פיתוח מוקדם תלוי במוצרים שעברו בירושה אימהית, ותפקידם של רבים ממוצרים אלה אינו ידוע כיום. כאן תיארנו פרוטוקול המשתמש ב-CRISPR-Cas9 כדי לזהות פנוטיפים בעלי השפעה אימהית בדור אחד.
מאמר שיטה
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1 M Tris-HCl (pH 8.4) | Invirogen | 15568025 | לתערובת PCR |
| 1.5 מ"ל צינורות אפנדורף | כל יצרן | ||
| 10 מ"מ dNTPs | תרמו פישר | 18427013 | סינתזה של gRNA |
| 100 BP סולם | כל יצרן | לאלקטרופורזה ג'ל | |
| 100% אתנול ללא RNA | כל יצרן | ||
| 100% RNAse אתנול | חופשי כל יצרן | ||
| 100 מ"ל | כל יצרן | להפריה חוץ גופית | |
| 5 מ 'אמוניום אצטט | תרמו פישר מדעי | נמצא בערכת התמלול MEGAshortscript T7 | סינתזה של gRNA |
| 70% סינתזת אתנול | של gRNA (70 מ"ל אתנול + 30 מ"ל של מים ללא נוקלאז) | ||
| בורוזיל 1.0 מ"מ OD x 0.5 מ"מ מזהה | FHC INC | 27-30-1 | עבור מיקרו הזרקה |
| בתפזורת פארמה נתרן ביקרבונט 35 פאונד | אספקת שונית בתפזורת | 255 | אספקת דגים |
| CaCl2 | MiliporeSigma | C7902 | |
| Cas9 חלבון עם NLS | PNABio | CP01 | |
| ChopChop | https://chopchop.cbu.uib.no/ | ||
| קבוע אוליגונוקלאוטיד | משולב DNA טכנולוגיות (IDT) | AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATGATAACGGACTA GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC TAGCTCTAAAAC | |
| דיכאון זכוכית צלחת | תרמו פישר מדעי | 13-748B | להפריה חוץ גופית |
| כריתת מלקחיים | דומונט | SS | להפריה חוץ גופית |
| מספריים | כלי מדע עדינים | 14091-09 | להפריה חוץ גופית |
| ניתוח סטרוסקופ (עם מקור אור מועבר) | כל יצרן | להפריה חוץ גופית | |
| DNA נקי & רכז -5 | Zymo Research | D4014 | סינתזה של gRNA |
| DNA ג'ל טעינת צבע (6x) | כל יצרן | לאלקטרופורזה ג'ל | |
| EconoTaq DNA פולימראז | Lucigen | 30032-1 | עבור PCR תערובת |
| אלקטרופרזיס ספק כוח | כל יצרן | ||
| https://useast.ensembl.org/index.html | |||
| אפנדורף טיפים למיקרו-מעמיס Femtojet למיקרו-מזרק Femtojet | תרמו פישר E5242956003 מדעי | למיקרו-הזרקה | |
| אתנול (200 הוכחה, ללא נוקלאז) | כל יצרן | ||
| FemtoJet 4i | Eppendorf | 5252000021 | לרשת דגים מיקרו-הזרקה |
| כל יצרן | אספקת דגים | ||
| קפוא שרימפס | מי מלח שרימפס ישיר | ציוד לדגים | |
| כללי לכל מטרה Agarose | כל יצרן | עבור ג'ל אלקטרופורזה | |
| אוליגונוקלאוטיד ספציפי לגן | DNA משולבות (IDT) | TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG | |
| כפפות | כל יצרן | ||
| דלי קרח | כל יצרן | ||
| מלח אוקיינוס מיידי | כל יצרן | אספקת דגים | |
| Invitrogen UltraPure Ethidium Bromide, 10 מ"ג/מ"ל | תרמו פישר סיינטיפיק | 15-585-011 | |
| KCl | MiliporeSigma | P5405 | |
| KH2PO4 | MiliporeSigma | 7778-77-0 | |
| Kimwipes | Thermo Fischer Scientific | 06-666 | |
| זכר & נקבת דג | |||
| MEGAshortscript T7 ערכת תמלול | תרמו פישר מדעי | AM1354 | סינתזה של gRNA |
| מתילן כחול | תרמו פישר | AC414240250 | מדעי עבור E3 |
| MgCl2 | MiliporeSigma | 7791-18-6 | עבור תערובת PCR |
| MgSO2· 7H2O | MiliporeSigma | M2773 | |
| עובש פלסטיק מיקרו-הזרקה | World Precision Instruments | Z-Templates | עבור מיקרו-מניפולטור מיקרו-הזרקה |
| כל יצרן | עבור | ||
| מיקרו-הזרקת מיקרו-פיפטרים | כל יצרן | ||
| חולץ מיקרופיפטה | סאטר | P-87 | עבור מיקרו-הזרקה |
| טיפים למיקרופיפטר עם מסננים (כל הגדלים) | כל יצרן | ||
| טיפים מיקרופיפטר ללא מסננים (כל הגדלים) | כל יצרן | ||
| מיקרוגל | כל יצרן | ||
| שמן מינרלי | MiliporeSigma | m5904-5ml | למיקרו-הזרקה |
| MS-222 (טריקאין-D) | כל יצרן | מאושר על ידי ה-FDA | |
| Na2 HPO4 | MiliporeSigma | S3264 | |
| NaCl | MiliporeSigma | S5886 | |
| NaHC03 | MiliporeSigma | S5761 | |
| Nanodrop | כל יצרן | ||
| NaOH | MiliporeSigma | 567530 | |
| Nonstick, צינורות מיקרופוגה ללא RNase, 1.5 מ"ל | אמביון | AM12450 | סינתזה של gRNA |
| מים נטולי נוקלאז | כל יצרן | ||
| מגבת נייר | כל יצרן | ||
| פסטרו פיפטס | כל יצרן | ||
| צינורות רצועת PCR | כל יצרן | ||
| צלחות פטרי קוטר 100 מ"מ | כל יצרן | ||
| תמיסת פנול אדום | MiliporeSigma | P0290 | עבור מיקרו הזרקת |
| פלסטיק pestals | VWR | 47747-358 | עבור IVF |
| כף פלסטיק | IVF כל יצרן | עבור IVF | |
| פרימיום כיתה מלח שרימפס ביצי | שרימפס ישיר | רשת עדינה | |
| RNA ג'ל טעינת צבע | נמצא ב MEGAshortscript T7 ערכת תמלול | עבור ג'ל אלקטרופורזה | |
| RNAse AWAY | תרמו פישר מדעי | 21-402-178 | |
| קנה מידה | כל יצרן | ||
| שארפי | כל יצרן | ||
| מרית | כל יצרן | ||
| סטרילי H2O | כל יצרן | לתערובת PCR | |
| T4 DNA פולימראז | NEB | M0203 | סינתזה של קלטת gRNA |
| כל יצרן | |||
| TBE (Tris-Borate-EDTA) 10x | כל יצרן | עבור ג'ל אלקטרופורזה | |
| מכתים תה | אמזון | IMU-71133W | אספקת |
| דגיםThermo Scientific Owl מסרק 12 שיניים, עובי 1.0/1.5 מ"מ, דו צדדי עבור B2 | Thermo Fischer Scientific | B2-12 | לאלקטרופורזה של ג'ל |
| Thermo Scientific ינשוף EasyCast B2 מיני ג'ל מערכות אלקטרופורזה | תרמו פישר סיינטיפיק | 09-528-110B | לאלקטרופורזה של ג'ל |
| תרמו-סייקלר | כל יצרן | ||
| Thermocycler | כל יצרן | ||
| Transilluminator | כל יצרן | ||
| מנורת UV | UVP | דגם XX-15 (Cat מס' UVP18006201) | למשקפי בטיחות UV IVF |
| כל יצרן | עבור | ||
| IVF לשטוף בקבוק | תרמו פישר מדעי | S39015 | אספקת דגים |
| דג זברה קופסאות הזדווגות | אקווה שוורץ | SpawningBox1 | אספקת דגים |
| 1.5 מ"ל צינורות אפנדורף | פישר סיינטיפיק | 05-402-11 | |
| 10 טוחנת dNTPs | תרמו פישר סיינטיפיק | 18427013 | |
| 100 BP סולם | תרמו פישר סיינטיפיק | 15628019 | |
| 100% אתנול ללא RNAse | כל יצרן | ||
| 5 מ' אמוניום אצטט | תרמו פישר סיינטיפיק | ||
| 70% אתנול | 70 מ"ל אתנול ו-30 מ"ל מים ללא נוקלאז | ||
| אביזרים לתיבת ג'ל אופקית | פישר סיינטיפיק | 0.625 מ"מ | |
| אגרוז | כל יצרן | ||
| CaCl2 | Sigma | 10043-52-4 | |
| CaCl2, dihydrate | Sigma | 10035-04-8 | E3 |
| צינורות נימיים בינוניים | Cole-Parmer | UX-03010-68 | למחטי הזרקה |
| Cas9 חלבון | Thermo Fischer Scientific | A36496 | |
| ChopChop | https://chopchop.cbu.uib.no/ | ||
| מחשב | כל יצרן | ||
| ניתוח תפיסות | כל יצרן | ||
| ניתוח מיקרוסקופ | כל יצרן | ||
| ניתוחי מספריים | כל יצרן | ||
| DNA נקי & רכז -5 | Zymo Research | D4014 | |
| DNA צבע טעינת ג'ל (6X) | Thermo Fischer Scientific | R0611 | |
| EconoTaq DNA פולימראז | Lucigen | 30032-1 | |
| אנסמבל | https://useast.ensembl.org/index.html | ||
| Eppendorf Microloader PipetteTips | Fischer Scientific | 10289651 | 20 מיקרוליטר |
| אתנול (200 הוכחה, ללא נוקלאז) | כל יצרן | ||
| אתידיום ברומיד | תרמו פישר מדעי | 15585011 | |
| רשת דגים | כל יצרן | רשת עדינה | |
| שרימפס מלח קפוא | LiveAquaria | CD-12018 | מזון |
| דגים מסרק ג'ל (0.625 מ"מ) | כל יצרן | ||
| ג'ל אלקטרופרזיס מערכת | כל יצרן | ||
| משולבות אוליגונוקלאוטידים ספציפיות לגן | (IDT) | ||
| מחט קפילרית זכוכית | 21TZ99 | https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88 VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL w_wcB:G:s& s_kwcid=AL!2966!3! 264955916096!!! g!438976 780705!& gucid=N:N:PS:משולם :GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501 231& gclid=Cj0KCQjw8IaGBh CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI 964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw _wcB& gclsrc=aw.ds | |
| כלי זכוכית | כל יצרן | ||
| פתרון | 9.9 מ"ל של Hank's Premix עם 0.1 מ"ל HS Stock #6 | ||
| Hank's Premix | שלב את הדברים הבאים לפי הסדר: (1) 10.0 מ"ל HS #1, (2) 1.0 מ"ל HS#2, (3) 1.0 מ"ל HS#4, (4) 86 מ"ל ddH2O, (5) 1.0 מ"ל HS#5. אחסן את כל תחליפי HS ב-4C | ||
| Hanks Solution | |||
| Hank's Solution | |||
| https://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization-Hank's Stock Solution #1 | 8.0 גרם NaCl, 0.4 גרם KCl ב-100 מ"ל ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #2 | 0.358 גרם Na2HPO4 נטול מים; 0.60 גרם K2H2PO4 ב-100 מ"ל ddH2O | ||
| תמיסת המלאי של האנק #4 | 0.72 גרם CaCl2 ב-50 מ"ל ddH2O | ||
| תמיסת המלאי של האנק #5 | 1.23 גרם MgSO47H2O ב-50 מ"ל ddH20 | ||
| תמיסת המלאי של האנק #6 | 0.35 גרם NaHCO3 ב-10.0 מ"ל ddH20; הפוך את יום השימוש הטרי | ||
| HCl | Sigma | 7647-01-0 | |
| דלי קרח | לכל יצרן | ||
| מלח אוקיינוס מיידי | כל יצרן | עבור מי דגים | |
| ערכת תמלול במבחנה מגה סקריפט קצר | תרמו פישר מדעי | AM1354 | |
| Invitrogen™ UltraPure&Trade; DNase/RNase ללא מים מזוקקים | Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| KCl | Sigma | 7447-40-7 | E3 בינוני |
| KH2PO4 | Sigma | 7778-77-0 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
| זכר ונקבה דג | |||
| Mega Short Script T7 Transciption Kit | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | |
| מתילן כחול | פישר מדעי | AC414240250 | E3 בינוני |
| MgSO2-7H2O | סיגמא | M2773 | |
| Microimicromanipulator | |||
| עובש פלסטיק מיקרו-הזרקה | מכשירים דיוק עולמי | Z-תבניות | |
| מיקרו-מזרק | |||
| מיקרו-מחט שקופיות | |||
| Micropipeter (1-10) עם טיפים | כל יצרן | צריך p10 מסוננים טיפים | |
| Micropipetter (20-200) עם טיפים | כל יצרן | ||
| Micropippetter (100-1000) עם טיפים | כל יצרן | ||
| מיקרופלסטיק שקופיות | |||
| מיקרוגל | כל יצרן | ||
| MiliQ מים | כל יצרן | ||
| שמן מינרלי | סיגמא-אולדריץ' | M5904-5 מ"ל | |
| Na2HPO4 | Sigma | ||
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaHC02 | Sigma | 223441 | |
| Nanodrop | |||
| NaOH | Sigma | 567530 | |
| מרית צרה | כל יצרן | ||
| חולץ מחט | Sutter | P-97 | |
| מגבת נייר | כל יצרן | ||
| Pastro Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| PCR פריימר מאגף מדריך אתר טכנולוגיות | DNA משולבות (IDT) | ||
| PCR פריימרים מאגפים מדריך RNA אתר חיתוך טכנולוגיות | DNA משולבות (IDT) | סטנדרטי מותפל | |
| צינורות רצועת PCR | תרמו פישר מדעי | AB0771W | |
| פטרי כלים | פישר מדעי | FB0875714 | 10 ס"מ קוטר 100 מ"מ x 15 מ"מ |
| פנול אדום | פישר מדע | S25464 | |
| https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464 טיפים פיפטה | כל יצרן | טיפים 10ul, 200ul ו-1000ul | |
| מזיקים מפלסטיק | פישר סיינטיפיק | 12-141-364 | |
| כפית פלסטיק | כל יצרן | ||
| מדריך פריימר אתר | DNA משולבות (IDT) | ||
| סכין גילוח | Uline | H-595B | |
| RNA ג'ל טוען צבע | בערכת סקריפט מגה קצר (ערכת העברה במבחנה) | ||
| RNAse | משם פישר | 21-402-178 | |
| צינורות מיקרוצנטריפוגה מפוליפרופילן ללא RNA | תרמו פישר AM12400 מדעי | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400 | |
| מים ללא RNAse | פישר סיינטיפיק | 10-977-023 | |
| קנה מידה | כל יצרן | ||
| שארפי | כל יצרן | ||
| נתרן ביקרבונט (תא נבדק תרבית) | Sigma | S5761 | מי דגים |
| נתרן ברומיד סולוטיון | Sigma | E1510 | |
| תוכנה לניתוח | |||
| ספקטרופוטומטר | |||
| Sterlie H2O | כל מותג | ||
| T4 DNA פולימראז | NEB | M0203S | https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information |
| הדבק | כל מותג | ||
| TBE (Tris-Borate-EDTA) 10X | Thermo Fischer Scientific | B52 | |
| https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52 Tea Stainer | אמזון | IMU-71133W | זמין ברוב חנויות המטבחים |
| Thermocycler | |||
| העברת פיפטה | Uline | S-24320 | |
| Transilluminator | |||
| Tricaine | fisher Scientific | NC0872873 | |
| Tris HCl 7.5 | Thermo Fischer Scientific | 15567027 | |
| Universal Primer | Integrated DNA Technologies (IDT) | AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG CCTTATTTTTTAACTTGCTATTTCTA GCTCTAAAAC | |
| מנורת UV | UVP | ||
| משקפי בטיחות | UV כל יצרן | ||
| בקבוק | כביסה פישר מדעי | S39015 | |
| קופסאות הזדווגות דג זברה | כל יצרן | ||
| PCR מתכון | מאגרהוסף 171.12 מ"ל H20 סטרילי; 0.393 מ"ל 1M MgCl2; 2.616 מ"ל 1M MgCl2; 2.618 מ"ל 1M Tris-HCl (pH 8.4) 13.092 מ"ל 1M KCl; 0.262 מ"ל 1% ג'לטין. אוטוקלאב למשך 20 דקות ואז מצננים את הסולו על קרח. לאחר מכן הוסף 3.468 מ"ל 100 מ"ג/מ"ל BSA; 0.262 מ"ל dATP (100 מ"מ), 0.262 מ"ל dCTP (100 מ"מ); 0.262 מ"ל dGTP (100 מ"מ); 0.262 מ"ל dTTP (100 מ"ל). אליציטוט לצינורות אפנדורף סטריליים |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאה