פלטפורמה משופרת לתרבות העוברים המלאים מאפשרת פיתוח רחם אקס רציף וחזק של עוברי עכבר לאחר ההשתלה עד שישה ימים, משלבי טרום ההדבקה ועד לאורגנוגנזה מתקדמת. בפרוטוקול זה, אנו מפרטים את ההליך הסטנדרטי לתרבות עוברית מוצלחת באמצעות לוחות סטטיים ומערכות בקבוק מסתובבות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
רחם לשעבר תרבות של עוברי עכבר מ pregastrulation כדי Organogenesis מתקדם
במאמר זה
סיכום
תקציר
שיטות התרבות של היונקים לאחר ההשתלה היו בדרך כלל לא יעילות ומוגבלות לתקופות קצרות לאחר ניתוח הרחם. פלטפורמות פותחו לאחרונה עבור תרבות רחם לשעבר חזקה וממושכת מאוד של עוברי עכבר משלבי גליל ביצה עד organogenesis מתקדם. פלטפורמות אלה מאפשרות פיתוח מתאים ונאמן של עוברים טרום-כבידה (E5.5) עד לשלב היווצרות הגפיים האחוריות (E11). עוברים גסטריים מאוחרים (E7.5) גדלים בבקבוקים מסתובבים בהגדרות אלה, בעוד שתרבות מורחבת משלבי טרום-סטרולציה (E5.5 או E6.5) דורשת שילוב של תרביות בקבוקים סטטיות ומסתובבות. בנוסף, רגולציה רגישה של ריכוז O2 ופחמן דו חמצני, לחץ גז, רמות גלוקוז, ושימוש במדיום תרבית הרחם לשעבר ספציפי הם קריטיים להתפתחות העובר הנכון. כאן, פרוטוקול מפורט צעד אחר צעד עבור תרבות עובר עכבר הרחם לשעבר מורחב מסופק. היכולת לגדל עוברי עכבר רגילים לשעבר הרחם מן gastrulation כדי organogenesis מייצג כלי בעל ערך לאפיון ההשפעה של הפרעות ניסיוניות שונות במהלך התפתחות עוברית.
מבוא
ההתפתחות התוך רחמית של העובר היונקים הגבילה את המחקר של השלבים המוקדמים של התפתחות לאחר ההשתלה1,2. חוסר הנגישות של העובר המתפתח מעכב את ההבנה של תהליכים התפתחותיים מרכזיים המתרחשים לאחר השתלות העובר לרחם, כגון הקמת תוכנית גוף בעלי החיים, מפרט שכבות הנבט, או היווצרות רקמות ואיברים. יתר על כן, הגודל הקטן מאוד של העובר שלאחר ההשתלה המוקדמת מקשה על התבוננות על ידי הדמיה תוך-ויטמית ברחם לפני E103. חוסר היכולת להתבונן ולתפעל עוברים חיים בשלבים אלה הגבילה את המחקר של עוברי לאחר ההשתלה המוקדמים לתמונות במהלך ההתפתחות.
פרוטוקולים לתרבות הפריה חוץ גופית של עוברים יונקים טרום ההשתלה מבוססים היטב, אמינים, ומנוצלים באופן קבוע4. אף על פי כן, הניסיונות להקים מערכות תרבות הרחם לשעבר המסוגלות לתמוך בצמיחה נכונה של העובר לאחר ההשתלה היונקים נחלו הצלחה מוגבלת5. מגוון טכניקות תרבות הוצעו במשך למעלה ממאה שנה, בעיקר על ידי פולחן העוברים בלוחות סטטיים קונבנציונליים6,7,8 או בקבוקים מסתובבים (תרביות רולר)5,9,10. פלטפורמות אלה הוכיחו את עצמן כמועילות בהרחבת הידע על התפתחות היונקים לאחר ההשתלה 11,12, למרות היותן מאוד לא יעילות להישרדות העובר הרגילה ומוגבלות לתקופות קצרות. העוברים החלו להציג פיגור התפתחותי וחריגות מורפולוגיות כבר 24-48 שעות לאחר חניכת התרבות.
מחקר זה מספק תיאור מפורט להקמת מערכת תרבות העובר ברחם לשעבר המאפשרת התפתחות רציפה משלב טרום-אסטרולציה לשלבי אורגנוגנזה מתקדמים במשך עד שישה ימים של התפתחות לאחר ההשתלה13. מאמר זה מתאר את פרוטוקול תרבות הרולר המשופר התומך בצמיחה של עוברים E7.5 (לוח עצבי ושלב כיסוי הראש) עד שלב היווצרות הגפיים האחוריות (~ E11) ואת התרבות המורחבת מ- E5.5/ E6.5 על ידי שילוב תרבות על לוחות סטטיים ופלטפורמות תרבות רולר.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו על פי הנחיות ההגנה על בעלי חיים של מכון ויצמן למדע ואושרו על ידי מכון ויצמן הרלוונטי IACUC (#01390120-1, 01330120-2, 33520117-2). נשים הרות ובריאות התבקשו לתת את הסכמתן מדעת לאיסוף דם מחבל הטבור שלהן, כפי שאושר על ידי ועדת הלסינקי של המרכז הרפואי רמב"ם (#RMB-0452-15). מבוגרים בריאים התבקשו לקבל את הסכמתם מדעת לאיסוף דם בהתאם להנחיות ועדת הלסינקי של מכון ויצמן למדע (#1566-3).
1. הכנה לתקשורת
- הכן את מדיום החיתוך באמצעות 500 מ"ל של מדיום הנשר המתוקן (DMEM) של Dulbecco ללא פנול אדום ו- L-גלוטמין, בתוספת סרום בקר עוברי 10%, 5 מ"ל של פניצילין / סטרפטומיצין, ו filterize-עיקור באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
הערה: יש לשמור על מדיום החיתוך בטמפרטורה של 4 °C (60 °F) למשך עד חודש אחד. - הכן מדיום תרבות עובר הרחם לשעבר (EUCM) טרי כל יום תרבות בתוך מכסה המנוע הביולוגי באמצעות 25% של מדיום עוברי בתוספת 50% סרום חולדה ו 25% סרום דם טבורי אנושי (HCS) או סרום דם מבוגר אנושי (HBS).
- כדי להכין מדיום עוברי, להוסיף 5 מ"ל של גלוטמין, 5 מ"ל של HEPES, ו 5 מ"ל של פניצילין / סטרפטומיצין ב 500 מ"ל של DMEM ללא פנול אדום L-גלוטמין. הכינו 10-15 מ"ל aliquots ולאחסן אותם ב 4 °C (65 °F) עד חודשיים.
הערה: הכפילו את הריכוז האנטיביוטי אם אתם חווים זיהום כלשהו. - מנטרלים בחום את סרום החולדה בטמפרטורה של 56°C למשך 30-45 דקות ומסננים דרך מסנן דיפלואוריד פוליווינילידן של 0.22 מיקרומטר. השתמש בסרום לתרבות באותו יום של איון. להפשיר HCS או HBS ולהשתמש בו מיד לניסויים.
הערה: סרום חולדות מסחרי מספק תוצאות עקביות (לפחות 4 מגרשים נבדקו ללא וריאציה ברורה). לחלופין, סרום עכברושים באיכות גבוהה ניתן להשיג בתוך הבית כפי שתואר בעבר 8,14. אם HCS אינו זמין, החלף אותו ב- HBS שנאספו בתוך הבית. סרום עכברושים, HCS ו- HBS ניתן להקפיא פעם אחת ונשמר ב -20 °C (60 °F) לשימוש ביום אחר. הפשירו ושלבו את סרום ההקפאה עם נפח גדול יותר של סרום שהופשר טרי ואל תקפיאו אותו מחדש.
2. אוסף של סרום דם טבורי אנושי וסרום דם של מבוגרים אנושיים
- כדי לבודד HCS, לאסוף דם חבל הטבור מנשים בהריון בריא ביום הלידה הקיסרית המתוכננת.
- מהדקים פעמיים את חבל הטבור 5-7 ס"מ מהטבור ועוברים בין המלחציים מיד לאחר הלידה של התינוק.
- באופן ידני להקיז דם באמצעות מחט 14 G גדול נשא ומזרק 50 מ"ל ישירות מן הווריד הטבור בעוד השליה נשארת במקום כדי למנוע כל עקבות של המוליזה.
הערה: לאסוף דם לאחר שהתינוק מוסר מתחום הניתוח, ודם טבור נמשך לבדיקות קליניות.
- לחלק את הדם שנאסף ל 5 מ"ל פרוקואורגנט מבחנות סטריליות ולהעביר אותם מיד ל 4 °C (60 °F) במשך 15 דקות כדי לאפשר קרישה מלאה. צנטריפוגה המבחנות הקרושות ב 2,500 × גרם במשך 10 דקות ב 4 °C (65 °F).
- להשליך צינורות המראים סימנים של המוליזה (סרום ורוד-אדום). לאסוף את הסרום (צבע צהוב) באמצעות פיפטה 5 מ"ל ולסנן אותו דרך מסנן 0.22 מיקרומטר. מחממים את הסרום מיד באמבט מים בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
- הכן 1-1.5 מ"ל aliquots של סרום מומת ולאחסן אותם ב -80 °C (80 °F) עד שישה חודשים. במידת הצורך, יש לשלוח בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס באמצעות קרח יבש.
- לאיסוף סרום דם אנושי למבוגרים, יש להקיז דם ממבוגרים בריאים ולבודד מיד את הסרום בעקבות אותו פרוטוקול המתואר בסרום דם טבורי. יש לאחסן את ה-HBS כ-aliquots מושבתים בחום ומסוננים בטמפרטורה של -80°C למשך עד שישה חודשים.
הערה: סרום חבל הטבור האנושי והסרום האנושי למבוגרים שהוכן זה עתה בתוך הבית העניקו תוצאות מעולות לסרום הזמין מסחרית. לאסוף HCS מנשים בריאות, מעל גיל 18 מתחת לגיל 40 שנים מתוכנן משלוח סעיף cesarian. לא לכלול נשים שילדו בנרתיק ונשים עם כל מחלה כרונית או מצבים רפואיים פעילים, כולל סוכרת הריונית או יתר לחץ דם.
3. תרבות רולר הרחם לשעבר של עוברים מ E7.5 עד E11
- הקמת חממת תרבות הרולר ורגולטור הגז
- תרבות E7.5 או עוברים מתקדמים יותר באמצעות מערכת החממה של תרבות הרולר. הפעל את הסיבוב ואת יחידת החימום ב 37 °C (50 °F) לפחות 1 שעות לפני ניתוח העובר. מוסיפים מים משועבדים אוטומטית לבקבוק כניסת הגז ולמבחנת השקע.
הערה: הנח מדחום בסמוך לתוף המסתובב ובדוק לעתים קרובות את יציבות הטמפרטורה בתוך האינקובטור. פתח את החממה מהר ככל האפשר כמו זמן פתיחה ממושך יגדיל את הטמפרטורה ולהשפיע על התפתחות העובר. בעת הצורך, מוסיפים עוד מים משועבדים אוטומטית לבקבוק כניסת הגז ולמבחנת השקע כדי לשמור אותם למינימום של חצי קיבולת במהלך התרבות. הגן על העוברים בתוך האינקובטור מפני אור על ידי כיסוי האינקובטור בבד. - הפעל את מודול וסת הגז על-ידי לחיצה על המתג הראשי ולאחר מכן הפעלת בקרי חמצן/חנקן ופחמן דו-חמצני (איור 1A). הגדר את ערכי החמצן והפחמן הדו-חמצני ל- 5% באמצעות הבקרים המתאימים. פתחו את וסת הגז והגדירו את לחץ הגז ל-6.5-7 פאונד לאינץ' מרובע (פסאיי) על ידי הזזת מתג המתח במשדר הלחץ (איור 1B). אשר את ערך לחץ הגז באמצעות מד לחץ דיגיטלי.
- נטר את זרימת הגז על ידי בדיקת קצב הבועות שנוצרו בתוך המבחנה המלאה במים בשקע שהוקצתה בתוך החממה המדויקת. הגדר את קצב הבועה הנכון על ידי סגירה / פתיחה של שסתום זרימת הגז על המכסה של בקבוק המים. ודא כי זרימת הגז מאפשרת היווצרות של בועות בקצב של 2-4 בועות לשנייה או להגדיר את זרימת הבועה בנקודה הראשונה שבה מבעבע יוצא צינור שקע מלא מים.
- מלאו את בקבוקי התרבות ב-2 מ"ל של מדיום תרבית וחברו אותם לתוף המסתובב והחלול לשיווי משקל למשך שעה אחת. השתמש בבאנגי הסיליקון החלולים כדי לאטום את הבקבוקים לתוף. שמור אטום את החללים הריקים בתוף המסתובב באמצעות bungs מוצק.
הערה: היעדר בועות בצינור השקע (אין גז מגיע דרך המערכת) או זרימת גז גבוהה במיוחד עשוי להשפיע על התפתחות העובר. במקרה של חוסר זרימת בועות למבחנת השקע, בדוק כי כל bungs סיליקון ממוקמים כראוי בתוף מסתובב ואיטום המערכת, ולבדוק כי בקבוק המים סגור כראוי וכל הצינורות מחוברים כראוי. חוסר מבעבע שנכנס לבקבוק המים עשוי להצביע על תקלה בווסת הגז.
- תרבות E7.5 או עוברים מתקדמים יותר באמצעות מערכת החממה של תרבות הרולר. הפעל את הסיבוב ואת יחידת החימום ב 37 °C (50 °F) לפחות 1 שעות לפני ניתוח העובר. מוסיפים מים משועבדים אוטומטית לבקבוק כניסת הגז ולמבחנת השקע.
- ניתוח של עוברי עכבר מעכברים בהריון
- משווה מראש את מדיום הנתיחה בתוך אינקובטור ב 37 °C (5° פרנהייט) ו 5% CO2 למינימום של 1 שעות. השאר את המכסה פתוח מעט כדי לאפשר חילופי גז.
- להקריב את הנקבה ההרה על ידי נקע צוואר הרחם, לנקות את הבטן של הנקבה עם 70% אתנול, ולחתוך את העור ואת דופן הבטן עם מספריים. אתר קצה אחד של הרחם וחתוך בצומת בין השחלה לרחם. לאחר מכן, חותכים לאורך הרחם עד לקצה השני ומעבירים אותו לצלחת פטרי 100 מ"מ מלאה בטמפרטורת החדר של תמיסת מלח חוצצת פוספט של Dulbecco (DPBS).
הערה: מומלץ להשתמש בנשים שאינן מהושראות הורמונליות, הזדווגות באופן טבעי. - לשטוף במהירות את המושגים ב- DPBS ולחתוך בזוגות כדי להקל על טיפול בעוברים. מעבירים את כל זוגות המושגים למדיום ניתוח מתואם מראש בצלחת פטרי 60 מ"מ וחותכים לתפיסות בודדות.
- הסר את דופן הרחם של המושגים על ידי קריעת רקמת הרחם באמצעות זוג מלקחיים ברוטו. השתמש מלקחיים מיקרוכירורגיים עדינים כדי לחתוך את קצה ההחלטה בצורת אגס. הכנס את המלקחיים לצד העובר במקביל לציר הארוך שלו, ופתח את המלקחיים כדי לפצל את המלקחיים לחצי.
- לבסוף, להשאיר את חרוט ectoplacental שלם מחובר גליל הביצה על ידי אחיזת העובר מן decidua וקילוף שק החלמון הקודקודי את העובר באמצעות מלקחיים עדינים.
הערה: כדי להימנע מהשפעה על העובר, בצעו ניתוחים במיקרוסקופ המצויד בלוח חימום בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תוך 30-40 דקות לכל היותר. לנתח המלטה אחת של עוברים בכל פעם. - מיד לאחר הניתוח, העבירו את העוברים לצלחת חדשה מלאה במדיום ניתוח שיווי משקל באמצעות פיפטת פסטר מזכוכית כדי למנוע מהעוברים להידבק לפסולת הרקמה.
- בחר עוברים אלה בלוח העצבי / שלב קיפול הראש המוקדם מראה שום נזק באפיבלסט ולהעביר 5-6 עוברים לבקבוק לבקבוק לבקבוק לבקבוק לתרבות הזכוכית שהשתווינו מראש.
הערה: כדי להכין את פיפטה פסטר זכוכית, לחתוך את הפתיחה של פיפטה לגודל הולם כדי להתאים את העוברים באמצעות חותך זכוכית, ולשמור אותו באתנול כדי למנוע זיהום. לשטוף את פיפטה זכוכית עם PBS לפני העברת עוברים. בעת העברת העוברים לבקבוק התרבות, הקפד לשאת מעל נפח קטן ככל האפשר של מדיום הנתיחה כדי למנוע דילול EUCM. - מניחים את הבקבוקים במערכת התרבות המסתובבת ב 37 °C (5 °F), באווירה של 5% O2 ו 5% CO2.
- בכל יום של תרבות, להסיר את הבקבוקים אחד אחד מן החממה כדי להעריך את התפתחות העובר תחת סטריאומיקרוסקופ. הקפד לסגור את החור הריק בתוף עם באנג מוצק בעת הסרת בקבוק. חותכים את הקצה של פיפטה פסטר פלסטיק סטרילי כדי להתאים את גודל העובר ולהעביר את העוברים לצלחת פטרי כדי להקל על התצפית. ודא כי העוברים מכוסים תמיד על ידי בינוני.
הערה: למזער את הזמן שעבורו העוברים נמצאים מחוץ לאינקובטור כדי למנוע השפעות מזיקות בעוברים עקב ירידה בטמפרטורת הגוף. להתמודד עם העוברים בזהירות כדי למנוע קרע של כלי הדם שק החלמון, המשפיעים על הישרדות העובר. - ביום התרבות 1 (שווה ערך ל- E8.5), העבר קבוצות של 3 עוברים לבקבוק חדש עם 2 מ"ל של EUCM טרי ושוויוני מראש המכיל תוספת של 3 מ"ג / מ"ל של D-גלוקוז ותערובת גז של 13% O2, 5% CO2.
- לאחר 48 שעות (שווה ערך ל- E9.5), קבוצות העברה של שני עוברים לבקבוק חדש עם EUCM שחומם מראש בתוספת 3.5 מ"ג / מ"ל של גלוקוז באטמוספרת גז של 18% O2 ו 5% CO2.
- ב 72 שעות של תרבות (שווה ערך E10.5), להעביר כל עובר לבקבוק בודד המכיל 1.5-2 מ"ל של בינוני טרי בתוספת 4 מ"ג / מ"ל של גלוקוז ואספקת גז של 21% O2 ו 5% CO2.
הערה: עוברים מגיעים לצמיחה המקסימלית שלהם בערך בחצות של יום התרבות 4. - השתמש מלקחיים עדינים כדי להסיר את שק החלמון ואת אמניון, ולנתק את חבל הטבור לתצפית נכונה של מורפולוגיה עוברית. כבה את מודול ויסות הגז ואת האינקובטור המדויק.
הערה: יש לאזן מראש את מדיום התרבות למשך שעה אחת על ידי דגירה בתוך בקבוק זכוכית בתרבות הרולר עם אטמוספרת גז נאותה על פי שלב העובר. נקו את בקבוקי התרבות ואת כל כלי הזכוכית של החממה לאחר כל שימוש על ידי ביצוע שלוש שטיפות עם מים מזוקקים זורמים ואחריו שטיפה לילית שקועה ב -70% אתנול. לשטוף שלוש פעמים עם מים מזוקקים זורמים, לתת לבקבוקים להתייבש בן לילה, ולעקר על ידי autoclave. כמו כן, autoclave את תקעי הסיליקון באופן קבוע. יש לנקות ביסודיות את כל כלי הניתוח עם 70% אתנול ולחטא אותם ביבש.
4. תרבות העובר המורחבת מ- E5.5/ E6.5 עד E11
- טרום-אסטרציה תרבותית (E5.5) ועוברי גסטרולציה מוקדמת (E6.5) עד לשלב הסומיט המוקדם (E8.5) בלוחות סטטיים.
- ישוו מראש את מדיום החיתוך למשך שעה אחת באינקובטור עם 5% CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
הערה: כדי לאפשר חילופי גז, אין לסגור את מכסה הצינור לחלוטין. - הכן את לוחות התרבות על ידי הוספת 250 μL של EUCM מוכן טרי לכל באר. מניחים את הצלחות בתוך אינקובטור CO2 ב 37 °C (50 °F) עבור שיווי משקל מראש.
הערה: למרות לוחות 8-well מתאימים היטב לצמיחת העובר, התרבות יכולה להיעשות בכל צלחת אחרת על ידי התאמת עוצמת הקול של המדיום בהתאם לגודל הצלחת. - לנתח עוברים גליל ביצה מתוך הרחם בעקבות הטכניקה המתוארת עבור E7.5. מוציאים את שק החלמון הקודקודי של העובר ומשאירים את חרוט האקטופלנט שלם המחובר לגליל הביצה.
- מעבירים עוברים בודדים לתוך כל באר של צלחת 8 באר באמצעות micropipette ומניחים את הצלחת בתוך האינקובטור עם 5% CO2 ב 37 °C (8 °F).
- דמיינו את העוברים תחת סטריאומיקרוסקופ ובחרו לתרבות רק לבעלי חלל מי שפיר מעוצב היטב, ללא נזק ניכר וללא קרום הרייכרט.
הערה: השתמש 20 טיפים פיפטה μL להעביר E5.5 עוברים ו 200 טיפים μL להעביר E6.5 עוברים. במקרה של תרבויות החל E6.5, HCS יכול להיות מוחלף על ידי HBS שנאסף טרי. - הסר מחצית מהמדיום והוסף 250 μL של EUCM טרי שהוכן מראש לאחר 24 שעות של תרבות, להבטיח כי העוברים תמיד שקועים במדיום התרבות. במקרה של תרבויות החל E5.5, לאחר יומיים של תרבות (שווה ערך E7.5), להסיר 200 μL ולהוסיף 250 μL של EUCM חדש.
הערה: במהלך תרבית סטטית, עוברים עשויים להיצמד לצלחת (בעיקר בעת שימוש בלוחות פלסטיק), דבר שיפגע קשות בהתפתחות העובר. חיבור העובר לצלחת הוא תכוף יותר ביום הראשון של פולחן עוברים E5.5. כדי למנוע התקשרות, בזהירות לדחוף את העוברים הרחק משטח הלוח באמצעות מלקחיים עדינים, סטריליים. ודא שרק חרוט אקטוספלטנטלי נשאר מחובר לפני השטח של הצלחת. - העבר את העוברים לתרבות הרולר בשלב הסומיטים המוקדמים (4-7 סומיטים; לאחר שלושה ימים של תרבות לעוברים שהוסברו ב- E5.5 ויומיים לתרבויות שהחלו ב- E6.5), בעקבות אותם אינדיקציות שתוארו בעבר עבור עוברי שלב E8.5.
הערה: העברת העוברים לתרבות הרולר בשלבים סומיטיים השונים מאלה שצוינו לעיל גורמת לכישלון בהתפתחות נוספת. בניגוד לתרבויות הרחם לשעבר E7.5, ניתן לשמור על העוברים באטמוספירה קבועה של 21% חמצן ו -5% CO2, ומספקים יעילות מעט גבוהה יותר של התפתחות העובר מאשר אטמוספרות עם ריכוז חמצן דינמי.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
תנאי תרות הרולר המתוארים עבור עוברים E7.5 (שלב גסטרולציה מאוחרת) תומכים בצמיחה קבועה ונורמלית של עוברים ביעילות ממוצעת של קרוב ל-75% לאחר 4 ימי תרבות (איור 2 ולוח 1). היעילות של התפתחות העובר עשויה להשתנות על-פני רקעים גנטיים מגוונים של עכברים, אך היא איתנה באופן עקבי (איור 2C). תוספי HBS במקום HCS מניבים יעילות של ~68% לאחר 4 ימים של תרבות הרחם לשעבר , בהתאם לרקע הגנטי של העכברים (איור 2D וטבלה 2
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול התרבות המוצג כאן יכול לקיים רחם עובר עכבר תקין ומתמשך למשך עד שישה ימים, מ- E5.5 עד E11. בעבר, עוברים בשלבים התפתחותיים אלה יכולים להתפתח כרגיל בתרבות רק לתקופות קצרות (עד 48 שעות)15. הזיווג של מודול ויסות הגז לחממת תרבות הרולר לשליטה מדויקת בריכוז החמצן ולחץ הגז ההיפרברי הוא קריטי לתרבות עוברי העכבר הנכונה המתוארת כאן. הגדלת לחץ הגז ל 7 פסאיי משפרת את פיזור החמצן, ומאפשרת פיתוח עובר עד E11 באטמוספירה של עד 21% O2/5% CO2, בניגוד לתנאים שהועסקו בעבר של 95%
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
י.ח.ה. הוא יועץ לתעשיות ביולוגיות בע"מ והגיש בקשת פטנט המכסה את תנאי התרבות הרולר והסטטי המתוארים להלן (שהוגשו על ידי י.ח.ה. ומכון ויצמן למדע). מחברים אחרים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.
תודות
עבודה זו מומנה על ידי פסקל ואילנה מנטוקס; מועצת המחקר האירופית (ERC-CoG-2016 726497-Cellnaivety); דיילת המועצה למחקר רפואי (FAMRI); הקרן הישראלית לחקר הסרטן (ICRF), BSF, מכון הלן ומרטין קימל לחקר תאי גזע, פרס הלן ומרטין קימל לחקירה חדשנית; הקרן הישראלית למדע (ISF), מינרבה, מכון שרמן לכימיה רפואית, מרכז נלה וליאון בנוזיו למחלות נוירולוגיות, מרכז משפחת דוד ופלה שפל לחקר הפרעות גנטיות, מכון משפחת קססט לגנטיקה רפואית, קרן המחקר לתאי גזע של ד"ר בית רום-רמר, קרנות אדמונד דה רוטשילד, קרן הצדקה זנטקר, אחוזת צביה זרוני.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.22 ומיקרו; מסנן גודל נקבוביות m (250 מ"ל) | JetBiofil | FCA-206-250 | |
| 0.22 & מזרק בגודל נקבוביות m מסנן PVDF | Millipore | SLGV033RS | |
| 8 בארות &מיקרו;-צלחות תחתית זכוכית/ibiTreat | iBidi | 80827/80826 | |
| בקבוק עם מכסה מתאם לכניסת גז | Arad Technologies | ||
| Bungs (חור) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 06 | משמש לאיטום הבקבוקים לתוף |
| Bungs (מוצק) | B.T.C. הנדסה, קולום סטאר הנדסה מדויקת | BTC 07 | משמש לאיטום התוף המסתובב |
| בקבוקי תרבות | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 03/BTC 04 | או בקבוקי זכוכית (קטנים) BTC 03 או בקבוקי זכוכית (גדולים) BTC 04 |
| D(+)-גלוקוז מונוהידראט | J.T. בייקר | ||
| סכין יהלום | Fine Science | Tools 10100-30/45 | |
| מד לחץ דיגיטלי | שנחאי Benxu אלקטרוניקה טכנולוגיה בע"מ | BX-DPG80 | |
| DMEM | GIBCO | 11880 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Bio Industries | 02-020-1A | |
| תעשיות ביולוגיות | סרום בקר עוברי | 04-013-1A | |
| מודול ויסות גז | ארד טכנולוגיות | HannaLab1 | |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | גלוטמין |
| מלקחיים Graefe | Fine Science | Tools 11052-10 | |
| HEPES | GIBCO | 15630056 | |
| מלקחיים מיקרוכירורגיים (Dumont #5, #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| פיפטות פסטר (זכוכית) | פיפטות פסטר של הילגנברג | 3150102 | |
| (פלסטיק) | Alexred | SO P12201 | |
| פניצילין/סטרפטומיצין | תעשיות ביולוגיות | 03-031-1B | |
| צלחות פטרי (60 מ"מ ו-100 מ"מ) | Falcon | 351007/351029 | |
| מערכת חממה מדויקת | B.T.C. הנדסה, Cullum Starr הנדסה מדויקת | דגם BTC01 | BTC01 עם ערכת מבעבע גז |
| מבחנות סטריליות פרו-קרישה (5 מ"ל) | Greiner Bio-One | #456005 | |
| סרום תרבית עובר שלם של חולדה | ENVIGO Bioproducts | B-4520 | |
| מיקרוסקופ סטריאוסקופי מצויד בצלחת חימום | Nikon | SMZ18 | |
| מזרקים סטריליים (5, 10 מ"ל) לסינון סרום | Pic Solution | ||
| מספריים כירורגיים | Fine Science Tools | 14094-11 |
מקורות
- New, D. A. Whole-embryo culture and the study of mammalian embryos during organogenesis. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 53 (1), 81-122 (1978).
- Tam, P. P., Behringer, R. R. Mouse gastrulation: the formation of a mammalian body plan. Mechanisms of Development. 68 (1-2), 3-25 (1997).
- Huang, Q., et al. Intravital imaging of mouse embryos. Science. 368 (6487), 181-186 (2020).
- White, M. D., et al. Long-lived binding of Sox2 to DNA predicts cell fate in the four-cell mouse embryo. Cell. 165 (1), 75-87 (2016).
- Tam, P. P. Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation. International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).
- Nicholas, J. S., Rudnick, D. The development of rat embryos in tissue culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 20 (12), 656-658 (1934).
- New, D. A., Stein, K. F. Cultivation of mouse embryos in vitro. Nature. 199, 297-299 (1963).
- Rivera-Pérez, J. A., Jones, V., Tam, P. P. L. Culture of whole mouse embryos at early postimplantation to organogenesis stages: developmental staging and methods. Methods in Enzymology. 476, 185-203 (2010).
- New, D. A. T., Coppola, P. T., Terry, S. Culture of explanted rat embryos in rotating tubes. Journal of Reproduction and Fertility. 35 (1), 135-138 (1973).
- Cockroft, D. L. A comparative and historical review of culture methods for vertebrates. International Journal of Developmental Biology. 41 (12), 127-137 (1997).
- Parameswaran, M., Tam, P. P. L. Regionalisation of cell fate and morphogenetic movement of the mesoderm during mouse gastrulation. Developmental Genetics. 17 (1), 16-28 (1995).
- Beddington, R. S. Induction of a second neural axis by the mouse node. Development. 120 (3), 613-620 (1994).
- Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
- Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51969(2014).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Isolation, culture and manipulation of postimplantation embryos. Manipulating the Mouse Embryo: a Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 149-193 (2014).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Development, Growth and Differentiation. 50 (6), 485-497 (2008).
- Mathieu, J., Ruohola-Baker, H. Metabolic remodeling during the loss and acquisition of pluripotency. Development. 144 (4), 541-551 (2017).
- Sturm, K., Tam, P. P. L. Isolation and culture of whole postimplantation embryos and germ layer derivatives. Methods in Enzymology. 225, 164-190 (1993).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
