מאמר שיטה

בקרה אופטית בתפוקה גבוהה ורישום אות סידן בקרדיומיוציטים שמקורם ב-iPSC לבדיקת רעילות ובדיקת תרופות פנוטיפית

4.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63175

⸱

31 במרץ 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1LumiSTAR Biotechnology, Inc., 2NEXEL Co., Ltd., 3Institute of Pharmacology, College of Medicine, National Taiwan University, 4Manchester Heart Centre, Manchester Royal Infirmary, Manchester University NHS Foundation Trust, 5Division of Cardiovascular Sciences, Manchester Academic Health Sciences Centre, University of Manchester, 6Division of Cell Matrix Biology and Regenerative Medicine, University of Manchester

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול הנוכחי מתאר בקרה ותצפית כל-אופטית של פעילות תאית מופעלת בקרדיומיוציטים שמקורם ב-iPSC (iPSC-CMs) לצורך בדיקת תרופות בתפוקה גבוהה ובדיקות רעילות. מוצג כימות רב-פרמטרי של תבניות פנוטיפיות בזמן ובמרחב. ההשפעות ארוכות הטווח של סמים לאורך שעות, או מדידות עוקבות לאורך ימים, מודגמות.

תקציר

הבנת האופן שבו תאים מעוררים פועלים בבריאות ובמחלות וכיצד התנהגות זו יכולה להשתנות על-ידי מולקולות קטנות או מניפולציה גנטית היא חשובה. ניתן לשלב מחווני סידן מקודדים גנטית (GECIs) עם חלונות פליטה מרובים (למשל, לתצפית בו-זמנית על אירועים תת-תאיים מובהקים) או להשתמש בהם ביישומים מורחבים עם מפעילים תלויי אור אחרים בתאים מעוררים (למשל, שילוב של בקרה אופטוגנטית מקודדת גנטית עם מחווני סידן תואמים ספקטרלית). גישות כאלה שימשו בנוירונים ראשוניים או בתאי גזע, קרדיומיוציטים ותאי בטא בלבלב. עם זאת, זה היה מאתגר להגדיל את התפוקה, או משך התצפית, של גישות כאלה בשל מגבלות של המכשירים, תוכנת הניתוח, ביצועי האינדיקטורים ויעילות העברת הגנים. כאן, GECI ירוק בעל ביצועים גבוהים, mNeonGreen-GECO (mNG-GECO), ו- GECI עם הסטה אדומה, K-GECO, משולבים עם בקרה אופטוגנטית כדי להשיג בקרה אופטית מלאה והדמיה של פעילות התאים בפורמט הדמיה בעל תפוקה גבוהה באמצעות מערכת הדמיה בעלת תוכן גבוה. מוצגים יישומים המדגימים בדיקת קרדיוטוקסיות ובדיקת תרופות פנוטיפית עם iPSC-CMs בריאים שמקורם בחולה. בנוסף, הערכות רב-פרמטריות המשתמשות בשילובים של וריאנטים ספקטרליים ומדדי זיקה לסידן (NIR-GECO, LAR-GECO ו-mtGCEPIA או Orai1-G-GECO) מוגבלות לתאים תאיים שונים מודגמות גם במודל iPSC-CM.

מבוא

מודלים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSC) נחשבים לפתרון מבטיח ליעדי 3Rs (החלפה, הפחתה ועידון) שנקבעו למחקרים בבעלי חיים 1,2. קרדיומיוציטים שמקורם ב-iPSC שימשו למידול מחלות ולגילוי תרופות, שכן הם מסכמים היבטים חיוניים של הביולוגיה האנושית3. הדמיית סידן, בדרך כלל עם צבעים כימיים, שימשה לתצפית על פעילות התאים לפני ואחרי טיפול תרופתי 4,5. עם זאת, בדיקות חישת סידן המבוססות על צבע כימי מעכבות ישירות את Na, K-ATPase ומשבשות את תפקוד התאים6. לפיכך, מעקב אחר אותם תאים לאורך שעות או ימים היה בעייתי כאשר נעשה שימוש בצבעים כימיים. כאן, מגוון של מדדי סידן מקודדים גנטית (GECIs)7,8,9,10 מנוצלים על פני ספקטרום רחב של עירור/פליטה וזיקת סידן כדי ליצור פלטפורמה לבדיקת רעילות לב המציעה מדידות רב-אברונים בזמן אמת על פני פרקי זמן ממושכים 11.

כדי להמשיך ולפתח את רעיון הסינון מבוסס הסידן בתפוקה גבוהה במודל iPSC-CM מעבר להקשר האקדמי שהוכח בעבר באמצעות כלים מקודדים גנטית לבקרה אופטית והדמיית סידן על ידי ביטוי משותף של מחוון סידן בהסטה אדומה, R-GECO או K-GECO עם כלי אופטוגנטי, ChR212,13, ערכות ויראליות מהמדף נוצרו. על ידי העברת ההדמיה למכשיר בעל תוכן גבוה המצויד במערכת מיקרופלואידית אוטומטית, צנרת חד-ערוצית של תוספת תרכובת מונחת בשכבות על גבי הדמיה של תאים חיים. לבסוף, שני ההיבטים החיוניים של מסלול הניסוי, עיבוד התמונה והניתוח משופרים ואוטומטיים.

פרוטוקול

קרדיומיופתיה שאינה קומפקטית בחדר שמאל (LVNC) חולה קרדיומיוציטים שמקורם ב-iPSC (iPSC-CM) סופקו על ידי בית החולים האוניברסיטאי הלאומי של טייוואן. איסוף דגימות המטופלים לתכנות מחדש ל- iPSC ופרוטוקולי התחזוקה14 למטרות מחקר בוצעו בעקבות הצהרת הלסינקי של WMA (עקרונות אתיים למחקר רפואי המערבים נבדקים אנושיים) ואושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית: משרד ועדת האתיקה למחקר ב- NTUH (#201612099RINC). iPSC-CM אחרים התקבלו מספקים מסחריים. השימוש בנגזרות iPSC אינו דורש הרשאות ספציפיות במוסד שלנו.

1. הכנת קרדיומיוציטים שמקורם ב-iPSC

  1. הכינו את הצלחת מרובת הבארות לפני הסרת iPSC-CM מאחסון קר לצורך הפשרה. מצפים כל באר של צלחת 96 בארות עם 100 μL של 50 מיקרוגרם / מ"ל פיברונקטין / 0.2% תמיסת ג'לטין (ראה טבלת חומרים) כדי לכסות את כל המשטחים ביסודיות.
  2. לדגום את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1 שעה באינקובטור לחות.
  3. יש לחמם את המדיום (ראו טבלת חומרים) לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפני הפשרת התא.
    הערה: הפרוטוקול הנוכחי מתאר את טמפרטורת החדר כ- 25 °C.
  4. העבירו את ה-iPSC-CM ממיכל אחסון החנקן הנוזלי לאמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: iPS-CMs נשלחים בדרך כלל על קרח יבש על ידי מקורות אקדמיים או מסחריים. הם מועברים לאחסון חנקן נוזלי עם קבלתם עד לשימוש.
  5. מוציאים את הבקבוקון לפני שהקרח נמס לחלוטין ומרססים את הבקבוקון ב-75% אתנול.
  6. קח את הבקבוקון לארון בטיחות ביולוגית מדרגה II והעבר בעדינות את התכולה לצינור חרוטי חדש של 15 מ"ל המכיל 9 מ"ל של מדיום טמפרטורת החדר.
  7. צנטריפוגה של התאים ב 200 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
  8. יש להשליך את הסופר-נאטנט על ידי פיפטה ולתלות בעדינות את התאים ב-1 מ"ל של מדיום עם 10 מיקרומטר של מעכב ROCK (Y27632) (ראו טבלת חומרים).
    הערה: הימנע מצינורות חוזרים ונשנים של תאים מופשרים כדי להבטיח התאוששות מרבית של התאים.
  9. הסר את תמיסת הציפוי מהבאר והוסף 50 μL של בינוני עם 10 μM של מעכב ROCK במהירות.
  10. אשר את מספר התאים בני קיימא באמצעות שיטת ההדרה הכחולה של טריפאן עם המוציטומטר15.
  11. תאי צלחת בצלחת מצופה 96 באר בצפיפות של 100,000-150,000 תאים לס"מ2, לפי הוראות היצרן16.
  12. לאחר 24 שעות, ודא שהתאים המחוברים לפני השטח של הצלחת נמצאים במגע עם תאים אחרים.
    הערה: תאים בודדים שורדים בצורה גרועה בתרבית ארוכת טווח ובדרך כלל מתנהגים בצורה שונה יותר.
  13. החלף אמצעי תחזוקה מחומם מראש כל יומיים.
    הערה: עבור טיפול תרופתי ארוך טווח, LVNC iPSC-CM הוחלפו עם חצי תחליפים בינוניים עם, או בלי, תרופות מולקולות קטנות כל יומיים.

2. ביטוי של מחווני סידן מקודדים גנטית

  1. לאחר ציפוי התאים במשך 72 שעות, הפשירו את ערכות הנגיפיות של GECIs (ראו טבלת חומרים) על קרח.
  2. הכינו פתרון מלאי של ערכה ויראלית פי 2 עם מדיום התחזוקה.
  3. הכן את התאים לזיהום על ידי התאמת הנפח הבינוני ל -100 μL לכל באר. הוסיפו 100 μL של התמיסה הנגיפית המעורבבת מראש ודגרו במשך 8-16 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  4. יש להחליף ב-200 μL מדיום שחומם מראש לאחר הדגירה.
  5. דמיינו את ביטוי ה-GECIs 24 שעות לאחר הטרנסדוקציה באמצעות מערכת הדמיה (ראו טבלת חומרים).
    הערה: רמת הביטוי מגיעה למקסימום של 48-72 שעות לאחר ההתמרות. ניתן לדמות תאים מנקודת הזמן של 24 שעות. עם זאת, האותות המתקבלים מ- GECIs נמשכים יותר מחודש.
  6. שמור על תאים באינקובטור הלח לפני ביצוע בדיקות פונקציונליות.
  7. הדביקו את ה-iPSC-CMs (iPSC-CMs שמקורם בחולה LVNC) בערכה נגיפית ChR2-K-GECO (ראו טבלת חומרים) ביום ה-25 לאחר ההתמיינות באמצעות פרוטוקול ההדבקה (שלב 2.1-2.6).

3. הדמיית סידן על בסיס צבע באמצעות Fluo-4

  1. יש להמיס אבקת Fluo-4 (ראו טבלת חומרים) ב-DMSO כתמיסת מלאי (5 mM).
  2. דלל את תמיסת המלאי לריכוז של 10 μM Fluo-4 במאגר של Tyrode.
    הערה: המאגר של הטירודה מורכב מ-1.0 גרם/ליטר של סודיום ביקרבונט, 0.2 גרם/ליטר של סידן כלורי, 0.1 גרם/ליטר של מגנזיום כלוריד, 0.2 גרם/ליטר של אשלגן כלורי, 8.0 גרם/ליטר של נתרן כלורי, 0.05 גרם/ליטר של נתרן פוספט מונובאסיק ו-1.0 גרם/ליטר של D-גלוקוז.
  3. החלף חצי מדיום עם 10 μM של תמיסת Fluo-4 (נותן ריכוז סופי של 5 μM).
  4. לדגום את התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
  5. שטפו את התאים עם חיץ של טירודה שחומם מראש והחליפו אותם במדיום לפני רכישת התמונה.
  6. התחל להקליט עם פרוטוקול רכישת הזרם.
    הערה: רכישת זרם רוכשת תמונות ברציפות ללא זמן מרווח. תדירות הפעימה של iPSC-CM היא כ -1 הרץ, ופרוטוקול רכישת זרם זה משמש לאיסוף דפוסי פעימה.

4. רכישת תמונה ומבחנים פונקציונליים לבדיקת רעילות וסינון פנוטיפי

  1. הפעל את כל ההתקנים של מערכת ההדמיה בעלת התוכן הגבוה (ראה טבלת חומרים).
  2. ודא שטמפרטורת התא מגיעה ל-37 מעלות צלזיוס, עם תוספת של 5% CO2 . שמור על המערכת בשיווי משקל למשך שעתיים לפני רכישת התמונה.
    הערה: סחיפה תרמית היא בעיה משמעותית עבור תצפיות ארוכות טווח של תאים חיים, 1 °C יכול לשנות את מישור המוקד ב~1 מיקרומטר, ולכן מתן אפשרות לעדשה, ולשלב, להגיע לטמפרטורת היעד הוא חיוני לפני רכישת התמונה.
  3. פתח את תוכנת ההדמיה (ראה טבלת חומרים) ובחר את הגדרת הצלחת עבור צלחת של 96 בארות.
  4. הכניסו לתא צלחת לא מכוסה של 96 בארות וטענו אותה עם טבעת האיטום של התא החי מעליה.
    הערה: טבעת האיטום של תאים חיים היא מתאם להגעה לשיווי משקל סביבתי.
  5. בחרו את העדשה האובייקטיבית 20x (איור 1 ואיור 2), 60x (איור 3 ואיור 4) ו-20x (איור 5) לטבילת מים בהתאם לרזולוציה המרחבית הנדרשת.
  6. התאם את המיקוד כדי לצלם תמונות ברורות לפני הרכישה הניסיונית.
  7. בחר 3-5 אזורים באופן אקראי לכל באר לרישום פעילות סידן.
    הערה: כל אזור חייב לכלול לפחות 20 תאים (n ≥ 20).
  8. בחר מסננים מתאימים עבור מחוונים שונים. FITC 475/536 עבור mNG-GECO, mtGCEPIA3 ו-Oria1-G-GECO; Cy5 631/692 עבור NIR-GECO2; ER 530/593 עבור ER-LAR-GECO; טקסס רד 560/624 עבור K-GECO.
  9. הגדר את עוצמת הדיודה פולטת האור (LED) המתאימה לכל ערוץ הדמיה שנעשה בו שימוש.
    הערה: בעת מיטוב עוצמת ה-LED לקליטת הדמיה לפי אות (עוצמת האובייקט שזוהתה) ליחס רעש (עוצמת הרקע שזוהתה), יחס ה-S/N צריך להיות גבוה מ-2. בפרוטוקול זה, 10% הספק LED עבור TRITC ו- FITC; 20% עבור Cy5 היה אופייני.
  10. הגדר את זמן החשיפה של המצלמה למקסימום של 40 אלפיות השנייה (25 הרץ) ומשך הקלטה של 30 sfor stream כדי לצפות בטרנזיינטים של סידן שדווחו על-ידי בדיקות mNG-GECO ו-K-GECO המתבטאות בקרדיומיוציטים (איור 1-3 ואיור 5). הגדל את עוצמת ה-LED אם האות/הרעש <2 בקצבי פריימים גבוהים יותר.
  11. עבור גירוי אופטוגנטי (איור 2 ואיור 3C,D), מטב את ההספק (בדרך כלל 5%-10%) ואת התדירות של אור כחול ב-1 הרץ.
    הערה: באופן כללי, iPSC-CM אנושי פועם באופן ספונטני סביב ~ 1 הרץ, והמפעיל צריך לקצב מהר יותר מהקצב הספונטני.
  12. אם מתוכננות מדידות עוקבות (איור 3) או מורחבות (איור 4), הימנעו מפוטוטוקסיות בכל מחיר. משמעות הדבר עשויה להיות הפחתת עוצמת ההארה ופיצוי על כך על-ידי הגדלת זמן החשיפה של המצלמה, לדוגמה, ל-100 אלפיות השנייה באמצעות פרוטוקול קיטועי הזמן המשמש לתצפית בזמן אמת בשלושה ערוצים של אותות Ca2+ תת-תאיים (איור 4).
  13. השתמש בפרוטוקול החלוקה האסינכרוני לתוספת קפאין של 10 mM באמצעות מערכת המיקרופלואידיקה האוטומטית (ראו טבלת חומרים) (איור 4).
    הערה: פרוטוקול החלוקה האסינכרוני מאפשר רכישת תמונה בזמן הוספת תרופות כגון קפאין, ללא רווחים בין התמונות.
  14. התחל רכישה.

5. הכנת מולקולות קטנות

  1. החזירו את ה-E4031, הדופטיליד והוראפאמיל ב-DMSO ודללו אותם עם החיץ של טיירוד. הריכוז הסופי של DMSO בתווך היה 0.1% (v/v).
  2. הכינו את התמיסות המורכבות בריכוז העבודה הרצוי (כלומר, פי 2) ובשיווי משקל ב-37 מעלות צלזיוס לפני התוספת.
    הערה: מזעור תנודות הטמפרטורה לאחר תוספת בינונית הוא חיוני מכיוון שההתכווצות תלויה בטמפרטורה, וההשפעה של שינוי הטמפרטורה מהירה.
  3. סדרו תרכובות לבאר היעד המתאימה.
  4. הוסף 100 μL של תרכובות חוזק כפול (2x) באמצעות מערכת microfluidics אוטומטי (ראה טבלת חומרים) לתוך הבארות ולהתחיל לרכוש לאחר תקופת הדגירה הרצויה (בדרך כלל 15 דקות).

6. עיבוד וניתוח הדמיה

  1. בודד את אזור האות מהרקע על ידי זיהוי התכונה של הדופק לאורך זמן-סיבוב באופן אוטומטי עם התוכנה.
  2. השתמשו בתוכנה לניתוח שיא סידן (ראו טבלת חומרים) כדי לנתח תדירות פעימה (BPM), אות שיא (משרעת), משך ארעי סידן 50% (CTD50), משך ארעי סידן 90% (CTD90), זמן עלייה וזמן דעיכה (איור 1C).
    הערה: בהגדרות אלה ניכרה הלבנת תמונות במהלך 10 השניות הראשונות, והאותות מתייצבים לאחר מכן. לפיכך, שיא הסידן נותח בין 11-30 שניות. בהקלטות תלת-ערוציות (איור 4), קווי המתאר של התאים מוגבלים באופן ידני למדידת שינויים בעוצמה.

תוצאות

התצפית של תנודות סידן ספונטניות ב-mNG-GECO10 המתבטאת על ידי קרדיומיוציטים שמקורם ב-iPSC (iPSC-CMs) עם או בלי טיפולים תרופתיים מודגמת באיור 1 ובסרטון אנימציה 1. עקבות קינטיים שהתקבלו באמצעות mNG-GECO מראים שמעכבי תעלות יונים מולקולריות קטנות, ורפאמיל, דופטיליד ו-E4031, השפיעו כצפוי על טרנזיינטים של סידן (איור 1B). ניתן לנתח את ארעיות הסידן הטיפוסית המוצגת באיור 1C על-ידי תוכנת ניתוח שיא סידן כדי להפיק אות שיא (משרעת), משך ארעי סידן 50% (CTD50), משך ארעי סידן 90% (CTD90), זמן עלייה וזמן דעיכה. Verapamil, חוסם סידןמסוג L 17, מעכב לחלוטין את זרם הסידן בתאים כצפוי (איור 1B). Dofetilide ו- E4031 הם מעכבי ערוץ hERG18,19,20, המפורטים כתרופות אנטי-אריתמיות ניסיוניות מסוג III. זמן הדעיכה מתארך הן בטיפול דופטיליד (p < 0.05) והן בטיפול E4031 (p < 0.001) בהשוואה לקבוצת הרכב. הארכה של CTD50 (p < 0.01) ו- CTD90 (p < 0.001) עם טיפול E4031 נצפתה בהשוואה לרכב בלבד (טבלה 1), תוצאות אלה עולות בקנה אחד עם ההשפעות המדווחות על מרווח QT, מדידה רלוונטית מבחינה קלינית של רפולריזציה שנקבעה מאלקטרוקרדיוגרמה פני השטח מזמן רב בין תחילת גל ה- Q לסוף גל ה- T, במחקרים קודמים 12,21.

קושי בהערכת CTD בתאים מכים באופן ספונטני הוא קצב הפעימה המשתנה המוטל על ה- CTD. זוהי בעיה מיוחדת עבור מודל iPSC-CM, שבו כל באר של צלחת 96 באר יכולה להיות קצב פעימה משלה למרות שכל התאים מגיעים מאותו בקבוקון אב. ניתן להטיל קצב פעימה על ידי קצב אופטי או חשמלי. כדי להעריך את תגובת המינון של E4031 בתנאים קצביים מתוקננים, ChR2 ו-K-GECO7 המבטאים iPSC-CMs נשלטו אופטית באמצעות פולסים של אור של 1 הרץ 470 ננומטר ונצפו באמצעות האות K-GECO האדום (איור 2A ואיור משלים 1). הפחתה הדרגתית של משרעת שיא (p < 0.01) ועלייה בזמן הדעיכה (p < 0.05) של ארעי הסידן מתרחשת עם עלייה בריכוזים של E4031 (איור 2B1). ההשפעה תלוית המינון של E4031 הייתה בולטת ביותר עבור ההפחתה באמפליטודת השיא (איור 2B1,B2).

למרות שמחקרים קצרי טווח שנמשכים דקות משמשים בדרך כלל להערכות קרדיוטוקסיות, יש נקודה עיוורת להערכות רעילות כרונית אשר מקבילות לחשיפות מטופלים לתרופות במשך שבועות, חודשים או שנים. יהיה זה יתרון לחקור השפעות מחלה, או רעילות, על פני המרווחים המשקפים את משכי הטיפול הרלוונטיים לפרקטיקה הקלינית. השתמשנו במערכת הבקרה והזיהוי האופטית שלנו כדי לחקור את הקרדיומיוציטים שמקורם ב-iPSC ממטופל עם אי-דחיסה של החדר השמאלי (LVNC). iPSC-CMs הומרו עם ערכה ויראלית K-GECO (שלב 2.2-2.6) לאחר בידול יום 25. האות K-GECO היה במעקב כל 1-2 שבועות באותן בארות, עם או בלי טיפולים תרופתיים נוספים. הן פעילות סידן ספונטנית (איור 3A,3B) והן דינמיקת סידן תחת קצב אופטי (איור 3C,D, שלב 4.11) התקבלו באמצעות מערכת ההדמיה בעלת התוכן הגבוה (שלב 4.1-4.12) ועובדו על-ידי תוכנה לניתוח שיא סידן (שלב 6). כפי שהוכח באיור 3A,C, ארעי סידן צלולים נשארים גלויים לעין חודש לאחר ההתמרה הנגיפית, עם או בלי האור הנוסף המשמש לקצב אופטי. עבודה זו זיהתה תרופה שככל הנראה מגבירה את קצב הפעימה, מסדירה את מרווח ההתכווצות ומגבירה את משרעת הסידן החולפת במודל LVNC iPSC-CM (איור 3A,B). ישנן שתי תצפיות חשובות שיש לעשות מנתונים אלה. ראשית, מנקודת המבט הטיפולית, השפעת התרופה נראית עמידה ביום 63 וביום 70 נקודות זמן. שנית, ורלוונטי לשדה אשר באופן כללי בוחן השפעות מורכבות במהלך חלונות קצרים (<1 דקות) בנקודות זמן מוקדמות יותר (בדרך כלל <50 יום); ההשפעות המשנות את פנוטיפ המחלה של התרכובת ניכרות רק לאחר יום 60, מה שמרמז על כך שייתכן שיהיה קל לזלזל בתרופות שיש להן מנגנוני פעולה איטיים בפרוטוקולי סינון סטנדרטיים.

השונות של תדירות הפעימה, וההשפעה שלאחר מכן על משך הזמן החולף של הסידן, אינה רק בעיה טובה בכל נקודת זמן נתונה. הוא גם משתנה כאשר iPSC-CM נשמרים בתרבית, שמשתנה תוך זמן רב לאורך זמן (איור 3B). כדי לכפות עקביות בניסויים רציפים, ניתן ליישם קצב אופטי של 1 הרץ עם או בלי טיפול תרופתי (איור 3C,D). כאן למרות שתוצאות יום 63 מראות את המגמות המעודדות במעבר הסידן עם משרעת גבוהה משמעותית, CTD90 קצר יותר וזמן דעיכה קצר יותר; בנקודת הזמן של 70 יום - ומעידה על הצורך בהערכות כרוניות במהלך תהליך סינון התרופות למחלות נדירות - מוקדם לאחר גילוי דה-פולריזציה (EAD). הערך של הוספת פרוטוקול pacing לפנוטיפ של מחלות, או הערכת מולקולות קטנות, ניתן להערכה איכותית על ידי השוואה של התוצאות המוצגות באיור 3B,D עבור קצב פעימה, משרעת סידן חולפת, CTD90 וזמן דעיכה.

יתרון של GECI, בהשוואה לצבע כימי, מתודולוגיה מבוססת כדי לדמיין את חולף הסידן הוא היכולת להגביל את הבדיקה לתא מסוים בתוך התא. ניתן להרחיב זאת עוד יותר על ידי ריבוי גרסאות מרובות של צבע ו/או זיקה בתאים בודדים. לפיכך, מספר GECIs כולל ER-LAR-GECO9, mtGCEPIA 22,23 (או Oria1-G-GECO), ו- NIR-GECO2 8,24 פותחו לביטוי בנפרד, או בשילוב, במודלים תאיים למדידת פעילות סידן בזמן אמת הנובעת ברשתית האנדופלסמית / הרשתית הסרקופלסמית (ER/SR), המיטוכונדריה (או ערוץ CRAC) וציטוסול, בהתאמה. ניתן לשלב אותם במודל iPSC-CM (איור 4A,C) כדי לחקור את האינטראקציה בין מאגרי סידן תוך-תאיים שונים. לדוגמה, 10 mM טיפול קפאין ניתן להשתמש כדי לרוקן את חנות סידן SR. כאן ירידה של אות ER-LAR-GECO (המעיד על אובדן סידן מה-SR) מקבילה לירידה של אות ה-NIR-GECO (המעיד על עלייה בריכוז הסידן הציטוזולי) כצפוי. כיצד תאים תוך תאיים אחרים מושפעים מתנודות אלה אינו נחקר היטב. ובכל זאת, ההכללה של mtGCEPIA3 המיועד למיטוכונדריה ירוקה מראה כי ספיגת סידן מתרחשת במיטוכונדריה בתנאים אלה (איור 4A,B).

באופן דומה, ניתן לראות הדמיה של יחסי הגומלין בין זרמי סידן שונים על-ידי הכללת גשושית, Orai1-G-GECO25, כדי לחשוף את זרם Ca2+ המופעל על-ידי שחרור סידן (CRAC) (איור 4C,D). במודל iPSC-CM, האות הזה מתגבר עם מעבר הסידן הציטוזולי הספונטני (איור 4D1,D2). בהתאם לכך, טיפול בקפאין מעורר סידן גדול חולף הן בציטוזול והן מערוץ Orai1.

ידוע כי רוב ההדמיה החולפת של סידן במודלים של קרדיומיוציטים נקבעה באמצעות צבעי סידן26. מחוון סידן מקודד גנטית הושווה לצבע כימי במודל קרדיומיוציטים שמקורו ב-iPSC כדי לאפשר השוואה זה לצד זה של גישות שונות להדמיית סידן. K-GECO המבטאים iPSC-CMs צולמו לצד תאים טעונים ב-Fluo-4. K-GECO המבטא קרדיומיוציטים הראה התנהגות פעימה עקבית לאורך זמן (איור 5A,C). עם זאת, העמסת Fluo-4 השפיעה הן על תדירות הפעימות והן על ה-CTD במודל זה (איור 5B,C), מה שמרמז על כך ש-Fluo-4 עצמו עשוי להשפיע על התוצאות של ניסויים כאלה. זה יהיה נכון במיוחד לאחר חשיפה ארוכת טווח לבדיקת ההדמיה, שיכולה להתרחש בפורמט הדמיה מרובת דפנות אם מתרחשת הדמיה טובה היטב עם זמן שהייה של דקה לכל באר.

figure-results-1
איור 1: מעכבי תעלות יונים של מולקולות קטנות המופעלים על קרדיומיוציטים שמקורם ב-iPSC. (A-B) תמונות בהילוך מהיר של iPSC-CM המבטאות mNG-GECO שצולמו ב-25 הרץ. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (B) תנודות Ca2+ מייצגות לאחר הוספת תרכובת. אותות פלואורסצנטיים המתקבלים מתאים המבטאים mNG-GECO מוצגים כיחס פלואורסצנטי F/F0, כאשר F0 מוגדר כעוצמה בסיסית ו-F כעוצמה המתגלה בכל נקודת זמן. (C) תוכנת ניתוח שיא סידן יכולה לחלץ פרמטרים הכוללים חצי רוחב מקסימלי (CTD50), משך ארעי של 90% (CTD 90), זמן עלייה וזמן דעיכה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-2
איור 2: דוגמה לתגובת מינון באמצעות מעכב hERG E4031 בתוך מערכת קצב אופטית . (A) עקבות של גירוי אופטי עם 10% אור כחול בריכוזים שונים של E4031. תמונות בהילוך מהיר של קרדיומיוציטים שמקורם ב-iPSC המבטאים K-GECO צולמו ב-25 הרץ. (B1) עקבות מייצגים של ארעי סידן המתקבלים במינונים מורכבים שונים. ניתוח שיא ותגובת מינון של E4031 באמפליטודה (B2) ובזמן דעיכה (B3). פסים כחולים מציינים גירוי אור דופק של 1 הרץ 470 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-3
איור 3: פלטפורמה כל-אופטית מיושמת להקרנה פנוטיפית ארוכת טווח של תרופות בקרדיומיוציטים שמקורם בחולי LVNC. (A) עקבות מייצגים של פעילות פעימה ספונטנית בקרדיומיוציטים שמקורם בחולה (לאחר דיפרנציאציה יום 70) עם (אדום) או בלי (כחול) 5 מיקרומטר טיפול תרופתי. (B) ניתוח שיא של פעילות פעימה ספונטנית עם או בלי טיפול תרופתי של 5 מיקרומטר. (C) עקבות עוצמה של תגובת התרופה ב-iPSC-CM שמקורו בחולה תחת גירוי אופטי של 1 הרץ. (D) ניתוח שיא של קרדיומיוציטים שמקורם בחולה עם גירוי אופטי של 1 הרץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-4
איור 4: הדמיית Ca 2+ תת-תאית בשלושה ערוצים במודל iPSC-CM. (A-B) iPSC-CMs הומרו עם בדיקות סידן תת-תאיות עבור הציטופלסמה, NIR-GECO2 (אדום), הרשתית האנדופלסמית ER-LAR-GECO (צהוב), ו- mtGCEPIA3 (ציאן), מחוון Ca2+ מיטוכונדריאלי. (B) הדמיית סידן בהילוך מהיר של שלושה ערוצים לפני ואחרי טיפול בקפאין של 10 מ"מ. (C-D) iPSC-CMs המומרים עם ציטופלסמי, NIR-GECO2 (אדום), רשתית אנדופלסמית ER-LAR-GECO (צהוב), ואינדיקטורים ערוץ CRAC Orai1-G-GECO (ציאן) הודגמו. (D) נלכדה הדמיית סידן בהילוך מהיר של שלושה ערוצים. (ד1) פעילות ספונטנית של פעימה לפעימה נצפתה עם NIR-GECO2 ו- Orai1-G-GECO. (ד2) שטף סידן מה-ER (ירידה באות ER-LAR-GECO) ליווה עלייה באות הסידן הציטוזולי עם הטיפול בקפאין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-5
איור 5: השוואה של מחוון הסידן המקודד גנטית (K-GECO) לצבע הכימי הרגיש לסידן (Fluo-4) ב-iPSC-CMs. (A-B) עקבות סידן מייצגים של K-GECO (A) ו- Fluo-4 (B) מוצגים לאורך זמן. (C) ניתוח ארעי סידן של K-GECO מתומר, או פלואו-4 טעון iPSC-CM. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

BPMCTD50 (ים)CTD90 (ים)משרעת (F/F0)זמן עלייהזמן ריקבון (ים)
רכב (0.1% DMSO)112.3657+/-10.950.25+/-0.040.41+/-0.011.99+/-0.020.07+/-0.010.28+/-0.01
וראפאמיל (1 uM)0-----
דופטיליד (5 ננומטר)103.42+/-9.87**0.23+/-0.030.46+/-0.031.91+/-0.030.07+/-0.010.35+/-0.02*
E4031 (30 ננומטר)75.73+/-12.08***0.37+/-0.04**0.58+/-0.08***1.55+/-0.02**0.11+/-0.04***0.35+/-0.07**

טבלה 1: ההשפעות של תוספת תרכובת לפרמטרים של סידן חולף במודל iPSC-CM. ערכי מובהקות מסומנים על-ידי *(p ≤ 0.05), **(p < 0.01) ו- ***(p < 0.001).

סרטון אנימציה 1: פעילות סידן ספונטנית נצפתה על ידי mNG-GECO בקרדיומיוציטים שמקורם ב-iPSC עם רכב בלבד. סרט פסאודו-צבעוני של תמונה בקנה מידה אפור מסופק. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

איור משלים 1: ייצוג סכמטי של וקטור אדנו-ויראלי. זה כולל ערוץ רודופסין ChR2 כמפעיל, עם מחוון סידן פלואורסצנטי אדום K-GECO ככתב סידן לבדיקה אופטית מלאה. תעלת היונים הרגישה לאור מאפשרת לתאים מעוררים לעבור דה-פולריזציה על ידי אור בתחום הכחול-ירוק של הספקטרום הנראה. בניסויים אלה נעשה שימוש באור של 470 ננומטר. ארעי סידן בתאים מעוררים יכולים להיות מצולמים בו זמנית על ידי K-GECO, הדורש אור עירור ירוק, המייצר פליטות אדומות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

כדי לבצע בהצלחה סינון בתפוקה גבוהה, האותות חייבים להיות מפוזרים באופן שווה על פני כלי התרבית, מה שמבטיח שניתן יהיה ליישם אזורי עניין (ROIs) שנבחרו באקראי באופן אוטומטי במהלך רכישת ההדמיה. למרות שמדדי סידן כימיים עומדים בקלות בדרישה זו, בדיקות מקודדות גנטית ייצרו באופן היסטורי טלאים, ולא יריעות, של אות המגבילים את השימוש בהם. השימוש במערכת התמרה נגיפית מספק רמות ביטויגבוהות של 27,28 ושווה ערך של אינדיקטורים מרובים בקרב תאי המטרה בהשוואה לשיטות טרנספקציה קונבנציונליות. סוגי תאים שונים עשויים לדרוש מקדמים שונים, וייתכן שבחירת מערכת העברת הגנים תצטרך להשתנות בהתאםל-29,30,31. במודלים של תאים הטרוגניים, יעילות ההתמרה וההבעה עשויה להיות שונה בסוגי תאים ספציפיים. מצד אחד, זה עשוי להגביל את היישום לתאים מסוימים, אבל התופעה יכולה להיות מנוצלת כדי להבחין בין תאים מסוימים במערכת תרבית משותפת32.

ההשפעה העיקרית של גישה זו היא השחרור ממערכת היחסים של אחד לאחד בין הנסיין לבין המדגם על ידי אוטומציה. בניסוי סטנדרטי מרובה בארות, לאיסוף נתונים בארבעה מיקומים בתוך באר אחת, אנו מעריכים שנדרשות כ-15 שעות במיקרוסקופ כדי לאסוף סרטונים של 30 שניות מצלחת של 96 בארות. במערכת האוטומטית, זה לוקח ~ 4 שעות. יתר על כן, ניתוח הנתונים באופן ידני לוקח הרבה יותר זמן מאשר רכישת נתונים. מערכת הניתוח המשמשת כאן מהירה בערך פי 200 מהמקבילה הידנית. התוצאה נטו היא זרימת עבודה משופרת וחיסכון גבוה בעלויות ובזמן.

בניגוד לקרדיומיוציטים ראשוניים עמוסים בצבעי סידן ששורדים בסדר שעות, GECIs המתבטאים ב-iPSC-CM באמצעות מערכות העברת נגיפים יכולים להניב אות במודל ניסיוני שחי כמה חודשים. מודלים אלה יכולים להישמר בפורמט רב-בארות ולעקוב אחריהם בו-זמנית לצורך ניתוח סדרתי במערכות הדמיה בעלות תוכן גבוה שפותחו לסינון מולקולות קטנות. זה מייצר פלטפורמה ניסויית אנושית פשוטה לבדיקת השפעות תרופות על פני משכי זמן קרובים יותר לאלה שחווים חולים (שבועות או חודשים) ולא את הדקות המשמשות בדרך כלל במבחני טוקסיקולוגיה.

ניתן להרחיב את המערכת כדי לספק מדידות מרובות פרמטרים על ידי הכללת GECIs עם תכונות פליטה ייחודיות מירוק ועד אינפרה-אדום קרוב. ניסויים כאלה דורשים אורות עירור נאותים וערכות סינון בתכנון הניסוי כדי לשמור על אותות נפרדים. יישום רחב בהקשר של סינון תרופות דורש פלטפורמות ניתוח חזקות ויעילות בנוסף לחלוקת תרופות. למרות שהמודל המתואר כאן מתמקד בשימוש במספר מדדי סידן דינמיים, ניתן לשנות זאת לסמנים מבניים של צורת התא או תפקודו. בדרך כלל קל יותר לדמיין אותם מכיוון שהם מראים שונות קטנה מפעימה לפעימה בהשוואה לשונות של פי מאה בריכוז הסידן התוך-תאי. גישה זו עשויה להיות בעלת ערך רב במיוחד עבור מחלות נדירות שבהן ה-iPSC הנגזר מחולים עשוי להכיל את כל המניעים הגנטיים והמשנים של מצב מסוים אשר ניתן לשמר במודל תא הניתן להרחבה, מה שמקל על גילוי תרופות במחלות שונות המבוססות על פנוטיפים תאיים שניתן לדמיין ללא תלות במנגנון הביולוגי הבסיסי אשר עשוי להיות מאתגר להבהיר.

גילויים

LumiSTAR הגישה בקשה להגנת פטנט על השימוש ב-K-GECO, NIR-GECO ו-LAR-GECO.

תודות

אנו מודים לפרופ' רוברט קמפבל מאוניברסיטת טוקיו על שיתוף החומר והדיון בעל הערך; ד"ר צ'יה-לין הו ב מכשיר מולקולרי לתמיכה טכנית.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחת 96 בארותPerkin Elmer6055302
מערכת מיקרופלואידית אוטומטיתמכשירלמכשיר יש צינור יחיד שניתן להשתמש בו כדי להוסיף תרכובת באופן אוטומטי
קפאיןסיגמא-אולדריץ'C0750
Cardiosight-S l iPSC נגזר קרדיומיוציטיםNEXELC-002
דימתיל סולפוקסידMillipore Sigma1096780100
DofetilideSigma-AldrichPZ0016
E4031Tocris1808
ER-LAR-GECO ערכה ויראליתLumiSTARAA001aGECI מוסט לאדום ארוז בווקטור אדנו-ויראלי
פיברונקטיןסיגמא-אולדריץ'F1141
Fluo-4 AMInvitrogenF14201סידן כמי צבע רגיש
ג'לטיןSigma-AldrichG1890
ImageXpress מיקרו קונפוקלי מערכת הדמיה בעלת תוכן גבוהמכשיר
iPSC-CMs תחזוקה בינוניתNEXELCMS-002iPSC-CMs בינוני (Cardiosight-S בינוני) + תוסף Cardiosight-S
iPSC-CMs בינוני (Cardiosight-S בינוני)NEXELCMS-002
K-GECO ערכה ויראליתLumiSTARAA005aGECI מוסט לאדום ארוז בווקטור אדנו-ויראלי
תוכנת LumiCALLumiSTARLUCS01aתוכנה לניתוח שיא סידן בקרדיומיוציטים
mNG-GECO ערכה ויראליתLumiSTARAL008aGECI ירוק בהיר יותר ארוז בערכה ויראלית mt-GCEPIA3 וקטור לנטי-ויראלי
LumiSTARAL011aGECI targgeting על מיטוכונדריה ארוז ב וקטור לנטי-ויראלי
NIR-GECO ערכה ויראליתLumiSTARAV004aGECI אינפרא אדום קרוב ארוז בווקטור ויראלי
Orai1-GGECO ערכה ויראליתLumiSTARAL010aGECI targgeting על Orai1 ארוז בווקטור לנטי-ויראלי
מלחי טירודSigma-AldrichT2145
Verapamil hydrochlorideSigma-AldrichV4629
Y-27632 דיהידרוכלורידטוקריס1254
מולקולרי מולקולרי

מקורות

  1. O'Connor, M. D. The 3R principle: Advancing clinical application of human pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (2), 21(2013).
  2. Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  3. Ovics, P., et al. Drug development and the use of induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for disease modeling and drug toxicity screening. International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), 7320(2020).
  4. Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
  5. Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. Measurement of intracellular calcium. Physiological Reviews. 79 (4), 1089-1125 (1999).
  6. Smith, N. A., et al. Fluorescent Ca(2+) indicators directly inhibit the Na,K-ATPase and disrupt cellular functions. Science Signaling. 11 (515), (2018).
  7. Shen, Y., et al. A genetically encoded Ca2+ indicator based on circularly permutated sea anemone red fluorescent protein eqFP578. BMC Biology. 16 (1), 9(2018).
  8. Qian, Y., et al. A genetically encoded near-infrared fluorescent calcium ion indicator. Nature Methods. 16 (2), 171-174 (2019).
  9. Wu, J., et al. Red fluorescent genetically encoded Ca2+ indicators for use in mitochondria and endoplasmic reticulum. Biochemical Journal. 464 (1), 13-22 (2014).
  10. Zarowny, L., et al. and high-performance genetically encoded Ca2+ indicator based on mneongreen fluorescent protein. ACS Sensors. 5 (7), 1959-1968 (2020).
  11. Potekhina, E. S., et al. Drug screening with genetically encoded fluorescent sensors: today and tomorrow. International Journal of Molecular Sciences. 22 (1), 148(2021).
  12. Chang, Y. -F., et al. Non-invasive phenotyping and drug testing in single cardiomyocytes or beta-cells by calcium imaging and optogenetics. PLoS One. 12 (4), 0174181(2017).
  13. Chang, Y. -F., Arai, Y., Nagai, T. Optogenetic activation during detector "dead time" enables compatible real-time fluorescence imaging. Neuroscience Research. 73 (4), 341-347 (2012).
  14. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  15. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).
  16. Jang, Y., et al. Modulating cardiomyocyte and fibroblast interaction using layer-by-layer deposition facilitates synchronisation of cardiac macro tissues. Soft Matter. 16 (2), 428-434 (2020).
  17. Leonard, R. G., Talbert, R. L. Calcium-channel blocking agents. Clinical Pharmacology. 1 (1), 17-33 (1982).
  18. Sanguinetti, M. C., Jurkiewicz, N. K. Two components of cardiac delayed rectifier K+ current. Differential sensitivity to block by class III antiarrhythmic agents. The Journal of General Physiology. 96 (1), 195-215 (1990).
  19. Lees-Miller, J. P., Duan, Y., Teng, G. Q., Duff, H. J. Molecular determinant of high-affinity dofetilide binding to HERG1 expressed in Xenopus oocytes: Involvement of S6 sites. Molecular Pharmacology. 57 (2), 367-374 (2000).
  20. Kamiya, K., Niwa, R., Mitcheson, J. S., Sanguinetti, M. C. Molecular determinants of HERG channel block. Molecular Pharmacology. 69 (5), 1709-1716 (2006).
  21. Fukushima, H., et al. Specific induction and long-term maintenance of high purity ventricular cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells. PLoS One. 15 (11), 0241287(2020).
  22. Suzuki, J., Kanemaru, K., Iino, M. Genetically encoded fluorescent indicators for organellar calcium imaging. Biophysical Journal. 111 (6), 1119-1131 (2016).
  23. Suzuki, J., et al. Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA. Nature Communications. 5, 4153(2014).
  24. Qian, Y., et al. Improved genetically encoded near-infrared fluorescent calcium ion indicators for in vivo imaging. PLoS Biology. 18 (11), 3000965(2020).
  25. Dynes, J. L., Amcheslavsky, A., Cahalan, M. D. Genetically targeted single-channel optical recording reveals multiple Orai1 gating states and oscillations in calcium influx. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (2), 440-445 (2016).
  26. Broyles, C. N., Robinson, P., Daniels, M. J. Fluorescent, bioluminescent, and optogenetic approaches to study excitable physiology in the single cardiomyocyte. Cells. 7 (6), 51(2018).
  27. Cao, F., et al. Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells. Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 15-24 (2010).
  28. Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors. Stem Cells. 21 (1), 111-117 (2003).
  29. Haery, L., et al. Adeno-associated virus technologies and methods for targeted neuronal manipulation. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 93(2019).
  30. Nieuwenhuis, B., et al. Optimization of adeno-associated viral vector-mediated transduction of the corticospinal tract: Comparison of four promoters. Gene Therapy. 28 (1), 56-74 (2021).
  31. Smith, R. L., et al. Characterization of promoter function and cell-type-specific expression from viral vectors in the nervous system. Journal of Virology. 74 (23), 11254-11261 (2000).
  32. Fang, Y., et al. Safety and efficacy of an immune cell-specific chimeric promoter in regulating anti-PD-1 antibody expression in. CAR T cells. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 19, 14-23 (2020).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

iPSC
בקרה אופטית בתפוקה גבוהה ורישום אות סידן בקרדיומיוציטים שמקורם ב-iPSC לבדיקת רעילות ובדיקת תרופות פנוטיפית
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.