הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

קביעת תפקידם של גנים המבוטאים על ידי האם בהתפתחות מוקדמת עם קריספנטים אימהיים

2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63177

⸱

21 בדצמבר 2021

 ,  , 
1Laboratory of Genetics, University of Wisconsin-Madison

במאמר זה

סיכום

פיתוח מוקדם תלוי במוצרים שעברו בירושה אימהית, ותפקידם של רבים ממוצרים אלה אינו ידוע כיום. כאן תיארנו פרוטוקול המשתמש ב-CRISPR-Cas9 כדי לזהות פנוטיפים בעלי השפעה אימהית בדור אחד.

תקציר

ההתפתחות המוקדמת תלויה במאגר של גורמים אימהיים המשולבים בביצית הבוגרת במהלך האוגנזה המבצעים את כל הפונקציות התאיות הדרושות להתפתחות עד להפעלת הגנום הזיגוטי. בדרך כלל, מיקוד גנטי של גורמים אימהיים אלה דורש דור נוסף כדי לזהות פנוטיפים של השפעה אימהית, המעכב את היכולת לקבוע את תפקידם של גנים המבוטאים על ידי האם במהלך ההתפתחות. גילוי יכולות העריכה הדו-אליליות של CRISPR-Cas9 איפשר הקרנה של פנוטיפים עובריים ברקמות סומטיות של עוברים מוזרקים או "קריספונים", מה שהגביר את ההבנה של התפקיד שממלאים גנים בעלי ביטוי זיגוטי בתוכניות התפתחותיות. מאמר זה מתאר פרוטוקול שהוא הרחבה של שיטת ה-crispant. בשיטה זו, העריכה הדו-אלילית של תאי הנבט מאפשרת בידוד של פנוטיפ בעל אפקט אימהי בדור אחד, או "קריספנטים אימהיים". ריבוי רנ"א מנחה למטרה אחת מקדם ייצור יעיל של קריספנטים אימהיים, בעוד שניתוח רצף של ההפלואידים הקריפנטים האימהיים מספק שיטה פשוטה לאימות נגעים גנטיים המייצרים פנוטיפ אפקט אימהי. השימוש בקריספנטים אימהיים תומך בזיהוי מהיר של גנים חיוניים המתבטאים באופן אימהי, ובכך מקל על ההבנה של התפתחות מוקדמת.

מבוא

מאגר של מוצרים שהופקדו על ידי האם (למשל, רנ"א, חלבונים וביו-מולקולות אחרות) נחוץ לכל התהליכים התאיים המוקדמים עד להפעלת הגנום הזיגוטי של העובר1. הידלדלות מוקדמת של מוצרים אלה מהביצית היא בדרך כלל קטלנית עוברית. למרות חשיבותם של גנים אלה בהתפתחות, תפקידם של גנים רבים המתבטאים באופן אימהי אינו ידוע כיום. התקדמות בטכנולוגיית עריכת גנים בדגי זברה, כגון CRISPR-Cas9, מאפשרת מיקוד של גנים המתבטאים באופן אימהי 2,3,4. עם זאת, זיהוי של פנוטיפ אפקט אימהי דורש דור נוסף בהשוואה לפנוטיפ זיגוטי, ולכן דורש יותר משאבים. לאחרונה, יכולת העריכה הדו-אלילית של CRISPR-Cas9 שימשה לסינון פנוטיפים עובריים ברקמות סומטיות של עוברים מוזרקים (F0), המכונים "פרישנים"5,6,7,8,9,10. טכניקת ה-crispant מאפשרת סינון חסכוני במשאבים של גנים מועמדים בתאים סומטיים, מה שמקל על ההבנה של היבטים ספציפיים בהתפתחות. הפרוטוקול המתואר במאמר זה מאפשר זיהוי של פנוטיפים בעלי השפעה אימהית, או "פרישים אימהיים", בדור אחד11. סכימה זו ניתנת להשגה על ידי ריבוי רנ"א מנחה לגן יחיד וקידום אירועי עריכה ביאליים בגרמלין. עוברים חדים אימהיים אלה ניתנים לזיהוי על ידי פנוטיפים מורפולוגיים גסים ועוברים אפיון ראשוני, כגון תיוג עבור גבולות התא ותבנית DNA11. ניתוח משולב של הפנוטיפ הנצפה והאפיון המולקולרי הבסיסי של ה-INDELs המושרים מאפשר לחזות את תפקידו של הגן הממוקד בהתפתחות מוקדמת.

בדגי זברה, במהלך 24 השעות הראשונות שלאחר ההפריה (hpf), קבוצה קטנה של תאים מתפתחת לתאי הנבט הקדמוניים, מבשר לנבט12,13,14,15. במצמדים שהונחו על ידי נקבות F0, שיעור העוברים החדים האימהיים שהתאוששו תלוי בכמה תאי נבט מכילים אירוע עריכה ביאלי בגן הממוקד. באופן כללי, ככל שאירוע העריכה מתרחש מוקדם יותר בעובר, כך גדלה ההסתברות לצפייה במוטציות CRISPR-Cas9 בגרמן. ברוב המקרים, הפנוטיפים של עוברים פריכים אימהיים נובעים מאובדן תפקוד בשני האללים האימהיים הקיימים בביצית המתפתחת. כאשר הביצית מסיימת את המיוזה, אחד האללים האימהיים מובלט מהעובר דרך גוף הקוטב, ואילו האלל השני משתלב בפרונוקלאוס האימהי. הריצוף של מספר הפלואידים החד-קרניים האימהיים ייצג תערובת של המוטציות (החדרות ו/או מחיקות (INDELs)) הקיימות בגרמלין התורמות לפנוטיפ11.

הפרוטוקול הבא מתאר את הצעדים הדרושים ליצירת מוטציות CRISPR-Cas9 בגנים בעלי השפעה אימהית ולזיהוי הפנוטיפ המתאים באמצעות גישה של פרישנט אימהי (איור 1). החלק הראשון יסביר כיצד לתכנן וליצור באופן יעיל רנ"א מנחה, בעוד שסעיפים 2 ו-3 מכילים שלבים קריטיים ליצירת קריספנטים אימהיים על ידי מיקרו-הזרקה. לאחר הזרקת תערובת CRISPR-Cas9, עוברים מוזרקים נבדקים לעריכות סומטיות באמצעות PCR (סעיף 4). לאחר שעוברי F0 המוזרקים מתפתחים ומגיעים לבגרות מינית, נקבות ה-F0 עוברות לזכרים מסוג בר, וצאצאיהן נבדקים לפנוטיפים בעלי השפעה אימהית (סעיף 5). החלק השישי כולל הוראות להכנת הפלואידים קריספנטים אימהיים שניתן לשלב עם ריצוף סנגר כדי לזהות את ה-INDELs המושרים על ידי CRISPR-Cas9. בנוסף, הדיון מכיל שינויים שניתן לבצע בפרוטוקול כדי להגביר את הרגישות והעוצמה של שיטה זו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

במחקרים שהובילו לפיתוח פרוטוקול זה, כל הדיור והניסויים של דגי זברה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון (IACUC-M005268-R2).

1. סינתזה של רנ"א מנחה

הערה: קריספנטים זיגוטיים נוצרו באמצעות RNA מנחה יחיד או ריבוי רנ"א מנחה מרובים למטרה אחת 5,6,7,8,9,10. ריבוי הרנ"א המנחה מגדיל את אחוז העוברים המציגים פנוטיפ פריך זיגוטי10. בשל התדירות המוגברת הזו של עוברים המציגים פנוטיפ, קריספנטים אימהיים נוצרים על ידי ריבוי ארבעה רנ"א מנחים לגן יחיד. פרוטוקול מפורט יותר על שימוש ב- CHOPCHOP לתכנון רנ"א מנחה ושיטת חישול לסינתזה של RNAs מנחים עבור דגי זברה ניתן למצוא במקומות אחרים 16,17,18,19,20.

  1. כדי לזהות גן בעל ביטוי אימהי שיש להתמקד בו, ודא את רמות השעתוק של mRNA במהלך הפיתוח באמצעות מסד נתונים של רצף RNA המספק מידע על תעתיק מזיגוטה עד 5 ימים21. באופן כללי, גנים ספציפיים לאמהות באים לידי ביטוי גבוה בעובר המוקדם ומתפרקים לאחר הפעלת הגנום הזיגוטי22.
  2. לאחר זיהוי גן מטרה בעל ביטוי אימהי, קבע את תחום החלבון החזוי הראשון באמצעות סעיף "תחומים ותכונות" הזמין בדפדפן הגנום של Ensembl23. השתמש בתחום זה כאזור היעד עבור ארבעת הרנ"א המנחים.
  3. השתמש בתוכנית בחירת ה-RNA המנחה CHOPCHOP כדי לזהות ארבעה אתרי יעד של RNA מנחה בתחום הפעיל הראשון. תכנון אוליגונוקלאוטידים ספציפיים לגנים, כפי שמוצג להלן עבור כל אתר יעד. באוליגונוקלאוטיד הספציפי לגן, מקטע N20 מתאים לרצף המטרה מינוס אתר PAM (NGG) מ-CHOPCHOP. סדרו את האוליגונוקלאוטידים הספציפיים לגנים האלה ואת האוליגונוקלאוטיד הקבוע באמצעות טיהור סטנדרטי של חומרים (ראו טבלת חומרים).
    אוליגונוקלאוטיד ספציפי לגן:
    5' TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGGATAGAAATAGCAAG 3'
  4. כדי ליצור תבנית RNA מנחה עבור כל אוליגונוקלאוטיד ספציפי לגן, יש להצמיד אותה לאוליגונוקלאוטיד הקבוע ולמלא את השלוחות בפולימראז T4-DNA כפי שתואר קודם לכן16. לאחר הרכבת ארבע תבניות ה-RNA המנחות, יש לטהר ולרכז אותן יחד באמצעות ערכת ניקוי DNA וריכוז בהתאם להוראות היצרן (ראו טבלת חומרים).
  5. סנתז את תערובת ה-sgRNA מתבנית ה-RNA של המדריך באמצעות ערכת שעתוק T7 במבחנה (ראו טבלת חומרים). בצע את התמלול במבחנה בהתאם להוראות היצרן. שימוש בחצאי תגובות של ערכת השעתוק T7 יכול להפחית את העלות לתגובה.
  6. לאחר סינתזת RNA, טהרו את המאגר שנוצר של sgRNA באמצעות פרוטוקול אתנול/אמוניום אצטט כפי שתואר קודם לכן 16,20,24. לאחר שהרנ"א בודד, יש להשעות אותו ב-20 μL של מים נטולי נוקלאז. אם נעשה שימוש בחצי תגובות של ערכת השעתוק T7 כדי לתמלל את מאגר ה-sgRNA, יש להשהות את הרנ"א המטוהר ל-10-15 מיקרון מים נטולי נוקלאז.
  7. לכמת את כמות ה-sgRNAs המאוגדים שנוצרו באמצעות ספקטרופוטומטר. לדלל את מאגר ה-sgRNAs במים נטולי נוקלאז לדילול של 1500 ng/μL ± 500 ng/μL. בדרך כלל, הנפח הסופי של דילול העבודה נע בין 30-50 μL.
  8. לאחר קביעת הריכוז של מאגר ה- sgRNAs, ודא את שלמות ה- sgRNAs על ג'ל אגרוז של 1%.
    1. יצוק 1% אגרוז/0.5 מיקרוגרם/מ"ל אתידיום ברומיד/ג'ל TBE. לאחר שהג'ל התמצק, הניחו אותו במאגר TBE.
    2. יש לערבב 1 μL מתערובת sgRNA ו-1 μL של מאגר טעינת ג'ל RNA (ראו טבלת חומרים). טען דגימה זו בג'ל והפעל את הג'ל ב 100 V במשך 5 דקות.
  9. דמיינו את הפסים באמצעות אור אולטרה סגול (UV). מאגר ה-sgRNAs אמור להופיע כלהקה אחת. אם נצפה מריחה, סביר להניח שהתרחשה השפלת RNA.
  10. אחסנו את מאגר ה-sgRNAs באליקוטים חד-פעמיים של 1 μL בצינורות רצועת PCR נטולי נוקלאז במקפיא של -80 מעלות צלזיוס. עבור כמויות גדולות של תערובת sgRNAs (30 μL או יותר), aliquot מחצית מהנפח לתוך צינורות רצועת PCR ללא נוקלאז ולאחסן את החצי השני כנפח גדול יותר בצינור microcentrifuge ללא נוקלאזה. להפשיר ולהציף בעת הצורך.
  11. כדי למנוע התדרדרות RNA, ודא שהדגימות בצינור המיקרוצנטריפוגה עוברות לא יותר משני מחזורי הפשרה בהקפאה.

2. הכנת ריאגנטים וחומרים למיקרו הזרקה

הערה: בדגי זברה, הזרקת Cas9 mRNA יכולה ליצור פריכים זיגוטיים. עם זאת, מחקרים הראו כי חלבון Cas9 יעיל יותר ביצירת INDELs בעוברים מוזרקים16,25. פרוטוקול זה משתמש בחלבון Cas9 כדי לייצר פריסנטים אימהיים מכיוון שחלבון זה אינו חווה את אותה פיגור בפעילות כמו ה-mRNA של Cas9 שהוזרק. בתיאוריה, זה אמור להגדיל את ההסתברות למוטציה ביאלית בשלב מוקדם בהתפתחות, וכתוצאה מכך גדל הסיכוי שמקטע נרחב יותר של הנבט יושפע. פרוטוקולים ומשאבים אחרים המפרטים כיצד להתכונן למיקרו-הזרקות ניתן למצוא במקומות אחרים24,26.

  1. רכשו או הפיקו חלבון Cas9 (ראו טבלת חומרים). יש למרוח את חלבון Cas9 במים נטולי נוקלאז כדי ליצור תמיסה של 2 מ"ג/מ"ל ו-aliquot 1 μL לתוך צינורות מיקרו-צנטריפוגה מפוליפרופילן ללא RNase. אחסן אותם כצינורות חד-פעמיים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
  2. אחר הצהריים לפני ההזרקה, השתמש במושך מיקרופיפטה כדי למשוך נימי זכוכית וליצור מחט הזרקה. אחסנו את המחט הלא שבורה במחזיק מחט סגור עד לבוקר המיקרו-הזרקות.
  3. כדי ליצור צלחת הזרקה, יוצקים 20 מ"ל של 1.5% אגרוז / סטרילי H2O כדי למלא מחצית צלחת פטרי 100 מ"מ X 15 מ"מ ולחכות שהיא תתמצק. לאחר הגדרת תמיסת האגרוז, הוסיפו 20 מ"ל של 1.5% אגרוז/סטרילי H2O לצלחת הפטרי והכניסו את תבנית הפלסטיק (ראו טבלת חומרים) לתוך האגרוז הנוזלי ותנו לו להתקשות.
  4. לאחר שהאגרוז התקשה, מוציאים את תבנית הפלסטיק ומאחסנים את צלחת ההזרקה במהופך במקרר עד לבוקר ההזרקות. ניתן להשתמש בצלחת אחת להזרקות מרובות כל עוד הבארות שומרות על שלמותן.

3. מיקרו-הזרקה של קוקטייל CRISPR-Cas9 לעובר של דג זברה חד-תאי ליצירת קריספנטים אימהיים

הערה: משאבים נוספים למיקרו-הזרקה לעוברים של דגי זברה ניתן למצוא במקומות אחרים24,26,27. הזרקת תערובת CRISPR-Cas9 לבלסטודיסק המתפתח של עוברים חד-תאיים עשויה להגדיל את ההסתברות ליצירת פריכים אימהיים. ניתן גם להזריק את התערובת לשק החלמון עד לשלב 2 התאים. עם זאת, תערובות המוזרקות לחלמון תלויות בזרימה אופלסמית כדי להגיע לבלסטודיסק, כך ש-CRISPR-Cas9 המוזרק לחלמון יכול להפחית את יעילות החיתוך של ה-CRISPR-Cas928.

  1. אחר הצהריים לפני המיקרו-הזרקות, הציבו צלבים מסוג בר בתיבות הזדווגות של דגי זברה. החזיקו את הדגים הזכריים והנקביים באותו מיכל אך הפרידו ביניהם באמצעות מחיצה של תיבת הזדווגות או הניחו את הנקבה בתוך מיכל הטלת ביצים.
  2. בבוקר הניסוי, הוציאו אליקוט אחד של 2 מ"ג/מ"ל של חלבון Cas9 ואליקוט אחד של מאגר ה-sgRNA. בצינור המיקרו-צנטריפוגה נטול הפוליפרופילן נטול RNase המכיל את החלבון Cas9, הרכיבו תערובת הזרקה של 5 μL הכוללת את מאגר ה-sgRNAs, 1 μL של תמיסה אדומה פנול 0.5% ומים נטולי נוקלאז. יש לשאוף לריכוז סופי של 400 ng/μL חלבון Cas9 ו-200 ng/μL של ה-sgRNAs המאוגדים במים נטולי RNase או יחס של 2:1 של חלבון Cas9 ל-sgRNA בעובר המוזרק. תערובת הזרקה זו יכולה להיות מאוחסנת על קרח לבוקר ההזרקה.
  3. הוציאו צלחת הזרקה מהמקרר ותנו לה להתחמם לטמפרטורת החדר (RT) למשך 20 דקות לפחות.
  4. לאחר הרכבת קוקטייל ההזרקה, אפשרו לזכר ולנקבה להזדווג, למשל על ידי הסרת מחיצת תיבת ההזדווגות או על ידי הצבת הזכר באותה תוספת הטלת ביצים כמו הנקבה, לפי הצורך.
  5. לאחר שהדגים הניחו אך לפני שהעוברים נאספו, חתכו את קצה המחט הלא שבורה באמצעות סכין גילוח חדש או מלקחיים עדינים כדי ליצור מחט שיש לה בור קטן מספיק כדי למנוע נזק לעובר אך היא רחבה מספיק כדי שלא תיסתם בתערובת הזרקה. לאחר חיתוך המחט, יש לטעון את המחט עם תערובת ההזרקה באמצעות קצה פיפטה של microloader המוחדר לקצה האחורי של הנימי (ראו טבלאות חומרים).
  6. לאחר מילוי המחט, דגירה של המחט למשך 5 דקות ב-RT כדי להרכיב קומפלקסים של Cas9-sgRNA.
  7. הפעל את המיקרו-אינז'קטור והכנס את המחט למיקרומניפולטור. מניחים טיפת שמן מינרלי על מגלשה של מיקרומטר ומכיילים את המחט על ידי התאמת לחץ ההזרקה עד שהמחט פולטת בולוס של 1 ננומטר לתוך השמן המינרלי.
    הערה: בעת הזרקת השמן המינרלי, בולוס 1 nL יהיה בקוטר של כ-0.125 מ"מ (או רדיוס של 0.062 מ"מ) כפי שנמדד בשקופית המיקרומטר.
  8. כדי לסנכרן את העוברים, אספו אותם לאחר 10 דקות באמצעות מסננת פלסטיק ושטפו אותם לצלחת פטרי באמצעות מדיה אחת E3 (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, והוסיפו 20 μL של 0.03 M מתילן כחול לכל 1 ליטר של 1x E3). מוציאים 10-15 עוברים ומכניסים אותם לצלחת פטרי נפרדת כדי להישמר כבקרות לא מוזרקות.
  9. העבירו את שאר העוברים המתפתחים לבארות של צלחת ההזרקה.
  10. להזריק 1 nL של תמיסה (סך של 400 pg של חלבון Cas9 ו 200 pg של sgRNAs) לתוך blastodisc המתפתח של עובר חד-תאי. אם קצה המחט נסתם, השתמש במלקחיים כדי לשבור את הקצה בחזרה ולכייל מחדש את המחט כדי להוציא בולוס 1 nL. הקפידו להזריק את כל העוברים במהלך 40 הדקות הראשונות של ההתפתחות לאחר ההפריה.
  11. לאחר השלמת ההזרקה, החזירו את העוברים המוזרקים לצלחת פטרי מסומנת המכילה מדיה E3 אחת ואפשרו להם להתפתח לאורך כל היום. הסר את כל העוברים שאינם מופרים או שאינם מתפתחים באופן תקין על פי סדרת ההיערכות של דגי הזברה29.

4. הקרנה ל-INDELs סומטיים בעוברים מוזרקים F0

הערה: ניתן להשתמש בשיטות אחרות לזיהוי INDELs, כגון בדיקת T7 endonuclease I או ניתוח התכה ברזולוציה גבוהה, כאשר קובעים אם העוברים מכילים INDELs סומטיים 30.

  1. למחרת לאחר הזריקות, הסר עוברים פגומים ופגומים מצלחת פטרי והחלף את המדיה 1x E3 כדי לשמור על בריאות העובר.
  2. לאחר ניקוי המנה, אספו שישה עוברים מוזרקים בריאים ושני עוברי בקרה מהצלחת הלא מוזרקת. הכניסו כל עובר בנפרד לתוך באר אחת של צינור רצועת PCR ותייגו את החלק העליון של הצינורות.
  3. כדי לחלץ את הדנ"א הגנומי של עוברים בודדים, הסר את המדיה העודפת של E3 מהבארות של צינור הרצועה והוסף 100 μL של 50 mM NaOH לכל באר.
  4. לדגור על העוברים ב 95 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. לאחר מכן מקררים את הדגימות ל-4 מעלות צלזיוס, מוסיפים 10 μL של 1 M Tris HCL (pH 7.5), ומערבבים אותן במשך 5 עד 10 שניות. ניתן לאחסן דנ"א מופק זה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך 6 חודשים לפחות ללא פגיעה משמעותית בדנ"א.
  5. תכנן פריימרים ייחודיים לסינון עבור כל אתר מדריך כדי להגביר מקטע DNA של 100-110 bp הכולל את אתר היעד CRISPR-Cas9. במידת האפשר, מקם את אתר היעד באמצע הקטע המוגבר, המאפשר זיהוי של מחיקות גדולות יותר.
  6. עבור כל אחד מארבעת אתרי היעד המנחים, הגדר שמונה תגובות PCR של 25 μL באמצעות 5 μL של הדנ"א הגנומי המוכן לעובר יחיד, תערובת PCR וראשוני הסינון הספציפיים למדריך כדי לזהות מוטציות סומטיות באתר היעד (טבלה 1).
  7. יצוק ג'ל אתידיום ברומיד/TBE של 2.5% אגרוז/0.5 מיקרוגרם/מ"ל באמצעות מסרקים היוצרים בארות ברוחב של כ-0.625 ס"מ. מסרק רחב זה מאפשר רזולוציה טובה יותר בעת זיהוי שינויי גודל ברצף הגנומי. לאחר שהג'ל התמצק, הכניסו אותו לתא אלקטרופורזה המכיל חיץ פועל של TUBE.
  8. הוסיפו 5 μL של 6x צבע טעינה למוצר PCR וטענו 25 μL של תערובת זו לתוך הג'ל. ודא שדגימות ההזרקה והבקרה מופעלות באותה שורה של הג'ל. לאחר טעינת כל הדגימות, יש להוסיף 5 μL של אתידיום ברומיד לכל 1 ליטר של חיץ ריצה TBE לקצה החיובי של קופסת הג'ל.
  9. הפעל את הג'ל ב-120 וולט עד שרצועות הדנ"א יתפתרו או שהדנ"א יתקרב לקצה הנתיב. אם ה-Cas9 יצר INDELs באתר היעד, בדרך כלל נצפה כתם בדגימות שהוזרקו, אך לא בפקדים.
  10. אם נצפו מריחות במינימום של שלושה מתוך ארבעת אתרי ההדרכה בעוברים שהוזרקו להם ארבעה רנ"א מנחים, גדלו העוברים המוזרקים על ידי האחים.
  11. בכל פעם שהדגימות המוזרקות אינן מכילות מריחות במספר הנדרש של אתרי מדריך, תכננו רנ"א מדריך חדש שיחליף את אלה שלא עבדו וצרו מאגר חדש של רנ"א מדריך הכולל את אלה שעבדו ואת אלה שעוצבו לאחרונה. להזריק ולבדוק את הבריכה החדשה עבור INDELs סומטיים כמתואר לעיל.

5. זיהוי פנוטיפים של אפקט אימהי בעוברים חדים אימהיים

הערה: ברגע שנקבות F0 המוזרקות הגיעו לבגרות מינית, לתאי הנבט שלהן יש פוטנציאל ליצור תערובת של עוברים אימהיים פריכים ועוברי בר. אף על פי שתערובת זו מאפשרת בקרות פנימיות להפריה ולתזמון התפתחותי, עדיין מועיל להגדיר צלב מסוג בר כבקרה חיצונית למקרה שמצמד מנקבת F0 מכיל רק עוברים פריכים אימהיים.

  1. אחר הצהריים שלפני הניסוי, הציבו את הנקבות המוזרקות F0 נגד זכרים מסוג בר ושלטו בצלבים מסוג בר בתיבות הזדווגות סטנדרטיות של דגי זברה. מניחים גם את הדגים הזכריים וגם את הדגים הנקביים באותו מיכל אך מפרידים ביניהם באמצעות מחיצה של תיבת הזדווגות או מניחים את הנקבה בתוך מיכל מטיל ביצים.
  2. בבוקר הניסוי, אפשרו לזכר ולנקבה להתחיל להזדווג, למשל על ידי הסרת מחיצת תיבת ההזדווגות או הצבת הזכר באותה תוספת הטלת ביצים כמו הנקבה.
  3. אספו את העוברים כל 10 דקות על ידי הזזת התוסף המטיל את הביצים לתחתית מיכל הזדווגות חדשה המכילה מי מערכת מתוקים ותייגו את המיכל עם תג המזהה את נקבת ה-F0 הבודדת. לוקחים את מיכל ההזדווגות הישן ויוצקים את המים דרך מסננת תה כדי לאסוף את העוברים ממצמד בודד אחד של 10 דקות.
  4. לאחר שנאספו העוברים ממצמד יחיד של 10 דקות במסננת, העבירו אותם לצלחת פטרי המכילה מדיה E3 אחת. תייג את צלחת הפטרי עם זמן האיסוף ופרטי הדגים.
  5. תחת מיקרוסקופ מנתח עם מקור אור המועבר, צפו בעוברים העוברים העוברים התפתחות כל שעה במשך 6-8 השעות הראשונות ומדי יום במשך 5 הימים הבאים.
  6. זהה עוברים חדים אימהיים פוטנציאליים על ידי שינויים מורפולוגיים גולמיים בהתפתחותם בהשוואה לבקרות מסוג בר תואמות זמן29.
  7. העבירו את העוברים הפריכים האימהיים הפוטנציאליים לצלחת פטרי המכילה 1x E3 ובדיקה לפנוטיפ מורפולוגי ב-24 כ"ס וכדאיות (למשל, ניפוח שלפוחית השתן בשחייה) 5 ימים לאחר ההפריה.

6. ריצוף אללים בהפלואידים פריכים אימהיים

הערה: ההפלואידים החד-קרניים האימהיים מכילים אלל יחיד במוקד הממוקד, מה שמאפשר זיהוי של INDELs בגן המטרה באמצעות ריצוף סנגר. ניתן גם לנתח עוברי ההפלואידים הפריכים של האם באמצעות מבחני ריצוף מהדור הבא. עוברים המראים פנוטיפ פריך אימהי צפויים לשאת נגע לפחות באחד מארבעת אתרי היעד (ראו דיון).

  1. אחר הצהריים שלפני הניסוי, הקימו זוגות הזדווגות של נקבות F0 הידועות כמייצרות עוברים חדים אימהיים שעברו לזכרים מסוג בר. יש להפריד פיזית את הזכרים מסוג בר מהנקבות באמצעות מחיצה של תיבת הזדווגות או להניח את הנקבה בתא הטלת הביצים.
  2. בבוקר הניסוי, הסירו את המחיצה הפיזית או הניחו גם את הזכרים וגם את הנקבות בתוך התוסף המטיל ביצים כדי ליזום הזדווגות. בסימן הראשון של הטלת ביצים, להפסיק את הרבייה על ידי הפרדת הזכר ואת נקבות F0. יש לשמור כל נקבת F0 מופרדת בתיבות הזדווגות נפרדות.
  3. הכינו תמיסת זרע שטופלה ב-UV באמצעות אשכים של זכר אחד מסוג פרא עבור כל 100 μL של התמיסה של האנק (טבלה 2), מספיק כדי להפרות ביציות שהוברחו מנקבה אחת, כפי שתואר קודםלכן 31.
  4. חילוץ ידני של ביציות בוגרות מנקבות F0 שנבחרו מראש וביצוע הפריה חוץ גופית (IVF) באמצעות זרע31 שטופל ב-UV.
  5. לאחר הפריה חוץ גופית , אפשרו לעוברים ההפלואידים להתפתח עד לתצפית על הפנוטיפ הפריך האימהי והכניסו את העוברים הללו לצלחת פטרי אחרת.
  6. לאחר שזוהו עוברי ההפלואידים האימהיים, אפשרו להם להתפתח לפחות 6 שעות לאחר ההפריה.
  7. כדי לחלץ את הדנ"א הגנומי מלפחות עשרה עוברים חד-פעמיים חד-הוריים, הנח עובר הפלואיד יחיד לתוך באר בודדת של צינור רצועת PCR, הסר מדיה עודפת של E3 מהבאר והוסף 50 μL של 50 mM NaOH.
  8. לדגור על העוברים ב 95 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. לאחר מכן מקררים את הדגימות ל-4 מעלות צלזיוס, מוסיפים 5 מיקרון ליטר של 1 M Tris HCL (pH 7.5), ומערבולות במשך 5-10 שניות. ניתן לאחסן את הדנ"א המופק בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.
  9. כדי לזהות אילו אתרים מנחים מכילים INDELs, תכננו פריימרים לריצוף כדי להגביר מקטע דנ"א הכולל את כל ארבעת אתרי היעד של CRISPR-Cas9. פריימרים ריצוף אלה מאפשרים זיהוי של INDELs המשתרעים על פני מספר אתרי מנחה.
  10. הגדר שתי תגובות PCR של 25 μL לכל עובר באמצעות 5 μL של הדנ"א הגנומי המוכן והפריימרים של הריצוף.
  11. לאחר סיום ה-PCR, יש לטהר ולרכז את שתי הדגימות באמצעות ערכת ניקוי DNA וריכוז (ראו טבלת חומרים). לאחר מכן הגש את מקטע הדנ"א לריצוף סנגר באמצעות פריימרים של ריצוף קדימה ואחורה.
  12. לאחר ריצוף מקטע הקריספנט האימהי ההפלואידי, יישרו אותו לרצף מסוג פראי וזהו INDELs באתרי היעד באמצעות תוכנית יישור רצף.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הגישה הניסויית המתוארת בפרוטוקול זה מאפשרת זיהוי של פנוטיפים של השפעה אימהית באופן מהיר וחסכוני במשאבים (איור 1).

יצירת פריכיות אימהית:
כאשר מתכננים את ארבעת הרנ"א המנחים כך שיתמקדו בגן בעל השפעה אימהית מועמד יחיד, יש לתת את הדעת במיוחד למקום שבו הרנ"א המנחה ייקשר לדנ"א. באופן כללי, כולם צריכים להיות מקובצים יחד עם אזורים חופפים מינימליים עד ללא חפיפה בין רנ"א מנחה בתחילת תחום החלבון החזוי הראשון (איור 2A). התמקדות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול המוצג בכתב יד זה מאפשר זיהוי ואפיון מולקולרי ראשוני של פנוטיפ אפקט אימהי בדור אחד במקום הדורות המרובים הנדרשים לטכניקות גנטיות קדימה ואחורה. נכון לעכשיו, תפקידם של גנים רבים המתבטאים באופן אימהי אינו ידוע. חוסר ידע זה נובע בחלקו מהדור הנוסף הנדרש כדי לדמיין פנוטיפ בעת זיהוי גנים בעלי השפעה אימהית. בעבר, זיהוי מהיר של גנים בעלי השפעה אימהית בדגי זברה יכול היה להיות מושג על ידי הזרקת מורפולינו אוליגונוקלאוטידים חוסמי תרגום לביציות מתורבתות32. שיטה זו הוכחה כמוצלחת על ידי פנוקופיה של מספר ג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

אנו מודים בעבר ובהווה לאנשי צוות גידול בעלי החיים במעבדה של פלגרי על טיפולם במתקן הימי. אנו מודים גם על ההערות והתובנות על כתב היד מאת ריאן טרבנה ודיאן הנסון. המימון ניתן על ידי מענק NIH ל- F.P. (GM065303)

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1 M Tris-HCl (pH 8.4)Invirogen15568025לתערובת PCR
1.5 מ"ל צינורות אפנדורףכל יצרן
10 מ"מ dNTPsתרמו פישר18427013סינתזה של gRNA
100 BP סולםכל יצרןלאלקטרופורזה ג'ל
100% אתנול ללא RNAכל יצרן
100% RNAse אתנולחופשי כל יצרן
100 מ"לכל יצרןלהפריה חוץ גופית
5 מ 'אמוניום אצטטתרמו פישר מדעינמצא בערכת התמלול MEGAshortscript T7סינתזה של gRNA
70% סינתזת אתנולשל gRNA (70 מ"ל אתנול + 30 מ"ל של  מים ללא נוקלאז)
בורוזיל 1.0 מ"מ OD x 0.5 מ"מ מזההFHC INC27-30-1עבור מיקרו הזרקה
בתפזורת פארמה נתרן ביקרבונט 35 פאונדאספקת שונית בתפזורת255אספקת דגים
CaCl2MiliporeSigmaC7902
Cas9 חלבון עם NLSPNABioCP01
ChopChophttps://chopchop.cbu.uib.no/
קבוע אוליגונוקלאוטידמשולב DNA טכנולוגיות (IDT)AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC
TTTTTCAAGTTGATGATAACGGACTA
GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC
TAGCTCTAAAAC
דיכאון זכוכית צלחתתרמו פישר מדעי13-748Bלהפריה חוץ גופית
כריתת מלקחייםדומונטSSלהפריה חוץ גופית
מספרייםכלי מדע עדינים14091-09להפריה חוץ גופית
ניתוח סטרוסקופ (עם מקור אור מועבר)כל יצרןלהפריה חוץ גופית
DNA נקי & רכז -5Zymo ResearchD4014סינתזה של gRNA
DNA ג'ל טעינת צבע (6x)כל יצרןלאלקטרופורזה ג'ל
EconoTaq DNA פולימראזLucigen30032-1עבור PCR תערובת
אלקטרופרזיס ספק כוחכל יצרן
https://useast.ensembl.org/index.html
אפנדורף  טיפים למיקרו-מעמיס Femtojet למיקרו-מזרק Femtojetתרמו פישר E5242956003 מדעילמיקרו-הזרקה
אתנול (200 הוכחה, ללא נוקלאז)כל יצרן
FemtoJet 4iEppendorf5252000021לרשת דגים מיקרו-הזרקה
כל יצרןאספקת דגים
קפוא שרימפסמי מלח שרימפס ישירציוד לדגים
כללי לכל מטרה Agaroseכל יצרןעבור ג'ל אלקטרופורזה
אוליגונוקלאוטיד ספציפי לגןDNA משולבות (IDT)TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
כפפותכל יצרן
דלי קרחכל יצרן
מלח אוקיינוס מיידיכל יצרןאספקת דגים
Invitrogen UltraPure Ethidium Bromide, 10 מ"ג/מ"לתרמו פישר סיינטיפיק15-585-011
KClMiliporeSigmaP5405
KH2PO4MiliporeSigma7778-77-0
KimwipesThermo Fischer Scientific06-666
זכר & נקבת דג
MEGAshortscript T7 ערכת תמלולתרמו פישר מדעיAM1354סינתזה של gRNA
מתילן כחולתרמו פישרAC414240250מדעי עבור E3
MgCl2MiliporeSigma7791-18-6עבור תערובת PCR
MgSO2· 7H2OMiliporeSigmaM2773
עובש פלסטיק מיקרו-הזרקהWorld Precision InstrumentsZ-Templatesעבור מיקרו-מניפולטור מיקרו-הזרקה
כל יצרןעבור
מיקרו-הזרקת מיקרו-פיפטריםכל יצרן
חולץ מיקרופיפטהסאטרP-87עבור מיקרו-הזרקה
טיפים למיקרופיפטר עם מסננים (כל הגדלים)כל יצרן
טיפים מיקרופיפטר ללא מסננים (כל הגדלים)כל יצרן
מיקרוגלכל יצרן
שמן מינרליMiliporeSigmam5904-5mlלמיקרו-הזרקה
MS-222 (טריקאין-D)כל יצרןמאושר על ידי ה-FDA
Na2 HPO4MiliporeSigmaS3264
NaClMiliporeSigmaS5886
NaHC03MiliporeSigmaS5761
Nanodropכל יצרן
NaOHMiliporeSigma567530
Nonstick, צינורות מיקרופוגה ללא RNase, 1.5 מ"לאמביוןAM12450סינתזה של gRNA
מים נטולי נוקלאזכל יצרן
מגבת ניירכל יצרן
פסטרו פיפטסכל יצרן
צינורות רצועת PCRכל יצרן
צלחות פטרי קוטר 100 מ"מכל יצרן
תמיסת פנול אדוםMiliporeSigmaP0290עבור מיקרו הזרקת
פלסטיק pestalsVWR47747-358עבור IVF
כף פלסטיקIVF כל יצרןעבור IVF
פרימיום כיתה מלח שרימפס ביצישרימפס ישיררשת עדינה
RNA ג'ל טעינת צבענמצא ב MEGAshortscript T7 ערכת תמלולעבור ג'ל אלקטרופורזה
RNAse AWAYתרמו פישר מדעי21-402-178
קנה מידהכל יצרן
שארפיכל יצרן
  מריתכל יצרן
סטרילי H2Oכל יצרןלתערובת PCR
T4 DNA פולימראזNEBM0203סינתזה של קלטת gRNA
כל יצרן
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10xכל יצרןעבור ג'ל אלקטרופורזה
מכתים תהאמזוןIMU-71133Wאספקת
דגיםThermo Scientific Owl מסרק 12 שיניים, עובי 1.0/1.5 מ"מ, דו צדדי עבור B2Thermo Fischer ScientificB2-12לאלקטרופורזה של ג'ל
Thermo Scientific  ינשוף EasyCast B2 מיני ג'ל מערכות אלקטרופורזהתרמו פישר סיינטיפיק09-528-110Bלאלקטרופורזה של ג'ל
תרמו-סייקלרכל יצרן
Thermocyclerכל יצרן
Transilluminatorכל יצרן
מנורת UVUVPדגם XX-15 (Cat מס' UVP18006201)למשקפי בטיחות UV IVF
כל יצרןעבור
IVF לשטוף בקבוקתרמו פישר מדעיS39015אספקת דגים
דג זברה קופסאות הזדווגותאקווה שוורץSpawningBox1אספקת דגים
1.5 מ"ל צינורות אפנדורףפישר סיינטיפיק05-402-11
10 טוחנת dNTPsתרמו פישר סיינטיפיק18427013
100 BP סולםתרמו פישר סיינטיפיק15628019
100% אתנול ללא RNAseכל יצרן
5 מ' אמוניום אצטטתרמו פישר סיינטיפיק
70% אתנול70 מ"ל אתנול ו-30 מ"ל מים ללא נוקלאז
אביזרים לתיבת ג'ל אופקיתפישר סיינטיפיק0.625 מ"מ
אגרוזכל יצרן
CaCl2Sigma10043-52-4
CaCl2, dihydrateSigma10035-04-8E3
צינורות נימיים בינונייםCole-ParmerUX-03010-68למחטי הזרקה
Cas9 חלבוןThermo Fischer ScientificA36496
ChopChophttps://chopchop.cbu.uib.no/
מחשבכל יצרן
ניתוח תפיסותכל יצרן
ניתוח מיקרוסקופכל יצרן
ניתוחי מספרייםכל יצרן
DNA נקי & רכז -5Zymo ResearchD4014
DNA צבע טעינת ג'ל (6X)Thermo Fischer ScientificR0611
EconoTaq DNA פולימראזLucigen30032-1
אנסמבלhttps://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Microloader PipetteTipsFischer Scientific1028965120 מיקרוליטר
אתנול (200 הוכחה, ללא נוקלאז)כל יצרן
אתידיום ברומידתרמו פישר מדעי15585011
רשת דגיםכל יצרןרשת עדינה
שרימפס מלח קפואLiveAquariaCD-12018מזון
דגים מסרק ג'ל (0.625 מ"מ)כל יצרן
ג'ל אלקטרופרזיס מערכתכל יצרן
משולבות אוליגונוקלאוטידים ספציפיות לגן(IDT)
מחט קפילרית זכוכית21TZ99https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia
GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88
VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL
w_wcB:G:s& s_kwcid=AL!2966!3!
264955916096!!! g!438976
780705!& gucid=N:N:PS:משולם
:GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501
231& gclid=Cj0KCQjw8IaGBh
CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp
ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI
964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw
_wcB& gclsrc=aw.ds
כלי זכוכיתכל יצרן
פתרון9.9 מ"ל של Hank's Premix עם 0.1 מ"ל HS Stock #6
Hank's Premixשלב את הדברים הבאים לפי הסדר: (1) 10.0 מ"ל HS #1, (2) 1.0 מ"ל HS#2, (3) 1.0 מ"ל HS#4, (4) 86 מ"ל ddH2O, (5) 1.0 מ"ל HS#5. אחסן את כל תחליפי HS ב-4C
Hanks Solution
Hank's Solution
https://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization-Hank's Stock Solution #18.0 גרם NaCl, 0.4 גרם KCl ב-100 מ"ל ddH2O
Hank's Stock Solution #20.358 גרם Na2HPO4 נטול מים; 0.60 גרם K2H2PO4 ב-100 מ"ל ddH2O
תמיסת המלאי של האנק #40.72 גרם CaCl2 ב-50 מ"ל ddH2O
תמיסת המלאי של האנק #51.23 גרם MgSO47H2O ב-50 מ"ל ddH20
תמיסת המלאי של האנק #60.35 גרם NaHCO3 ב-10.0 מ"ל ddH20; הפוך את יום השימוש הטרי
HClSigma7647-01-0
דלי קרחלכל יצרן
מלח אוקיינוס מיידיכל יצרןעבור מי דגים
ערכת תמלול במבחנה מגה סקריפט קצרתרמו פישר מדעיAM1354
Invitrogen™ UltraPure&Trade; DNase/RNase ללא מים מזוקקיםFisher Scientific10-977-023
KClSigma7447-40-7E3 בינוני
KH2PO4Sigma7778-77-0
KimwipesFisher Scientific06-666
זכר ונקבה דג
Mega Short Script T7 Transciption KitThermo Fischer ScientificAM1354
מתילן כחולפישר מדעיAC414240250E3 בינוני
MgSO2-7H2OסיגמאM2773
Microimicromanipulator
עובש פלסטיק מיקרו-הזרקהמכשירים דיוק עולמיZ-תבניות
מיקרו-מזרק
מיקרו-מחט שקופיות
Micropipeter (1-10) עם טיפיםכל יצרןצריך p10 מסוננים טיפים
Micropipetter (20-200) עם טיפיםכל יצרן
Micropippetter (100-1000) עם טיפיםכל יצרן
מיקרופלסטיק שקופיות
מיקרוגלכל יצרן
MiliQ מיםכל יצרן
שמן מינרליסיגמא-אולדריץ'M5904-5 מ"ל
Na2HPO4Sigma
NaClSigmaS9888
NaHC02Sigma223441
Nanodrop
NaOHSigma567530
מרית צרהכל יצרן
חולץ מחטSutterP-97
מגבת ניירכל יצרן
Pastro PipettesFisher Scientific13-678-20A
PCR פריימר מאגף מדריך אתר טכנולוגיותDNA משולבות (IDT)
PCR פריימרים מאגפים מדריך RNA אתר חיתוך טכנולוגיותDNA משולבות (IDT)סטנדרטי מותפל
צינורות רצועת PCRתרמו פישר מדעיAB0771W
פטרי כליםפישר מדעיFB087571410 ס"מ קוטר 100 מ"מ x 15 מ"מ
פנול אדוםפישר מדעS25464
https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464 טיפים פיפטהכל יצרןטיפים 10ul, 200ul ו-1000ul
מזיקים מפלסטיקפישר סיינטיפיק12-141-364
כפית פלסטיקכל יצרן
מדריך פריימר אתרDNA משולבות (IDT)
סכין גילוחUlineH-595B
RNA ג'ל טוען צבעבערכת סקריפט מגה קצר (ערכת העברה במבחנה)
RNAseמשם פישר21-402-178
צינורות מיקרוצנטריפוגה מפוליפרופילן ללא RNAתרמו פישר AM12400 מדעיhttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400
מים ללא RNAseפישר סיינטיפיק10-977-023
קנה מידהכל יצרן
שארפיכל יצרן
נתרן ביקרבונט (תא נבדק תרבית)SigmaS5761מי דגים
נתרן ברומיד סולוטיוןSigmaE1510
תוכנה לניתוח
ספקטרופוטומטר
Sterlie H2Oכל מותג
T4 DNA פולימראזNEBM0203Shttps://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information
הדבקכל מותג
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10XThermo Fischer ScientificB52
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52 Tea StainerאמזוןIMU-71133Wזמין ברוב חנויות המטבחים
Thermocycler
העברת פיפטהUlineS-24320
Transilluminator
Tricainefisher ScientificNC0872873
Tris HCl 7.5Thermo Fischer Scientific15567027
Universal PrimerIntegrated DNA Technologies (IDT)AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC
TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG
CCTTATTTTTTAACTTGCTATTTCTA
GCTCTAAAAC
מנורת UVUVP
משקפי בטיחותUV כל יצרן
בקבוקכביסה פישר מדעיS39015
קופסאות הזדווגות דג זברהכל יצרן
PCR מתכוןמאגרהוסף 171.12 מ"ל H20 סטרילי; 0.393 מ"ל 1M MgCl2; 2.616 מ"ל 1M MgCl2; 2.618 מ"ל 1M Tris-HCl (pH 8.4) 13.092 מ"ל 1M KCl; 0.262 מ"ל 1% ג'לטין. אוטוקלאב למשך 20 דקות ואז מצננים את הסולו על קרח. לאחר מכן הוסף 3.468 מ"ל 100 מ"ג/מ"ל BSA; 0.262 מ"ל dATP (100 מ"מ), 0.262 מ"ל dCTP (100 מ"מ); 0.262 מ"ל dGTP (100 מ"מ);   0.262 מ"ל dTTP (100 מ"ל). אליציטוט לצינורות אפנדורף סטריליים
עבור אנסמבל אלקטרופורזה ג'ל טכנולוגיות זברהטכנולוגיות DNA כפפות כל יצרן העבודה הסופי של האנק שלב זברה טכנולוגיות רצף סנגר

מקורות

  1. Pelegri, F. Maternal factors in zebrafish development. Developmental Dynamics. 228 (3), 535-554 (2003).
  2. Campbell, P. D., Heim, A. E., Smith, M. Z., Marlow, F. L. Kinesin-1 interacts with Bucky ball to form germ cells and is required to pattern the zebrafish body axis. Development. 142 (17), Cambridge, England. 2996-3008 (2015).
  3. Eno, C., Solanki, B., Pelegri, F. aura (mid1ip1l) regulates the cytoskeleton at the zebrafish egg-to-embryo transition. Development. 143 (9), Cambridge, England. 1585-1599 (2016).
  4. He, W. -X., et al. Oocyte-specific maternal Slbp2 is required for replication-dependent histone storage and early nuclear cleavage in zebrafish oogenesis and embryogenesis. RNA. 24 (12), RNA. New York, N.Y. 1738-1748 (2018).
  5. Burger, A., et al. Maximizing mutagenesis with solubilized CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Development. 143 (11), Cambridge, England. 2025-2037 (2016).
  6. Jao, L. -E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  7. Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nature Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
  8. Shankaran, S. S., Dahlem, T. J., Bisgrove, B. W., Yost, H. J., Tristani-Firouzi, M. CRISPR/Cas9-directed gene editing for the generation of loss-of-function mutants in high-throughput zebrafish F0 screens. Current Protocols in Molecular Biology. 119 (1), 1-22 (2017).
  9. Trubiroha, A., et al. A Rapid CRISPR/Cas-based mutagenesis assay in zebrafish for identification of genes involved in thyroid morphogenesis and function. Scientific Reports. 8 (1), 5647(2018).
  10. Wu, R. S., Lam, I. I., Clay, H., Duong, D. N., Deo, R. C., Coughlin, S. R. A Rapid method for directed gene knockout for screening in G0 zebrafish. Developmental Cell. 46 (1), 112-125 (2018).
  11. Moravec, C. E., Voit, G. C., Otterlee, J., Pelegri, F. Identification of maternal-effect genes in zebrafish using maternal crispants. Development. 148 (19), Cambridge, England. 199536(2021).
  12. Braat, A. K., Zandbergen, T., van de Water, S., Goos, H. J., Zivkovic, D. Characterization of zebrafish primordial germ cells: morphology and early distribution of vasa RNA. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 216 (2), 153-167 (1999).
  13. Eno, C., Hansen, C. L., Pelegri, F. Aggregation, segregation, and dispersal of homotypic germ plasm RNPs in the early zebrafish embryo. Developmental Dynamics. 248 (4), 306-318 (2019).
  14. Knaut, H., Steinbeisser, H., Schwarz, H., Nüsslein-Volhard, C. An evolutionary conserved region in the vasa 3'UTR targets RNA translation to the germ cells in the zebrafish. Current biology: CB. 12 (6), 454-466 (2002).
  15. Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells. Development. 124 (16), Cambridge, England. 3157-3165 (1997).
  16. Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PLoS ONE. 9 (5), 98186(2014).
  17. Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Research. 44, 272-276 (2016).
  18. Labun, K., Montague, T. G., Krause, M., Torres Cleuren, Y. N., Tjeldnes, H., Valen, E. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
  19. Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42, 401-407 (2014).
  20. Moravec, C. E., Pelegri, F. J. An accessible protocol for the generation of CRISPR-Cas9 knockouts using INDELs in zebrafish. Methods in Molecular Biology. 1920, Clifton, N.J. 377-392 (2019).
  21. White, R. J., et al. A high-resolution mRNA expression time course of embryonic development in zebrafish. eLife. 6, 30860(2017).
  22. Aanes, H., et al. Zebrafish mRNA sequencing deciphers novelties in transcriptome dynamics during maternal to zygotic transition. Genome Research. 21 (8), 1328-1338 (2011).
  23. Aken, B. L., et al. The Ensembl gene annotation system. Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).
  24. Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e56969(2018).
  25. Kotani, H., Taimatsu, K., Ohga, R., Ota, S., Kawahara, A. efficient multiple genome modifications induced by the crRNAs, tracrRNA and Cas9 protein complex in zebrafish. PloS One. 10 (5), 0128319(2015).
  26. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1115(2009).
  27. Xu, Q. Microinjection into zebrafish embryos. Methods in Molecular Biology. 127, Clifton, N.J. 125-132 (1999).
  28. Biology Mouse,, Zebrafish,, Chick, JoVE. Biology: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Microinjection Techniques. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
  29. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 203 (3), 253-310 (1995).
  30. D'Agostino, Y., et al. A rapid and cheap methodology for CRISPR/Cas9 zebrafish mutant screening. Molecular Biotechnology. 58 (1), 73-78 (2016).
  31. Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with Heat Shock 2 treatment. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54492(2016).
  32. Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 242 (1), 44-52 (2013).
  33. Kushawah, G., et al. CRISPR-Cas13d induces efficient mRNA knockdown in animal embryos. Developmental Cell. 54 (6), 805-817 (2020).
  34. Kroeger, P. T., Poureetezadi, S. J., McKee, R., Jou, J., Miceli, R., Wingert, R. A. Production of haploid zebrafish embryos by in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51708(2014).
  35. Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection. Development. 132 (13), Cambridge, England. 2955-2967 (2005).
  36. Riemer, S., Bontems, F., Krishnakumar, P., Gömann, J., Dosch, R. A functional Bucky ball-GFP transgene visualizes germ plasm in living zebrafish. Gene Expression Patterns: GEP. 18 (1-2), 44-52 (2015).
  37. Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

גנים בעלי השפעה אימהיתעריכה באמצעות CRISPR-Cas9ריבוי RNA מנחה (Multiplexing)עובריות של דגי זבראמוטציות סומטיותריצוף סנגרעוברים הפלואידיםפנוטיפ בעל השפעה אימהית
קביעת תפקידם של גנים המבוטאים על ידי האם בהתפתחות מוקדמת עם קריספנטים אימהיים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.