הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

איתור פלסמודיום ספורוזואיטים ביתושי אנופלס באמצעות בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים

2.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63158

⸱

30 בספטמבר 2021

 ,  ,  ,  , 
1Mahidol Vivax Research Unit, Faculty of Tropical Medicine, Mahidol University, 2Department of Molecular Tropical Medicine & Genetics, Faculty of Tropical Medicine, Mahidol University, 3Department of Internal Medicine, Morsani College of Medicine, University of South Florida, 4Mahidol Vivax Research Unit, Faculty of Tropical Medicine, Mahidol University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר בדיקת אימונוסורבנט המקושרת לאנזים סנדוויץ' כדי לזהות ספורוזואיטים של בלוטת הרוק ביתושים. באמצעות נוגדנים חד-שבטיים הזמינים בקלות, השיטה מאפשרת זיהוי חסכוני ובתפוקה גבוהה של יתושים הנושאים פלסמודיום פלציפרום או פלסמודיום ויוואקס. השיטה מתאימה לחקר העברת מלריה, כולל סקרים וקטוריים.

תקציר

פלסמודיום ספורוזואיטים הם השלב הזיהומי של טפילי מלריה המדביקים בני אדם. הספורוזואיטים השוכנים בבלוטות הרוק של נקבות יתושי אנופלס מועברים לבני אדם באמצעות עקיצות יתושים במהלך הזנת הדם. נוכחותם של ספורוזואיטים בבלוטות הרוק של היתוש מגדירה אפוא את זיהומיות היתושים. כדי לקבוע אם יתוש אנופלס נושא ספורוזואיטים של פלסמודיום , שיטת בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA) הייתה הכלי הסטנדרטי לזיהוי חלבון פלסמודיום סירקוספוזואיט (CSP), חלבון פני השטח העיקרי של הספורוזואיטים. בשיטה זו, הראש יחד עם בית החזה של כל יתוש מופרד מהבטן, הומוגני, נתון ELISA סנדוויץ 'כדי לזהות את נוכחותו של CSP ספציפי פלסמודיום falciparum וכל אחד משני תת סוגים, VK210 ו VK247, של פלסמודיום vivax. שיטה זו שימשה לחקר העברת מלריה, כולל הדינמיקה העונתית של זיהום יתושים והמינים של וקטורי המלריה העיקריים באתרי המחקר.

מבוא

פלסמודיום ספורוזואיטים הם השלב המדבק של טפילי המלריה ביתושים. הספורוזואיטים מועברים לבני אדם באמצעות עקיצות יתושים. אצל היתוש, הספורוזואיטים נוצרים לראשונה בתוך הביציות שעל דופן המעי. ברגע שהם מוכנים, הם משוחררים לתוך ההמוקול ונוסעים לבלוטות הרוק של היתושים. שם, הם מתבגרים ונעשים מוכנים להעברה לבני אדם במהלך הזנת הדם. בבני אדם, sporozoites מופקדים בדרמיס. לאחר מכן, הם נכנסים לכלי הדם ונוסעים לאורך מחזור הדם כדי להגיע לכבד כדי ליצור זיהום בהפטוציטים 1,2.

שלוש שיטות שונות שימשו כדי לקבוע זיהום sporozoite של בלוטות הרוק יתושים. השיטה הראשונה היא דיסקציה של בלוטות הרוק ואחריה בדיקה ישירה של sporozoites תחת מיקרוסקופ אור. שיטה זו היא תקן הזהב לזיהוי וכימות ספורוזואיטים בבלוטות רוק יתוש אנופלס 3. עם זאת, זה דורש טכנאי מיומן היטב הן בדיסקציה והן בבדיקה מיקרוסקופית. יתר על כן, לא ניתן להשתמש בו כדי לקבוע מיני פלסמודיום ותת-הקלדה CSP (עבור P. vivax)4,5. השיטה השנייה משתמשת בתגובת שרשרת פולימראז (PCR) כדי לזהות DNA פלסמודיום בחלק העליון של גוף היתוש6. בהתחשב בספציפיות של PCR, שני המינים ותת-הקלדה של הטפיל אפשריים 7,8,9,10. למרות PCR משמש יותר ויותר, זה דורש ציוד יקר יחסית צוות מאומן היטב. השיטה האחרונה, ELISA לזיהוי חלבון פלסמודיום ספציפי circumsporozoite (CSP), כבר עמוד התווך במשך שלושה עשורים 11,12,13. CSP קיים הן sporozoites ביצית ו sporozoites בלוטת הרוק sporozoites12,14. באמצעות נוגדנים ספציפיים, שיטה זו מאפשרת זיהוי מיני פלסמודיום ותת-הקלדה CSP של P. vivax sporozoites. הרציונל מאחורי בדיקה זו הוא הדרישה של בדיקה פשוטה בתפוקה גבוהה כדי לבחון מספר רב של יתושי בר כדי להבין את העברת המלריה (כלומר, לקבוע את שיעור הזיהום sporozoite).

לשיטת ELISA שני יתרונות מרכזיים על פני בדיקה מיקרוסקופית. ראשית, הוא מאפשר לחוקרים לשמור דגימות יתושים עד שהן מוכנות לעיבוד דגימות. שנית, ניתן להשתמש בשיטת ELISA כדי להבדיל בין מיני פלסמודיום באמצעות נוגדנים חד-שבטיים ספציפיים למין. בנוסף, ELISA יכולה להכיל מספר גדול יותר של דגימות יתושים, מה שמאפשר תפוקה גבוהה בהרבה15. בהשוואה ל- PCR, המזהה DNA ספורוזואיטים, הליך ELISA לוקח יותר זמן אך עולה פחות16. בדיקת ELISA המתוארת כאן פותחה כדי לקבוע את זיהום היתושים ולזהות בנפרד CSP של P. falciparum וכל אחת משתי גרסאות CSP של P. vivax, VK210 ו- VK247. שיטת ELISA זו שימשה במחקרים רבים כדי לקבוע את הדינמיקה העונתית של זיהום יתושים ולזהות את המינים של וקטורי המלריה העיקריים בשדה 12,13,17,18. כדי לבצע בדיקה זו, מעבדה סטנדרטית מצוידת בקורא לוחות ELISA מספיק.

הגישה הכוללת מסוכמת באיור 1. בכריך זה ELISA, הנוגדן החד-שבטי הראשוני (לכידה) (mAb) הספציפי לכל מין/תת-סוג פלסמודיום משמש תחילה לציפוי צלחת ELISA. כל צלחת מצופה ב- mAb לכידה יחיד. תפקידו של mAb הוא ללכוד את האנטיגן CSP המתאים בהומוגנאטים של היתושים. לאחר לכידת אנטיגן ושטיפת צלחות, נוגדן שני ספציפי ל- CSP המסומן בפרוקסידז משמש לזיהוי נוכחות CSP הקשור ל- mAb הלכידה. התגובה הכימית המזורזת על ידי peroxidase גורמת להתפתחות צבע בבארות חיוביות עבור CSP.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת ריאגנטים

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת רשימה של ציוד, ריאגנטים וחומרים מתכלים אחרים המשמשים בפרוטוקול זה ובטבלה 1 לקבלת רשימה של פתרונות והרכבם.

  1. לכידה ו mAbs מצומד peroxidase
    1. כדי לשחזר את mAb, להשהות מחדש את mAb lyophilized בתערובת 1: 1 של מים מזוקקים:גליצרול ב 0.5 מ"ג / מ"ל. הכינו אליציטוטים לפי הצורך כדי למנוע הפשרה חוזרת ונשנית בהקפאה, ואחסנו אותם בטמפרטורה של -20°C.
  2. מאגר חוסם (BB)
    1. הכן את מאגר החסימה על ידי המסת 5 גרם קזאין בדרגת ELISA ב 100 מ"ל של 0.1 N NaOH. הוסף 900 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) (ראה טבלה 1) כדי להביא את הנפח הסופי ל -1.0 ליטר.
    2. הוסף 0.02 גרם של פנול אדום כאינדיקטור והתאם את ה- pH ל- 7.4 עם HCl. אחסן BB ב -4 ° C עד שבוע אחד, או aliquot לתוך 50 מ"ל לאחסון לטווח ארוך ב -20 ° C.
  3. בקרות חיוביות
    1. כדי לשחזר את הבקרות החיוביות, יש לייבש מחדש את החלבונים שעברו ליופיליזציה על ידי הוספת 1,000 μL של BB. בצע aliquots של פתרונות הבקרה החיובית של המניות לפי הצורך, ואחסן אותם ב -20 ° C.
    2. עבור דילול סדרתי, לדלל עוד יותר כל בקרה חיובית לריכוז העבודה הסופי ב- BB כדלקמן: Pf, 2 pg/μL; Pv (VK210), 182 (pg/μL); Pv (VK247), 89 עמ' / μL.
      הערה: הריכוזים המדויקים של הבקרות החיוביות עשויים להשתנות ממגרש אחד למשנהו. עיין בדף המידע של המוצר לקבלת הריכוז המדויק הדרוש. ריכוזי הבקרה החיוביים, החל מריכוז העבודה לעיל, הם 2, 1, 0.5, 0.25, 0.13, 0.06 pg/μL עבור Pf; 182, 91, 46, 23, 11, 5.7 pg/μL עבור PV210; ו-89, 45, 22, 11, 5.6, 2.8 pg/μL PV247.
  4. בקרות שליליות
    הערה: ההדברה השלילית האידיאלית היא הומוגנט ראש-בית החזה של נקבות יתושי אנופלס שהוכנו באופן זהה לדגימות הבדיקה. עם זאת, BB יכול לשמש גם כשליטה שלילית.
    1. עם BB כבקרה שלילית, השתמש בסף ספיגה של פי 2 לקריאות חיוביות אמינות.

2. הכנת דגימת יתושים

  1. הפרידו את הראש ואת בית החזה של כל יתוש בוגר שנאסף מהבטן בעזרת סכין גילוח סטרילי. הניחו את הראש ובית החזה בצינור השחזה של צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל שכותרתו מראש. ראשי בריכה ו thoraces של עד 10 יתושים אם תרצה.
    הערה: להכנת דגימה, בדרך כלל, בלוטת הרוק של יתוש נגוע תנותח ותהיה נתונה ל- CS-ELISA. עם זאת, הראש ובית החזה של יתושים שנאספו יכולים לשמש גם לביצוע CS-ELISA ישירות (מבלי לנתח את בלוטות הרוק)12,13,19.
  2. הוסף 50 μL של חיץ טחינה (GB) לתוך כל צינור הומוגניזציה הדגימה עם מזיק נקי (שטף עם סבון). שטפו את המזיק המשומש עם 250 μL של GB לתוך הצינור המכיל את היתושים ההומוגניים לנפח סופי של ~300 μL.
  3. יש לשמור את הדגימה במקפיא (-20°C) עד לשימוש או להמשיך מיד לביצוע ELISA.

3. ספורוזויט אליסה

  1. מלא את גליון העבודה sporozoite ELISA (ראה חומר משלים 1). הכן צלחת ELISA אחת לכל CSP (Pf, Pv-210 או Pv-247).
  2. הכן את פתרון העבודה mAb ללכידה על ידי המסת הנוגדן ב- PBS: 4 מיקרוגרם / מ"ל Pf; 2 מיקרוגרם/מ"ל Pv-210; 2 מיקרוגרם/מ"ל של Pv-247. חשב את אמצעי האחסון הנדרשים על סמך תוספת של 5 מ"ל לצלחת. מערבלים את הפתרון בעדינות.
  3. פיפטה 50 μL של כל פתרון mAb עובד משלב 3.2 לתוך כל באר של צלחת ELISA. מכסים את הצלחת במכסה פלסטיק ודגרים במשך 30 דקות או לילה בטמפרטורת החדר.
  4. שאפו את תכולת הבאר וטפחו על הצלחת הפוכה על מגבות נייר לפחות 5 פעמים כדי להסיר את כל הנוזלים.
    הערה: אם מערכת שאיפה (שאיבת ואקום רב-ערוצית המחוברת לקצוות נקיים) אינה זמינה, זרוק את הנוגדנים לכיור ולאחר מכן הקש על הצלחת על מגבות נייר.
  5. מוסיפים 200 μL של BB כדי למלא את כל הבארות בצלחת. מכסים את הצלחת במכסה פלסטיק. דוגרים על הצלחת במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לשאוף או לזרוק את תכולת הבאר. טפחו על הצלחת הפוך על מגבות נייר 5 פעמים כדי להסיר את כל הנוזלים.
  6. טען את היתוש homogenate ואת הבקרה על הצלחת כדלקמן.
    1. הוסף 50 μL של הבקרה החיובית לבארות H1 ו- H2.
    2. הוסף 50 μL של BB לבארות בעמודות 1 ו -2 משורה C עד G. לאחר מכן, הוסף 50 μL של הבקרה החיובית לבארות G1 ו- G2. בצע דילול סדרתי של הבקרה החיובית החל מ- G1 ו- G2 ואחריו F1 ו- F2 עד C1 ו- C2.
      הערה: כל בארות הבקרה החיובית צריכות להכיל 50 μL.
    3. הוסף 50 μL של BB (בקרה שלילית) לבארות A1, A2, B1 ו- B2.
    4. הוסף 50 μL מכל דגימה הומוגנית לבאר לא ידועה (Unk).
    5. מכסים את הצלחת ודגרים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
  7. לאחר כשעתיים מתחילים להכין את המצעים. עבור ערכת 2 רכיבים של מצע ABTS, ערבבו מצע A ומצע B ביחס של 1:1.
    הערה: צלחת מלאה של 96 בארות דורשת 5 מ"ל של מצע A ו-5 מ"ל של מצע B.
  8. הכן את פתרונות העבודה של mAbs המסומנים בפרוקסידז עבור Pf, Pv-210 ו- Pv-247 על ידי הוספת BB ל- mAb המצומד מחדש כדי לקבל ריכוז עבודה של 1 מיקרוגרם / מ"ל.
    1. חשב את הכרכים הנדרשים בהתבסס על תוספת של 5 מ"ל של פתרון mAb מצומד עובד לכל צלחת.
    2. בדוק את פעילות הפרוקסידז על ידי ערבוב 5 μL של mAb המסומן בפרוקסידז שנעשה בשלב 3.8 עם 100 μL של המצע שנעשה בשלב 3.7 בצינור נפרד של 1.5 מ"ל. מערבלים בעדינות.
      הערה: אמור להיות שינוי צבע מהיר משקוף לירוק, המציין כי אנזים peroxidase ואת הסובסטרטים פועלים.
  9. שאפו או שפכו את תכולת הבאר וטפחו על הצלחת הפוכה על מגבות נייר 5 פעמים כדי להסיר את כל הנוזלים.
  10. שטפו את הבארות פעמיים עם 200 מיקרוליטר של PBS-Tween, שאפו את תכולת הבאר והקישו על הצלחת 5 פעמים כל אחת.
  11. הוסף 50 μL של mAb המסומן peroxidase שנעשו בשלב 3.8 לכל באר. מכסים את הצלחת ודגרים במשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך. שאפו או זרקו את תכולת הבאר וטפחו על הצלחת הפוכה על מגבת נייר 5 פעמים.
  12. שטפו את הבארות 3 פעמים עם 200 מיקרוליטר של PBS-Tween, שאפו את תכולת הבאר והקישו על הצלחת 5 פעמים כל אחת.
  13. הוסף 100 μL של תמיסת המצע שהוכנה בשלב 3.7 לכל באר. מכסים את הצלחת ודגרים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
  14. לאחר 30 דקות, קרא את הספיגה ב 405-414 ננומטר באמצעות קורא לוחות ELISA.
    הערה: בצע את ההוראות הספציפיות עבור קורא הלוחות של ELISA שבו נעשה שימוש. לקבלת פרטים על ההוראות עבור התוכנה המשמשת לפרוטוקול זה, עיין בחומר משלים S2. אמור להיות שינוי צבע ניכר מירוק לירוק בבארות הבקרה החיוביות.

4. ניתוח

  1. איתור דגימות חיוביות.
    1. תייג דגימות עם ערכי ספיגה מעל החתך (כפול מערך הספיגה הממוצע של הדגימות השליליות) כחיוביות.
  2. כימות CSP
    1. הערך את ריכוז CSP במדגם באמצעות העקומה הסטנדרטית הבנויה מסדרת דילול הבקרה באופן הבא.
      1. צור את העקומה הסטנדרטית על-ידי התוויית ערכי הבליעה (ציר y) של הפקדים המדוללים טורית כנגד ריכוזיהם (ציר x).
      2. בצע רגרסיה ליניארית כדי לקבוע את ההתאמה הטובה ביותר באמצעות y = A + Bx, כאשר A ו- B הם פרמטרים חופשיים.
      3. קבע את ריכוז CSP עבור כל דגימה חיובית על-ידי פתרון המשוואה עבור ערך ספיגה נתון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תוצאות ELISA מייצגות מוצגות באיור 2. בניסוי זה, P. falciparum ELISA זיהה זיהום sporozoite בבאר A7. ניתן היה לזהות את הבאר החיובית באופן חזותי על-ידי צבעה הירוק הקלוש (איור 2A). ערך הספיגה של באר זו היה מעל סף החיתוך (כפול מהערך הממוצע של ארבע בארות הבקרה השליליות) (איור 2B). התפלגות ערכי הספיגה של כל 80 הבארות הלא ידועות מתוארת באיור 2C. כימות CSP של באר A7 על ידי העקומה הסטנדרטית בלוח לאחר חיס...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

CSP-ELISA מספק שיטה ספציפית מאוד וחסכונית לזיהוי פלסמודיום CSP. הוא מאפשר הבחנה בין P. falciparum ו- P. vivax sporozoites וכן בין שני תת-הסוגים, VK210 ו- VK247, של P vivax 11,13,14,15. יש לקחת בחשבון נקודות קריטיות מסוימות כדי להשיג תוצאות אמינות וניתנות לשחזור. כל התמיסות צריכות להישמר במקרר פחות משבוע כדי למנוע צמיחה מיקרוביאלית. יש לשמור את ה-mAb בחומר מדל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

תודות

אנו מודים למר Kirakorn Kiatibutr, MVRU, על ההדרכה וההדרכה. אנו מודים גם לגב' פיניאפאט קונגנגן, MVRU, על עזרתה הטכנית בהכנת איור 2. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות והמכון הלאומי לבריאות (U19 AI089672).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ציוד
ELISA קורא צלחותBioTek Instrument, Inc.ספיגה של Synergy H1נמדדת באמצעות מצב זיהוי ספיגה UV-VIS
עלי מטחנהAxygenPES-15-B-SIלהומוגניזציה של ראש היתוש/בית החזה
<חזק>ריאגנטים
ABTS מצע דו-רכיביKPL50-62-00לזיהוי מונע פרוקסידאז
מאגר חוסם (BB)הערה: תמיסה
לכידת ונוגדנים חד-שבטיים מצומדים לפרוקסידאז (mAbs)הערה: ניתן להשיג mAbs בצורה ליופילית כחלק מערכות ריאגנטים של Sporozoite ELISA (MRA-890 עבור P. falciparum ו-MRA-1028K עבור P. vivax) מ-BEI Resources (https://www.beiresources.org.)
קזאיןסיגמא אולדריץ'9000-71-9לחסימת הכנת מאגר
שחיקה (GB)הערה: תמיסה
Igepal CA-630Sigma aldrich9002-93-1להכנת מאגר טחינה
KClSigma aldrich7447-40-7להכנת מאגר פוספט
מלח KH2PO4 סיגמא אולדריץ'7778-77-0להכנת מי מלח במאגר פוספט
Na2HPO4Sigma aldrich7558-79-4להכנת מי מלח של מאגר פוספט
NaClSigma aldrich7647-14-5להכנת מאגר פוספט
NaOHSigma aldrich1310-73-2להכנת מאגר חסימה
PBS-Tween
Pf לכידת mAbCDCPf-CAPללכידת חלבון Pf circumsporozoite Pf
peroxidase mAbCDCPf-HRPלאיתור חלבון Pf circumsporozoite
Pf בקרה חיוביתCDCPf-PCPf בקרה חיובית
פנול אדוםסיגמא אולדריץ'143-74-8לחסימת הכנת מאגר
מי מלח חוצץ פוספט (PBS)הערה: תמיסה
בקרותהערה: תמיסה
Pv210 לכידת mAbCDCPv210-CAPללכידת חלבון Pv210 circumsporozoite
Pv210 peroxidase mAbCDCPv210-HRPלאיתור Pv210 circumsporozoite חלבון
Pv210 בקרה חיוביתCDCPv210-PCPv210 בקרה חיובית
Pv247 לכידת mAbCDCPv247-CAPללכידת חלבון Pv247 circumsporozoite
Pv247 peroxidase mAbCDCPv247-HRPלאיתור Pv247 circumsporozoite חלבון
Pv247 בקרה חיוביתCDCPv247-PCPv247 בקרה חיובית
Tween20Sigma aldrich9005-64-5להכנת PBS-Tween
<חזק>חומרים מתכלים
מאגרי פיפטינג חד פעמייםגנרילעבודה ריאגנטים
צלחות ELISA: 96 שקוף היטב תחתון עגול PVSCorning Life Science2797עבור ELISA
כפפות: כפפות חד פעמיות וכפפות מקפיאגנרילהגנה אישית
שמלת מעבדהגנריתלהגנה אישית
פיפטה רב-ערוצית P30-300גנריתלהעברת תמיסה
, P2, P20, P200 ו-P1000גנריתלהעברת תמיסה
קצות פיפטה 10 ומיקרו; L, 200 ומיקרו; L, ו-1000 ומיקרו; Lגנרילהעברת תמיסה
פיפטות סרולוגיות 5 מ"ל, 10 מ"לגנרילהעברת תמיסה
העברת פיפטותגנרילהעברת תמיסה
חיוביות

מקורות

  1. Bray, R. S., Garnham, P. C. The life-cycle of primate malaria parasites. British Medical Bulletin. 38 (2), 117-122 (1982).
  2. Held, J. R. Primate malaria. Annals of the New York Academy of Sciences. 162 (1), 587-593 (1969).
  3. World Health Organization. Division of Malaria and Other Parasitic Diseases. Manual on practical entomology in Malaria, Part I and Part II. World Health Organization. , Geneva. (1975).
  4. Robert, V., et al. Study of the distribution of circumsporozoite antigen in Anopheles gambiae infected with Plasmodium falciparum, using the enzyme-linked immunosorbent assay. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 82 (3), 389-391 (1988).
  5. Fontenille, D., Meunier, J. Y., Nkondjio, C. A., Tchuinkam, T. Use of circumsporozoite protein enzyme-linked immunosorbent assay compared with microscopic examination of salivary glands for calculation of malaria infectivity rates in mosquitoes (Diptera: Culicidae) from Cameroon. Journal of Medical Entomology. 38 (3), 451-454 (2001).
  6. Echeverry, D. F., et al. Fast and robust single PCR for Plasmodium sporozoite detection in mosquitoes using the cytochrome oxidase I gene. Malaria Journal. 16 (1), 230(2017).
  7. Singh, B., et al. A genus- and species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 60 (4), 687-692 (1999).
  8. Snounou, G. Genotyping of Plasmodium spp. Nested PCR. Methods in Molecular Medicine. 72, 103-116 (2002).
  9. Snounou, G., Singh, B. Nested PCR analysis of Plasmodium parasites. Methods in Molecular Medicine. 72, 189-203 (2002).
  10. Snounou, G., Viriyakosol, S., Jarra, W., Thaithong, S., Brown, K. N. Identification of the four human malaria parasite species in field samples by the polymerase chain reaction and detection of a high prevalence of mixed infections. Molecular and Biochemical Parasitology. 58 (2), 283-292 (1993).
  11. Wirtz, R. A., et al. Identification of Plasmodium vivax sporozoites in mosquitoes using an enzyme-linked immunosorbent assay. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 34 (6), 1048-1054 (1985).
  12. Wirtz, R. A., Burkot, T. R., Graves, P. M., Andre, R. G. Field evaluation of enzyme-linked immunosorbent assays for Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax sporozoites in mosquitoes (Diptera: Culicidae) from Papua New Guinea. Journal of Medical Entomology. 24 (4), 433-437 (1987).
  13. Wirtz, R. A., Sattabongkot, J., Hall, T., Burkot, T. R., Rosenberg, R. Development and evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay for Plasmodium vivax-VK247 sporozoites. Journal of Medical Entomology. 29 (5), 854-857 (1992).
  14. Burkot, T. R., Williams, J. L., Schneider, I. Identification of Plasmodium falciparum-infected mosquitoes by a double antibody enzyme-linked immunosorbent assay. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 33 (5), 783-788 (1984).
  15. Rosenberg, R., et al. Circumsporozoite protein heterogeneity in the human malaria parasite Plasmodium vivax. Science. 245 (4921), 973-976 (1989).
  16. Marie, A., et al. Evaluation of a real-time quantitative PCR to measure the wild Plasmodium falciparum infectivity rate in salivary glands of Anopheles gambiae. Malaria Journal. 12, 224(2013).
  17. Arevalo-Herrera, M., et al. Immunoreactivity of sera from low to moderate malaria-eEndemic areas against Plasmodium vivax rPvs48/45 proteins produced in Escherichia coli and chinese hamster ovary systems. Frontiers in Immunology. 12, 634738(2021).
  18. Balkew, M., et al. An update on the distribution, bionomics, and insecticide susceptibility of Anopheles stephensi in Ethiopia, 2018-2020. Malaria Journal. 20 (1), 263(2021).
  19. Wirtz, R. A., Avery, M., Benedict, M., Sutcliffe, A. Plasmodium sporozoite ELISA. Methods in Anopheles Research. , 333-343 (2016).
  20. Durnez, L., et al. False positive circumsporozoite protein ELISA: a challenge for the estimation of the entomological inoculation rate of malaria and for vector incrimination. Malaria Journal. 10, 195(2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

PlasmodiumCircumsporozoite ProteinSandwich ELISAPCR
איתור פלסמודיום ספורוזואיטים ביתושי אנופלס באמצעות בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.