש במודל הזחל D. melanogaster כדי לנתח תגובות חיסוניות הומוריסטיות. זה בעיקר בשל היישום של בדיקות האכלה לזיהום אוראלי של זחלי D. melanogaster ומספר אתגרים הקשורים זחלים microinjecting כולל טיפול מדויק של זחלים ושימוש נכון של microneedle, במיוחד במהלך חדירה20,21. לפיכך, הידע המוגבל של זיהום זחלים וקשיים טכניים (כלומר, תמותה גבוהה) הפכו לעתים קרובות את מודל הזחל D. melanogaster קשה לשימוש. למודל זחל יהיה פוטנציאל לזהות מנגנונים מולקולריים חדשניים שיספקו תובנות נוספות על אינטראקציות מארח-פתוגן ועל אינדוקציה של תגובות חיסוניות מולדות מארח ספציפיות נגד זיהומים פתוגניים.

כאן פרוטוקול פשוט ויעיל שניתן להשתמש בו כדי להזריק D. melanogaster זחלים עם פתוגנים שונים, כגון חיידקים, מתואר בפירוט. בפרט, D. זחלי מלנוגאסטר משמשים לזריקות עם הפתוגן האנושי Photorhabdus asymbiotica והחיידקים הלא פתוגניים Escherichia coli. שיטה זו יכולה לשמש למניפולציה וניתוח של התגובות החיסוניות של D. melanogaster לזיהומים מיקרוביאליים שונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. גידול זבובים

הערה: מחזור החיים של D. melanogaster מחולק לארבעה שלבים: עובר, זחל, גולם ומבוגר. זמן הייצור עם תנאי גידול אופטימליים במעבדה (כ -25 °C (~ 25 °C (,60% לחות, ומזון מספיק) הוא כ 10 ימים מביצית מופרית למבוגר מעוקל. הנקבות מניחות ~ 100 עוברים ליום, ועובר נמשך כ 24 שעות ביממה. הזחלים עוברים שלושה שלבים התפתחותיים (instars; L1-L3) בתוך ~ 4 ימים (L1 ו- L2: 24 שעות, ו- L3: 48 שעות). זחלי האינסטאר הראשונים מתחילים להיזון מיד על פני המדיום. זחלי אינסטאר שניים מתחפרים לתוך המדיום, בעוד זחלי אינסטאר שלישי לעזוב את המדיום ולשוטט במעלה קירות הבקבוקון, מחפש מקום pupariate עבור 24-48 שעות. קו D. melanogaster המשמש עבור פרוטוקול זה הוא אורגון R (FBsn0000276).

  1. הוסיפו מזון יבש המכיל תזונה מבוססת קמח תירס לבקבוקון פוליסטירן צר (25 מ"מ על 95 מ"מ) לנפח של 1/5 עד 2/5. לאחר מכן להוסיף 9 מ"ל של מים ולאפשר בקבוקון לשבת במשך 1 דקה עד הדיאטה הוא hydrated לחלוטין.
  2. מוסיפים כ -10 גרגירים של שמרי אופה יבשים לבקבוקון ומניחים תערובת של לפחות 20 זבובים בוגרים זכרים ונקבות שזה עתה הופיעו.
  3. דגירה הבקבוקון ב 25 °C (50 °F) על אור 12:12 שעות ביממה: מחזור פוטופריודי כהה.
  4. כדי להבטיח את התקדמות מחזור החיים, בדוק את בקבוקוני הזבוב מדי יום ורשום את שלבי ההתפתחות הראשוניים.

2. בחירת זחלים לזיהום

  1. בחרו זחלים עם מברשת צבע עדינה (שיער הגמלים הוא הטוב ביותר) ברגע שהם מגיעים לשלב האינסטאר השלישי הנודד ביום שבו יבוצע הזיהום (איור 1).
  2. לשטוף את הזחלים שנבחרו עם הפתרון של רינגר (100 mM NaCl, 1.8 מ"מ KCl, 2 מ"מ CaCl2, 1 מ"מ MgCl2, 5 מ"מ HEPES pH 6.9) בצלחת פטרי קטנה (60 מ"מ x 15 מ"מ) עם הסרה מהבקבוקון המקורי שלהם23.
  3. מניחים את הזחלים על נייר סינון (קוטר 150 מ"מ) שנרטב מעט עם כ-5 מ"ל של תמיסת רינגר בצלחת פטרי (100 מ"מ x 15 מ"מ) (איור 2A).
  4. הוסיפו כ-1 מ"ל של התמיסה של רינגר מדי יום לנייר הסינון לפי הצורך כדי למנוע יובש והתייבשות זחלים.

3. הכנה חיידקית

  1. תרבות P. חיידקי אסימביוטיקה על לוריא ברטאני (LB) אגר מדיה ב 28 °C (60 °F) עבור 48 שעות.
  2. השתמש בארון ברמת בטיחות ביולוגית 2 כדי להעביר מושבה אחת של P. asymbiotica כדי לחסן תרבית נוזלית ב 10 מ"ל של מדיה LB.
  3. דגירה על תרבית נוזלית P. אסימביוטיקה בן לילה ב 28 °C (50 °F) בשייקר סיבובי להגדיר 220 סל"ד.
  4. תרבות E. coli חיידקים באופן דומה, אבל לבצע את הצמיחה הראשונית על אגר מדיה ודגרה תרבות נוזלית ב 37 °C (50 °F) לילה.
  5. צנטריפוגה כל תרבית חיידקים לילה במשך 3 דקות ב 13,000 x g ו 4 °C (60 °F).
  6. להשליך את supernatant ולשטוף את כדורי חיידקים וכתוצאה מכך שלוש פעמים עם 10 מ"ל של PBS סטרילי.
  7. צנטריפוגה הכדורים שוב במשך 3 דקות ב 13,000 x g ו 4 °C (60 °F).
  8. לדלל כל גלולה עם PBS סטרילי כדי להתאים את ריכוזי החיידקים לצפיפות האופטית (600 ננומטר) של 0.25 עבור P. אסימביוטיקה ו 0.015 עבור E. coli, אשר תואמים 100-300 מושבה להרכיב יחידות לכל זחל של כל הכנה חיידקית, באמצעות ספקטרופוטומטר.

4. הכנת מזרק

  1. הכן נימים באמצעות צינורות נימי זכוכית בגודל 3.5 אינץ' ומושך מיקרופיפט. הגדר את המכשיר כדלקמן: חום: 580; משיכה: 143; מהירות: 25; עיכוב: 1; לחץ: 500.
  2. השתמשו במלקחיים בינוניים משוננים ישרים כדי לפתוח את נימי הזכוכית במידה שתאפשר את אספקת הטיפולים הניסיוניים תוך גרימת נזק מינימלי לזחלים (איור 2B). כדי לייעל הליך זה תוך כדי תרגול זריקות, השתמש בפתרון Trypan Blue (לדלל את המניה 0.4% עם PBS ל 0.2%) כדי לעקוב בקלות אחר דליפה בעת הזרקה ואת ההישרדות של הזחלים הכחולים.
  3. מלא את הנימים בשמן מינרלי באמצעות מזרק פלסטיק, חד פעמי 20 מ"ל עם מחט hypodermic (22 גרם, 25 מ"מ אורך).
  4. הגדירו את מזרק הננו-ליטר ופלטו את השמן מהנימיל (איור 2C).
  5. מלא את הנימים עם ההכנה החיידקית הרצויה להזרקה. קח את הפתרון מטיפה (~ 20 μL) כי הוא ממוקם על parafilm. בפרוטוקול זה, 50.2 nL של שתי מניות חיידקים הוזרקו.

5. הזרקת זחלים

  1. מרדים D. melanogaster זחלים באמצעות פחמן דו חמצני במשך ~ 2 דקות לפני ההליך.
  2. מעבירים בעדינות את הזחלים המרדים לנייר סינון שנרטב בתמיסה של רינגר כהכנה להזרקה תחת סטריאומיקרוסקופ. הזחלים יהיו רדומים או פסיביים בשלב זה.
  3. כדי להזריק זחלים, הפעילו לחץ איתן על הצד הגבי של הקצה האחורי (הצריחיות של קנה הנשימה ניכרות בקצה האחורי לעומת חלקי פה שחורים בקצה הקדמי) באמצעות מלקחיים (איור 2D).
  4. הכנס את המחט אופקית לכיוון הקצה האחורי של הזחלים, ליד הציפורן. זריקה מוצלחת לא תגרום לדליפה של התמיסה המוזרקת מהזחלים (איור 3).
  5. הסר את המלקחיים ששימשו להפעלת לחץ על זנב הזחלים לפני משיכת המחט. אם לא הוסר תחילה, המלקחיים יכולים להכריח המולימפה ו/או את המעי לצאת מהזחלים מאתר הפצע.
  6. להדביק את המספר המתאים של זחלים עבור המחקר המבוצע. בפרוטוקול המסוים הזה, 20 זחלים לכל מצב ניסיוני הוזרקו.
  7. באמצעות מלקחיים, מעבירים בעדינות את הזחלים המוזרקים לנייר סינון לח נפרד בצלחת פטרי (10 זחלים למנה) או בקבוקון מזון (בהתאם למטרת הניסוי) כדי לאפשר התאוששות.
  8. מניחים את מנות פטרי או בקבוקוני מזון באינקובטור ב 25 °C (50 °F). אם הזחלים נשמרים בצלחת פטרי, הוסיפו את הפתרון של רינגר לפי הצורך כדי למנוע ייבוש.

6. רישום הישרדות/תמותה

  1. רשום את מספר הזחלים המתים והחיים של ד. מלנוגסטר על פי נקודות הזמן הניסיוניות שנקבעו. זחלים חיים ימשיכו להתפתח לגולם ולמבוגרים.
  2. השתמש בתוכניות סטטיסטיות, כגון פריזמה, כדי להזין את נתוני ההישרדות /התמותה הגולמיים, לנתח אותם באמצעות מבחן דרגת היומן (Mantel-Cox) ולייצג את התוצאות במספרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאשר מבוצעים כראוי, זריקות של D. melanogaster זחלים להראות אפקט ספציפי חיידק. נתוני ההישרדות נאספו במספר נקודות זמן בעקבות זיהומים של P. asymbiotica (זן ATCC43943), E. coli (זן K12) ו- PBS (איור 4). בעוד D. melanogaster זחלים רגישים P. א-סימביוטיקה, אשר פוגע הישרדות במהירות, זחלים מוזרק עם E. coli או פקדי PBS להפגין הישרדות ממושכת24,25,26. במיוחד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila melanogaster הוא בין המודלים החשובים ביותר, מניפולציה ניסיונית המשמשים לחקירות של חסינות מולדת ופתוגנזה של זיהומים מיקרוביאליים שונים. הסיבה לכך היא מחזור החיים הפשוט והמהיר שלה, תחזוקה פשוטה במעבדה, גנטיקה אבולוציונית מבוססת היטב וארגז כלים גנטי מגוון. שיטות קודמות של D. melanogaster זחלים זריקות, כגון באמצעות מכשיר מיקרופלואידי היברידי או micromanipulator Narishige, דורשים ציוד מיוחד מאוד והוא יכול להיות יקר 21,27. בפרוטוקול הנוכחי,...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לחברי המחלקה למדעי הביולוגיה באוניברסיטת ג'ורג' וושינגטון (GWU) על הקריאה הביקורתית של כתב היד. GT נתמכה באמצעות מלגת קיץ של הרלן מ- GWU. כל הדמויות הגרפיות נעשו באמצעות BioRender.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אוכל זבוב B (מתכון בלומינגטון)LabExpress7001-NVFood B, בבקבוקונים צרים, 100 בקבוקונים/מגש
100 x 15, צלחות פטרי מונו ניתנות לערמה מלאהVWR25384-342קוטר 100 x 15 מ"מ
60 x 15, צלחות פטרי מונו ניתנות לערמה מלאהVWR25384-092קוטר 60 x 15 מ"מ
נימי זכוכיתVWR53440-186
כיתה 1 נייר סינון איכותי כיתה סטנדרטית, מעגלVWR28450-150קוטר 150 מ"מ
תרבית מעבדה Class II סוג A2 ארון בטיחות ביולוגיESCOLA2-4A2-E
LB אגרפישר סיינטיפיקBP1425-500LB אבקת טוחן אגר 500 גרם
מרק LBפישר סיינטיפיקBP1426-500LB אבקת טוחן מרק 500 גרם
שמןמינרליאלפא אעזר, תרמו פישר סיינטיפיק31911-A1
NanoDrop 2000/2000c ספקטרופוטומטרתרמו פישר סיינטיפיקND-2000C
Nanoject III מזרק ננוליטר לתכנותדראמונד3-000-207
בקבוקוני דרוזופילה צרים, פוליסטירןג'נסי סיינטיפיק32-109
מחטים, היפודרמיVWR89219-31622 גרם, 25 מ"מ
הדור הבא של חולץ מיקרופיפטותמכשירים מדויקיםבעולם SU-P1000
PBSVWR97062-732מאגר טבליות PBS כיתה ביוטק 200tab
פריזמהGraphPadגרסה 8
מזרקים - פלסטיק, חד פעמיVWR76124-65220 מ"ל
טריפן כחולסיגמא-אולדריץ'T8154

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takehana, A., et al. Overexpression of a pattern-recognition receptor, peptidoglycan-recognition protein-LE, activates imd/relish-mediated antibacterial defense and the prophenoloxidase cascade in Drosophila larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (21), 13705-13710 (2002).
  2. Senger, K., Harris, K., Levine, M. GATA factors participate in tissue-specific immune responses in Drosophila larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (43), 15957-15962 (2006).
  3. Kenmoku, H., Hori, A., Kuraishi, T., Kurata, S. A novel mode of induction of the humoral innate immune response in Drosophila larvae. Disease Models & Mech.anisms. 10, 271-281 (2017).
  4. Kenney, E., Hawdon, J. M., O'Halloran, D., Eleftherianos, I. Heterorhabditis bacteriophora excreted-secreted products enable infection by Photorhabdus luminescens through suppression of the Imd pathway. Frontiers in Immunology. 10, 2372(2019).
  5. Cherry, S., Silverman, N. Host-pathogen interactions in Drosophila: New tricks from an old friend. Nature Immunology. 7 (9), 911-917 (2006).
  6. Younes, S., Al-Sulaiti, A., Nasser, E., Najjar, H., Kamareddine, L. Drosophila as a model organism in host-pathogen interaction studies. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 214(2020).
  7. Kenney, E., Hawdon, J. M., O'Halloran, D. M., Eleftherianos, I. Secreted virulence factors from Heterorhabditis bacteriophora highlight its utility as a model parasite among Clade V nematodes. International Journal for Parasitology. 51 (5), 321-325 (2021).
  8. Castillo, J. C., Reynolds, S. E., Eleftherianos, I. Insect immune responses to nematode parasites. Trends in Parasitology. 27 (12), 537-547 (2011).
  9. Leitão, A. B., Bian, X., Day, J. P., Pitton, S., Demir, E., Jiggins, F. M. Independent effects on cellular and humoral immune responses underlie genotype-by-genotype interactions between Drosophila and parasitoids. PLoS Pathogens. 15 (10), 1008084(2019).
  10. Ramroop, J. R., Heavner, M. E., Razzak, Z. H., Govind, S. A. Parasitoid wasp of Drosophila employs preemptive and reactive strategies to deplete its host's blood cells. PLoS Pathogens. 17 (5), 1009615(2021).
  11. Vlisidou, I., Wood, W. Drosophila blood cells and their role in immune responses. The FEBS Journal. 282 (8), 1368-1382 (2015).
  12. Harnish, J. M., Link, N., Yamamoto, S. Drosophila as a model for infectious diseases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2724(2017).
  13. Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annual Reviews of Immunology. 25, 697-743 (2007).
  14. Garriga, A., Mastore, M., Morton, A., Pino, F. G., Brivio, M. F. Immune response of Drosophila suzukii larvae to infection with the nematobacterial complex Steinernema carpocapsae-Xenorhabdus nematophila. Insects. 11 (4), 210(2020).
  15. Trienens, M., Kraaijeveld, K., Wertheim, B. Defensive repertoire of Drosophila larvae in response to toxic fungi. Molecular Ecology. 26 (19), 5043-5057 (2017).
  16. Tafesh-Edwards, G., Eleftherianos, I. Drosophila immunity against natural and nonnatural viral pathogens. Virology. 540, 165-171 (2020).
  17. Gold, K. S., Brückner, K. Macrophages and cellular immunity in Drosophila melanogaster. Seminars in Immunology. 27 (6), 357-368 (2015).
  18. Dudzic, J. P., Kondo, S., Ueda, R., Bergman, C. M., Lemaitre, B. Drosophila innate immunity: regional and functional specialization of prophenoloxidases. BMC Biology. 13, 81(2015).
  19. Honti, V., Csordás, G., Kurucz, É, Márkus, R., Andó, I. The cell-mediated immunity of Drosophilamelanogaster: hemocyte lineages, immune compartments, microanatomy and regulation. Developmental and Comparative Immunology. 42 (1), 47-56 (2014).
  20. Siva-Jothy, J. A., Prakash, A., Vasanthakrishnan, R. B., Monteith, K. M., Vale, P. F. Oral bacterial infection and shedding in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57676(2021).
  21. Zabihihesari, A., Hilliker, A. J., Rezai, P. Localized microinjection of intact Drosophila melanogaster larva to investigate the effect of serotonin on heart rate. Lab on a Chip. 20 (2), 343-355 (2020).
  22. Flatt, T. Life-history evolution and the genetics of fitness components in Drosophila melanogaster. Genetics. 214 (1), 3-48 (2020).
  23. Ciche, T. A., Sternberg, P. W. Postembryonic RNAi in Heterorhabditis bacteriophora: a nematode insect parasite and host for insect pathogenic symbionts. BMC Developmental Biology. 7, 101(2007).
  24. Joyce, S. A., Watson, R. J., Clarke, D. J. The regulation of pathogenicity and mutualism in Photorhabdus. Current Opinion in Microbiology. 9 (2), 127-132 (2006).
  25. Yang, G., Waterfield, N. R. The role of TcdB and TccC subunits in secretion of the Photorhabdus Tcd toxin complex. PLoS Pathogens. 9 (10), 1003644(2013).
  26. Shokal, U., et al. Effects of co-occurring Wolbachia and Spiroplasma endosymbionts on the Drosophila immune response against insect pathogenic and non-pathogenic bacteria. BMC Microbiology. 16, 16(2016).
  27. Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Development Genes and Evolution. 214 (11), 575-578 (2004).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים