קביעת תפקידם של גנים המבוטאים על ידי האם בהתפתחות מוקדמת עם קריספנטים אימהיים

סיכום

פיתוח מוקדם תלוי במוצרים שעברו בירושה אימהית, ותפקידם של רבים ממוצרים אלה אינו ידוע כיום. כאן תיארנו פרוטוקול המשתמש ב-CRISPR-Cas9 כדי לזהות פנוטיפים בעלי השפעה אימהית בדור אחד.

תקציר

ההתפתחות המוקדמת תלויה במאגר של גורמים אימהיים המשולבים בביצית הבוגרת במהלך האוגנזה המבצעים את כל הפונקציות התאיות הדרושות להתפתחות עד להפעלת הגנום הזיגוטי. בדרך כלל, מיקוד גנטי של גורמים אימהיים אלה דורש דור נוסף כדי לזהות פנוטיפים של השפעה אימהית, המעכב את היכולת לקבוע את תפקידם של גנים המבוטאים על ידי האם במהלך ההתפתחות. גילוי יכולות העריכה הדו-אליליות של CRISPR-Cas9 איפשר הקרנה של פנוטיפים עובריים ברקמות סומטיות של עוברים מוזרקים או "קריספונים", מה שהגביר את ההבנה של התפקיד שממלאים גנים בעלי ביטוי זיגוטי בתוכניות התפתחותיות. מאמר זה מתאר פרוטוקול שהוא הרחבה של שיטת ה-crispant. בשיטה זו, העריכה הדו-אלילית של תאי הנבט מאפשרת בידוד של פנוטיפ בעל אפקט אימהי בדור אחד, או "קריספנטים אימהיים". ריבוי רנ"א מנחה למטרה אחת מקדם ייצור יעיל של קריספנטים אימהיים, בעוד שניתוח רצף של ההפלואידים הקריפנטים האימהיים מספק שיטה פשוטה לאימות נגעים גנטיים המייצרים פנוטיפ אפקט אימהי. השימוש בקריספנטים אימהיים תומך בזיהוי מהיר של גנים חיוניים המתבטאים באופן אימהי, ובכך מקל על ההבנה של התפתחות מוקדמת.

מבוא

מאגר של מוצרים שהופקדו על ידי האם (למשל, רנ"א, חלבונים וביו-מולקולות אחרות) נחוץ לכל התהליכים התאיים המוקדמים עד להפעלת הגנום הזיגוטי של העובר¹. הידלדלות מוקדמת של מוצרים אלה מהביצית היא בדרך כלל קטלנית עוברית. למרות חשיבותם של גנים אלה בהתפתחות, תפקידם של גנים רבים המתבטאים באופן אימהי אינו ידוע כיום. התקדמות בטכנולוגיית עריכת גנים בדגי זברה, כגון CRISPR-Cas9, מאפשרת מיקוד של גנים המתבטאים באופן אימהי ^2,3,4. עם זאת, זיהוי של פנוטיפ אפקט אימהי דורש דור נוסף בהשוואה לפנוטיפ זיגוטי, ולכן דורש יותר משאבים. לאחרונה, יכולת העריכה הדו-אלילית של CRISPR-Cas9 שימשה לסינון פנוטיפים עובריים ברקמות סומטיות של עוברים מוזרקים (F0), המכונים "פרישנים"5,6,7,8,9,10. טכניקת ה-crispant מאפשרת סינון חסכוני במשאבים של גנים מועמדים בתאים סומטיים, מה שמקל על ההבנה של היבטים ספציפיים בהתפתחות. הפרוטוקול המתואר במאמר זה מאפשר זיהוי של פנוטיפים בעלי השפעה אימהית, או "פרישים אימהיים", בדור אחד¹¹. סכימה זו ניתנת להשגה על ידי ריבוי רנ"א מנחה לגן יחיד וקידום אירועי עריכה ביאליים בגרמלין. עוברים חדים אימהיים אלה ניתנים לזיהוי על ידי פנוטיפים מורפולוגיים גסים ועוברים אפיון ראשוני, כגון תיוג עבור גבולות התא ותבנית DNA¹¹. ניתוח משולב של הפנוטיפ הנצפה והאפיון המולקולרי הבסיסי של ה-INDELs המושרים מאפשר לחזות את תפקידו של הגן הממוקד בהתפתחות מוקדמת.

בדגי זברה, במהלך 24 השעות הראשונות שלאחר ההפריה (hpf), קבוצה קטנה של תאים מתפתחת לתאי הנבט הקדמוניים, מבשר לנבט^12,13,14,15. במצמדים שהונחו על ידי נקבות F0, שיעור העוברים החדים האימהיים שהתאוששו תלוי בכמה תאי נבט מכילים אירוע עריכה ביאלי בגן הממוקד. באופן כללי, ככל שאירוע העריכה מתרחש מוקדם יותר בעובר, כך גדלה ההסתברות לצפייה במוטציות CRISPR-Cas9 בגרמן. ברוב המקרים, הפנוטיפים של עוברים פריכים אימהיים נובעים מאובדן תפקוד בשני האללים האימהיים הקיימים בביצית המתפתחת. כאשר הביצית מסיימת את המיוזה, אחד האללים האימהיים מובלט מהעובר דרך גוף הקוטב, ואילו האלל השני משתלב בפרונוקלאוס האימהי. הריצוף של מספר הפלואידים החד-קרניים האימהיים ייצג תערובת של המוטציות (החדרות ו/או מחיקות (INDELs)) הקיימות בגרמלין התורמות לפנוטיפ¹¹.

הפרוטוקול הבא מתאר את הצעדים הדרושים ליצירת מוטציות CRISPR-Cas9 בגנים בעלי השפעה אימהית ולזיהוי הפנוטיפ המתאים באמצעות גישה של פרישנט אימהי (איור 1). החלק הראשון יסביר כיצד לתכנן וליצור באופן יעיל רנ"א מנחה, בעוד שסעיפים 2 ו-3 מכילים שלבים קריטיים ליצירת קריספנטים אימהיים על ידי מיקרו-הזרקה. לאחר הזרקת תערובת CRISPR-Cas9, עוברים מוזרקים נבדקים לעריכות סומטיות באמצעות PCR (סעיף 4). לאחר שעוברי F0 המוזרקים מתפתחים ומגיעים לבגרות מינית, נקבות ה-F0 עוברות לזכרים מסוג בר, וצאצאיהן נבדקים לפנוטיפים בעלי השפעה אימהית (סעיף 5). החלק השישי כולל הוראות להכנת הפלואידים קריספנטים אימהיים שניתן לשלב עם ריצוף סנגר כדי לזהות את ה-INDELs המושרים על ידי CRISPR-Cas9. בנוסף, הדיון מכיל שינויים שניתן לבצע בפרוטוקול כדי להגביר את הרגישות והעוצמה של שיטה זו.

פרוטוקול

במחקרים שהובילו לפיתוח פרוטוקול זה, כל הדיור והניסויים של דגי זברה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון (IACUC-M005268-R2).

1. סינתזה של רנ"א מנחה

הערה: קריספנטים זיגוטיים נוצרו באמצעות RNA מנחה יחיד או ריבוי רנ"א מנחה מרובים למטרה אחת 5,6,7,8,9,10. ריבוי הרנ"א המנחה מגדיל את אחוז העוברים המציגים פנוטיפ פריך זיגוטי¹⁰. בשל התדירות המוגברת הזו של עוברים המציגים פנוטיפ, קריספנטים אימהיים נוצרים על ידי ריבוי ארבעה רנ"א מנחים לגן יחיד. פרוטוקול מפורט יותר על שימוש ב- CHOPCHOP לתכנון רנ"א מנחה ושיטת חישול לסינתזה של RNAs מנחים עבור דגי זברה ניתן למצוא במקומות אחרים 16,17,18,19,20.

1. כדי לזהות גן בעל ביטוי אימהי שיש להתמקד בו, ודא את רמות השעתוק של mRNA במהלך הפיתוח באמצעות מסד נתונים של רצף RNA המספק מידע על תעתיק מזיגוטה עד 5 ימים²¹. באופן כללי, גנים ספציפיים לאמהות באים לידי ביטוי גבוה בעובר המוקדם ומתפרקים לאחר הפעלת הגנום הזיגוטי²².
2. לאחר זיהוי גן מטרה בעל ביטוי אימהי, קבע את תחום החלבון החזוי הראשון באמצעות סעיף "תחומים ותכונות" הזמין בדפדפן הגנום של Ensembl²³. השתמש בתחום זה כאזור היעד עבור ארבעת הרנ"א המנחים.
3. השתמש בתוכנית בחירת ה-RNA המנחה CHOPCHOP כדי לזהות ארבעה אתרי יעד של RNA מנחה בתחום הפעיל הראשון. תכנון אוליגונוקלאוטידים ספציפיים לגנים, כפי שמוצג להלן עבור כל אתר יעד. באוליגונוקלאוטיד הספציפי לגן, מקטע N²⁰ מתאים לרצף המטרה מינוס אתר PAM (NGG) מ-CHOPCHOP. סדרו את האוליגונוקלאוטידים הספציפיים לגנים האלה ואת האוליגונוקלאוטיד הקבוע באמצעות טיהור סטנדרטי של חומרים (ראו טבלת חומרים).
   אוליגונוקלאוטיד ספציפי לגן:
   5' TAATACGACTCACTATA- N²⁰ -GTTTTAGAGGATAGAAATAGCAAG 3'
4. כדי ליצור תבנית RNA מנחה עבור כל אוליגונוקלאוטיד ספציפי לגן, יש להצמיד אותה לאוליגונוקלאוטיד הקבוע ולמלא את השלוחות בפולימראז T4-DNA כפי שתואר קודם לכן¹⁶. לאחר הרכבת ארבע תבניות ה-RNA המנחות, יש לטהר ולרכז אותן יחד באמצעות ערכת ניקוי DNA וריכוז בהתאם להוראות היצרן (ראו טבלת חומרים).
5. סנתז את תערובת ה-sgRNA מתבנית ה-RNA של המדריך באמצעות ערכת שעתוק T7 במבחנה (ראו טבלת חומרים). בצע את התמלול במבחנה בהתאם להוראות היצרן. שימוש בחצאי תגובות של ערכת השעתוק T7 יכול להפחית את העלות לתגובה.
6. לאחר סינתזת RNA, טהרו את המאגר שנוצר של sgRNA באמצעות פרוטוקול אתנול/אמוניום אצטט כפי שתואר קודם לכן 16,20,24. לאחר שהרנ"א בודד, יש להשעות אותו ב-20 μL של מים נטולי נוקלאז. אם נעשה שימוש בחצי תגובות של ערכת השעתוק T7 כדי לתמלל את מאגר ה-sgRNA, יש להשהות את הרנ"א המטוהר ל-10-15 מיקרון מים נטולי נוקלאז.
7. לכמת את כמות ה-sgRNAs המאוגדים שנוצרו באמצעות ספקטרופוטומטר. לדלל את מאגר ה-sgRNAs במים נטולי נוקלאז לדילול של 1500 ng/μL ± 500 ng/μL. בדרך כלל, הנפח הסופי של דילול העבודה נע בין 30-50 μL.
8. לאחר קביעת הריכוז של מאגר ה- sgRNAs, ודא את שלמות ה- sgRNAs על ג'ל אגרוז של 1%.
   1. יצוק 1% אגרוז/0.5 מיקרוגרם/מ"ל אתידיום ברומיד/ג'ל TBE. לאחר שהג'ל התמצק, הניחו אותו במאגר TBE.
   2. יש לערבב 1 μL מתערובת sgRNA ו-1 μL של מאגר טעינת ג'ל RNA (ראו טבלת חומרים). טען דגימה זו בג'ל והפעל את הג'ל ב 100 V במשך 5 דקות.
9. דמיינו את הפסים באמצעות אור אולטרה סגול (UV). מאגר ה-sgRNAs אמור להופיע כלהקה אחת. אם נצפה מריחה, סביר להניח שהתרחשה השפלת RNA.
10. אחסנו את מאגר ה-sgRNAs באליקוטים חד-פעמיים של 1 μL בצינורות רצועת PCR נטולי נוקלאז במקפיא של -80 מעלות צלזיוס. עבור כמויות גדולות של תערובת sgRNAs (30 μL או יותר), aliquot מחצית מהנפח לתוך צינורות רצועת PCR ללא נוקלאז ולאחסן את החצי השני כנפח גדול יותר בצינור microcentrifuge ללא נוקלאזה. להפשיר ולהציף בעת הצורך.
11. כדי למנוע התדרדרות RNA, ודא שהדגימות בצינור המיקרוצנטריפוגה עוברות לא יותר משני מחזורי הפשרה בהקפאה.

2. הכנת ריאגנטים וחומרים למיקרו הזרקה

הערה: בדגי זברה, הזרקת Cas9 mRNA יכולה ליצור פריכים זיגוטיים. עם זאת, מחקרים הראו כי חלבון Cas9 יעיל יותר ביצירת INDELs בעוברים מוזרקים^16,25. פרוטוקול זה משתמש בחלבון Cas9 כדי לייצר פריסנטים אימהיים מכיוון שחלבון זה אינו חווה את אותה פיגור בפעילות כמו ה-mRNA של Cas9 שהוזרק. בתיאוריה, זה אמור להגדיל את ההסתברות למוטציה ביאלית בשלב מוקדם בהתפתחות, וכתוצאה מכך גדל הסיכוי שמקטע נרחב יותר של הנבט יושפע. פרוטוקולים ומשאבים אחרים המפרטים כיצד להתכונן למיקרו-הזרקות ניתן למצוא במקומות אחרים^24,26.

1. רכשו או הפיקו חלבון Cas9 (ראו טבלת חומרים). יש למרוח את חלבון Cas9 במים נטולי נוקלאז כדי ליצור תמיסה של 2 מ"ג/מ"ל ו-aliquot 1 μL לתוך צינורות מיקרו-צנטריפוגה מפוליפרופילן ללא RNase. אחסן אותם כצינורות חד-פעמיים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
2. אחר הצהריים לפני ההזרקה, השתמש במושך מיקרופיפטה כדי למשוך נימי זכוכית וליצור מחט הזרקה. אחסנו את המחט הלא שבורה במחזיק מחט סגור עד לבוקר המיקרו-הזרקות.
3. כדי ליצור צלחת הזרקה, יוצקים 20 מ"ל של 1.5% אגרוז / סטרילי H₂O כדי למלא מחצית צלחת פטרי 100 מ"מ X 15 מ"מ ולחכות שהיא תתמצק. לאחר הגדרת תמיסת האגרוז, הוסיפו 20 מ"ל של 1.5% אגרוז/סטרילי H₂O לצלחת הפטרי והכניסו את תבנית הפלסטיק (ראו טבלת חומרים) לתוך האגרוז הנוזלי ותנו לו להתקשות.
4. לאחר שהאגרוז התקשה, מוציאים את תבנית הפלסטיק ומאחסנים את צלחת ההזרקה במהופך במקרר עד לבוקר ההזרקות. ניתן להשתמש בצלחת אחת להזרקות מרובות כל עוד הבארות שומרות על שלמותן.

3. מיקרו-הזרקה של קוקטייל CRISPR-Cas9 לעובר של דג זברה חד-תאי ליצירת קריספנטים אימהיים

הערה: משאבים נוספים למיקרו-הזרקה לעוברים של דגי זברה ניתן למצוא במקומות אחרים^24,26,27. הזרקת תערובת CRISPR-Cas9 לבלסטודיסק המתפתח של עוברים חד-תאיים עשויה להגדיל את ההסתברות ליצירת פריכים אימהיים. ניתן גם להזריק את התערובת לשק החלמון עד לשלב 2 התאים. עם זאת, תערובות המוזרקות לחלמון תלויות בזרימה אופלסמית כדי להגיע לבלסטודיסק, כך ש-CRISPR-Cas9 המוזרק לחלמון יכול להפחית את יעילות החיתוך של ה-CRISPR-Cas9²⁸.

1. אחר הצהריים לפני המיקרו-הזרקות, הציבו צלבים מסוג בר בתיבות הזדווגות של דגי זברה. החזיקו את הדגים הזכריים והנקביים באותו מיכל אך הפרידו ביניהם באמצעות מחיצה של תיבת הזדווגות או הניחו את הנקבה בתוך מיכל הטלת ביצים.
2. בבוקר הניסוי, הוציאו אליקוט אחד של 2 מ"ג/מ"ל של חלבון Cas9 ואליקוט אחד של מאגר ה-sgRNA. בצינור המיקרו-צנטריפוגה נטול הפוליפרופילן נטול RNase המכיל את החלבון Cas9, הרכיבו תערובת הזרקה של 5 μL הכוללת את מאגר ה-sgRNAs, 1 μL של תמיסה אדומה פנול 0.5% ומים נטולי נוקלאז. יש לשאוף לריכוז סופי של 400 ng/μL חלבון Cas9 ו-200 ng/μL של ה-sgRNAs המאוגדים במים נטולי RNase או יחס של 2:1 של חלבון Cas9 ל-sgRNA בעובר המוזרק. תערובת הזרקה זו יכולה להיות מאוחסנת על קרח לבוקר ההזרקה.
3. הוציאו צלחת הזרקה מהמקרר ותנו לה להתחמם לטמפרטורת החדר (RT) למשך 20 דקות לפחות.
4. לאחר הרכבת קוקטייל ההזרקה, אפשרו לזכר ולנקבה להזדווג, למשל על ידי הסרת מחיצת תיבת ההזדווגות או על ידי הצבת הזכר באותה תוספת הטלת ביצים כמו הנקבה, לפי הצורך.
5. לאחר שהדגים הניחו אך לפני שהעוברים נאספו, חתכו את קצה המחט הלא שבורה באמצעות סכין גילוח חדש או מלקחיים עדינים כדי ליצור מחט שיש לה בור קטן מספיק כדי למנוע נזק לעובר אך היא רחבה מספיק כדי שלא תיסתם בתערובת הזרקה. לאחר חיתוך המחט, יש לטעון את המחט עם תערובת ההזרקה באמצעות קצה פיפטה של microloader המוחדר לקצה האחורי של הנימי (ראו טבלאות חומרים).
6. לאחר מילוי המחט, דגירה של המחט למשך 5 דקות ב-RT כדי להרכיב קומפלקסים של Cas9-sgRNA.
7. הפעל את המיקרו-אינז'קטור והכנס את המחט למיקרומניפולטור. מניחים טיפת שמן מינרלי על מגלשה של מיקרומטר ומכיילים את המחט על ידי התאמת לחץ ההזרקה עד שהמחט פולטת בולוס של 1 ננומטר לתוך השמן המינרלי.
   הערה: בעת הזרקת השמן המינרלי, בולוס 1 nL יהיה בקוטר של כ-0.125 מ"מ (או רדיוס של 0.062 מ"מ) כפי שנמדד בשקופית המיקרומטר.
8. כדי לסנכרן את העוברים, אספו אותם לאחר 10 דקות באמצעות מסננת פלסטיק ושטפו אותם לצלחת פטרי באמצעות מדיה אחת E3 (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl₂, 0.33 mM MgSO₄, והוסיפו 20 μL של 0.03 M מתילן כחול לכל 1 ליטר של 1x E3). מוציאים 10-15 עוברים ומכניסים אותם לצלחת פטרי נפרדת כדי להישמר כבקרות לא מוזרקות.
9. העבירו את שאר העוברים המתפתחים לבארות של צלחת ההזרקה.
10. להזריק 1 nL של תמיסה (סך של 400 pg של חלבון Cas9 ו 200 pg של sgRNAs) לתוך blastodisc המתפתח של עובר חד-תאי. אם קצה המחט נסתם, השתמש במלקחיים כדי לשבור את הקצה בחזרה ולכייל מחדש את המחט כדי להוציא בולוס 1 nL. הקפידו להזריק את כל העוברים במהלך 40 הדקות הראשונות של ההתפתחות לאחר ההפריה.
11. לאחר השלמת ההזרקה, החזירו את העוברים המוזרקים לצלחת פטרי מסומנת המכילה מדיה E3 אחת ואפשרו להם להתפתח לאורך כל היום. הסר את כל העוברים שאינם מופרים או שאינם מתפתחים באופן תקין על פי סדרת ההיערכות של דגי הזברה²⁹.

4. הקרנה ל-INDELs סומטיים בעוברים מוזרקים F0

הערה: ניתן להשתמש בשיטות אחרות לזיהוי INDELs, כגון בדיקת T7 endonuclease I או ניתוח התכה ברזולוציה גבוהה, כאשר קובעים אם העוברים מכילים INDELs סומטיים ³⁰.

1. למחרת לאחר הזריקות, הסר עוברים פגומים ופגומים מצלחת פטרי והחלף את המדיה 1x E3 כדי לשמור על בריאות העובר.
2. לאחר ניקוי המנה, אספו שישה עוברים מוזרקים בריאים ושני עוברי בקרה מהצלחת הלא מוזרקת. הכניסו כל עובר בנפרד לתוך באר אחת של צינור רצועת PCR ותייגו את החלק העליון של הצינורות.
3. כדי לחלץ את הדנ"א הגנומי של עוברים בודדים, הסר את המדיה העודפת של E3 מהבארות של צינור הרצועה והוסף 100 μL של 50 mM NaOH לכל באר.
4. לדגור על העוברים ב 95 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. לאחר מכן מקררים את הדגימות ל-4 מעלות צלזיוס, מוסיפים 10 μL של 1 M Tris HCL (pH 7.5), ומערבבים אותן במשך 5 עד 10 שניות. ניתן לאחסן דנ"א מופק זה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך 6 חודשים לפחות ללא פגיעה משמעותית בדנ"א.
5. תכנן פריימרים ייחודיים לסינון עבור כל אתר מדריך כדי להגביר מקטע DNA של 100-110 bp הכולל את אתר היעד CRISPR-Cas9. במידת האפשר, מקם את אתר היעד באמצע הקטע המוגבר, המאפשר זיהוי של מחיקות גדולות יותר.
6. עבור כל אחד מארבעת אתרי היעד המנחים, הגדר שמונה תגובות PCR של 25 μL באמצעות 5 μL של הדנ"א הגנומי המוכן לעובר יחיד, תערובת PCR וראשוני הסינון הספציפיים למדריך כדי לזהות מוטציות סומטיות באתר היעד (טבלה 1).
7. יצוק ג'ל אתידיום ברומיד/TBE של 2.5% אגרוז/0.5 מיקרוגרם/מ"ל באמצעות מסרקים היוצרים בארות ברוחב של כ-0.625 ס"מ. מסרק רחב זה מאפשר רזולוציה טובה יותר בעת זיהוי שינויי גודל ברצף הגנומי. לאחר שהג'ל התמצק, הכניסו אותו לתא אלקטרופורזה המכיל חיץ פועל של TUBE.
8. הוסיפו 5 μL של 6x צבע טעינה למוצר PCR וטענו 25 μL של תערובת זו לתוך הג'ל. ודא שדגימות ההזרקה והבקרה מופעלות באותה שורה של הג'ל. לאחר טעינת כל הדגימות, יש להוסיף 5 μL של אתידיום ברומיד לכל 1 ליטר של חיץ ריצה TBE לקצה החיובי של קופסת הג'ל.
9. הפעל את הג'ל ב-120 וולט עד שרצועות הדנ"א יתפתרו או שהדנ"א יתקרב לקצה הנתיב. אם ה-Cas9 יצר INDELs באתר היעד, בדרך כלל נצפה כתם בדגימות שהוזרקו, אך לא בפקדים.
10. אם נצפו מריחות במינימום של שלושה מתוך ארבעת אתרי ההדרכה בעוברים שהוזרקו להם ארבעה רנ"א מנחים, גדלו העוברים המוזרקים על ידי האחים.
11. בכל פעם שהדגימות המוזרקות אינן מכילות מריחות במספר הנדרש של אתרי מדריך, תכננו רנ"א מדריך חדש שיחליף את אלה שלא עבדו וצרו מאגר חדש של רנ"א מדריך הכולל את אלה שעבדו ואת אלה שעוצבו לאחרונה. להזריק ולבדוק את הבריכה החדשה עבור INDELs סומטיים כמתואר לעיל.

5. זיהוי פנוטיפים של אפקט אימהי בעוברים חדים אימהיים

הערה: ברגע שנקבות F0 המוזרקות הגיעו לבגרות מינית, לתאי הנבט שלהן יש פוטנציאל ליצור תערובת של עוברים אימהיים פריכים ועוברי בר. אף על פי שתערובת זו מאפשרת בקרות פנימיות להפריה ולתזמון התפתחותי, עדיין מועיל להגדיר צלב מסוג בר כבקרה חיצונית למקרה שמצמד מנקבת F0 מכיל רק עוברים פריכים אימהיים.

1. אחר הצהריים שלפני הניסוי, הציבו את הנקבות המוזרקות F0 נגד זכרים מסוג בר ושלטו בצלבים מסוג בר בתיבות הזדווגות סטנדרטיות של דגי זברה. מניחים גם את הדגים הזכריים וגם את הדגים הנקביים באותו מיכל אך מפרידים ביניהם באמצעות מחיצה של תיבת הזדווגות או מניחים את הנקבה בתוך מיכל מטיל ביצים.
2. בבוקר הניסוי, אפשרו לזכר ולנקבה להתחיל להזדווג, למשל על ידי הסרת מחיצת תיבת ההזדווגות או הצבת הזכר באותה תוספת הטלת ביצים כמו הנקבה.
3. אספו את העוברים כל 10 דקות על ידי הזזת התוסף המטיל את הביצים לתחתית מיכל הזדווגות חדשה המכילה מי מערכת מתוקים ותייגו את המיכל עם תג המזהה את נקבת ה-F0 הבודדת. לוקחים את מיכל ההזדווגות הישן ויוצקים את המים דרך מסננת תה כדי לאסוף את העוברים ממצמד בודד אחד של 10 דקות.
4. לאחר שנאספו העוברים ממצמד יחיד של 10 דקות במסננת, העבירו אותם לצלחת פטרי המכילה מדיה E3 אחת. תייג את צלחת הפטרי עם זמן האיסוף ופרטי הדגים.
5. תחת מיקרוסקופ מנתח עם מקור אור המועבר, צפו בעוברים העוברים העוברים התפתחות כל שעה במשך 6-8 השעות הראשונות ומדי יום במשך 5 הימים הבאים.
6. זהה עוברים חדים אימהיים פוטנציאליים על ידי שינויים מורפולוגיים גולמיים בהתפתחותם בהשוואה לבקרות מסוג בר תואמות זמן²⁹.
7. העבירו את העוברים הפריכים האימהיים הפוטנציאליים לצלחת פטרי המכילה 1x E3 ובדיקה לפנוטיפ מורפולוגי ב-24 כ"ס וכדאיות (למשל, ניפוח שלפוחית השתן בשחייה) 5 ימים לאחר ההפריה.

6. ריצוף אללים בהפלואידים פריכים אימהיים

הערה: ההפלואידים החד-קרניים האימהיים מכילים אלל יחיד במוקד הממוקד, מה שמאפשר זיהוי של INDELs בגן המטרה באמצעות ריצוף סנגר. ניתן גם לנתח עוברי ההפלואידים הפריכים של האם באמצעות מבחני ריצוף מהדור הבא. עוברים המראים פנוטיפ פריך אימהי צפויים לשאת נגע לפחות באחד מארבעת אתרי היעד (ראו דיון).

1. אחר הצהריים שלפני הניסוי, הקימו זוגות הזדווגות של נקבות F0 הידועות כמייצרות עוברים חדים אימהיים שעברו לזכרים מסוג בר. יש להפריד פיזית את הזכרים מסוג בר מהנקבות באמצעות מחיצה של תיבת הזדווגות או להניח את הנקבה בתא הטלת הביצים.
2. בבוקר הניסוי, הסירו את המחיצה הפיזית או הניחו גם את הזכרים וגם את הנקבות בתוך התוסף המטיל ביצים כדי ליזום הזדווגות. בסימן הראשון של הטלת ביצים, להפסיק את הרבייה על ידי הפרדת הזכר ואת נקבות F0. יש לשמור כל נקבת F0 מופרדת בתיבות הזדווגות נפרדות.
3. הכינו תמיסת זרע שטופלה ב-UV באמצעות אשכים של זכר אחד מסוג פרא עבור כל 100 μL של התמיסה של האנק (טבלה 2), מספיק כדי להפרות ביציות שהוברחו מנקבה אחת, כפי שתואר קודם^{לכן 31}.
4. חילוץ ידני של ביציות בוגרות מנקבות F0 שנבחרו מראש וביצוע הפריה חוץ גופית (IVF) באמצעות זרע³¹ שטופל ב-UV.
5. לאחר הפריה חוץ גופית , אפשרו לעוברים ההפלואידים להתפתח עד לתצפית על הפנוטיפ הפריך האימהי והכניסו את העוברים הללו לצלחת פטרי אחרת.
6. לאחר שזוהו עוברי ההפלואידים האימהיים, אפשרו להם להתפתח לפחות 6 שעות לאחר ההפריה.
7. כדי לחלץ את הדנ"א הגנומי מלפחות עשרה עוברים חד-פעמיים חד-הוריים, הנח עובר הפלואיד יחיד לתוך באר בודדת של צינור רצועת PCR, הסר מדיה עודפת של E3 מהבאר והוסף 50 μL של 50 mM NaOH.
8. לדגור על העוברים ב 95 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. לאחר מכן מקררים את הדגימות ל-4 מעלות צלזיוס, מוסיפים 5 מיקרון ליטר של 1 M Tris HCL (pH 7.5), ומערבולות במשך 5-10 שניות. ניתן לאחסן את הדנ"א המופק בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.
9. כדי לזהות אילו אתרים מנחים מכילים INDELs, תכננו פריימרים לריצוף כדי להגביר מקטע דנ"א הכולל את כל ארבעת אתרי היעד של CRISPR-Cas9. פריימרים ריצוף אלה מאפשרים זיהוי של INDELs המשתרעים על פני מספר אתרי מנחה.
10. הגדר שתי תגובות PCR של 25 μL לכל עובר באמצעות 5 μL של הדנ"א הגנומי המוכן והפריימרים של הריצוף.
11. לאחר סיום ה-PCR, יש לטהר ולרכז את שתי הדגימות באמצעות ערכת ניקוי DNA וריכוז (ראו טבלת חומרים). לאחר מכן הגש את מקטע הדנ"א לריצוף סנגר באמצעות פריימרים של ריצוף קדימה ואחורה.
12. לאחר ריצוף מקטע הקריספנט האימהי ההפלואידי, יישרו אותו לרצף מסוג פראי וזהו INDELs באתרי היעד באמצעות תוכנית יישור רצף.

תוצאות

הגישה הניסויית המתוארת בפרוטוקול זה מאפשרת זיהוי של פנוטיפים של השפעה אימהית באופן מהיר וחסכוני במשאבים (איור 1).

יצירת פריכיות אימהית:
כאשר מתכננים את ארבעת הרנ"א המנחים כך שיתמקדו בגן בעל השפעה אימהית מועמד יחיד, יש לתת את הדעת במיוחד למקום שבו הרנ"א המנחה ייקשר לדנ"א. באופן כללי, כולם צריכים להיות מקובצים יחד עם אזורים חופפים מינימליים עד ללא חפיפה בין רנ"א מנחה בתחילת תחום החלבון החזוי הראשון (איור 2A). התמקדות...

דיון

הפרוטוקול המוצג בכתב יד זה מאפשר זיהוי ואפיון מולקולרי ראשוני של פנוטיפ אפקט אימהי בדור אחד במקום הדורות המרובים הנדרשים לטכניקות גנטיות קדימה ואחורה. נכון לעכשיו, תפקידם של גנים רבים המתבטאים באופן אימהי אינו ידוע. חוסר ידע זה נובע בחלקו מהדור הנוסף הנדרש כדי לדמיין פנוטיפ בעת זיהוי גנים בעלי השפעה אימהית. בעבר, זיהוי מהיר של גנים בעלי השפעה אימהית בדגי זברה יכול היה להיות מושג על ידי הזרקת מורפולינו אוליגונוקלאוטידים חוסמי תרגום לביציות מתורבתות³². שיטה זו הוכחה כמוצלחת על ידי פנוקופיה של מספר ג...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1 M Tris-HCl (pH 8.4)	Invirogen	15568025	לתערובת PCR
1.5 מ"ל צינורות אפנדורף	כל יצרן
10 מ"מ dNTPs	תרמו פישר	18427013	סינתזה של gRNA
100 BP סולם	כל יצרן		לאלקטרופורזה ג'ל
100% אתנול ללא RNA	כל יצרן
100% RNAse אתנול	חופשי כל יצרן
100 מ"ל	כל יצרן		להפריה חוץ גופית
5 מ 'אמוניום אצטט	תרמו פישר מדעי	נמצא בערכת התמלול MEGAshortscript T7	סינתזה של gRNA
70% סינתזת אתנול			של gRNA (70 מ"ל אתנול + 30 מ"ל של  מים ללא נוקלאז)
בורוזיל 1.0 מ"מ OD x 0.5 מ"מ מזהה	FHC INC	27-30-1	עבור מיקרו הזרקה
בתפזורת פארמה נתרן ביקרבונט 35 פאונד	אספקת שונית בתפזורת	255	אספקת דגים
CaCl2	MiliporeSigma	C7902
Cas9 חלבון עם NLS	PNABio	CP01
ChopChop			https://chopchop.cbu.uib.no/
קבוע אוליגונוקלאוטיד	משולב DNA טכנולוגיות (IDT)		AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATGATAACGGACTA GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC TAGCTCTAAAAC
דיכאון זכוכית צלחת	תרמו פישר מדעי	13-748B	להפריה חוץ גופית
כריתת מלקחיים	דומונט	SS	להפריה חוץ גופית
מספריים	כלי מדע עדינים	14091-09	להפריה חוץ גופית
ניתוח סטרוסקופ (עם מקור אור מועבר)	כל יצרן		להפריה חוץ גופית
DNA נקי & רכז -5	Zymo Research	D4014	סינתזה של gRNA
DNA ג'ל טעינת צבע (6x)	כל יצרן		לאלקטרופורזה ג'ל
EconoTaq DNA פולימראז	Lucigen	30032-1	עבור PCR תערובת
אלקטרופרזיס ספק כוח	כל יצרן
			https://useast.ensembl.org/index.html
אפנדורף  טיפים למיקרו-מעמיס Femtojet למיקרו-מזרק Femtojet	תרמו פישר E5242956003 מדעי		למיקרו-הזרקה
אתנול (200 הוכחה, ללא נוקלאז)	כל יצרן
FemtoJet 4i	Eppendorf	5252000021	לרשת דגים מיקרו-הזרקה
	כל יצרן		אספקת דגים
קפוא שרימפס	מי מלח שרימפס ישיר		ציוד לדגים
כללי לכל מטרה Agarose	כל יצרן		עבור ג'ל אלקטרופורזה
אוליגונוקלאוטיד ספציפי לגן	DNA משולבות (IDT)		TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
כפפות	כל יצרן
דלי קרח	כל יצרן
מלח אוקיינוס מיידי	כל יצרן		אספקת דגים
Invitrogen UltraPure Ethidium Bromide, 10 מ"ג/מ"ל	תרמו פישר סיינטיפיק	15-585-011
KCl	MiliporeSigma	P5405
KH2PO4	MiliporeSigma	7778-77-0
Kimwipes	Thermo Fischer Scientific	06-666
זכר & נקבת דג
MEGAshortscript T7 ערכת תמלול	תרמו פישר מדעי	AM1354	סינתזה של gRNA
מתילן כחול	תרמו פישר	AC414240250	מדעי עבור E3
MgCl2	MiliporeSigma	7791-18-6	עבור תערובת PCR
MgSO2· 7H2O	MiliporeSigma	M2773
עובש פלסטיק מיקרו-הזרקה	World Precision Instruments	Z-Templates	עבור מיקרו-מניפולטור מיקרו-הזרקה
	כל יצרן		עבור
מיקרו-הזרקת מיקרו-פיפטרים	כל יצרן
חולץ מיקרופיפטה	סאטר	P-87	עבור מיקרו-הזרקה
טיפים למיקרופיפטר עם מסננים (כל הגדלים)	כל יצרן
טיפים מיקרופיפטר ללא מסננים (כל הגדלים)	כל יצרן
מיקרוגל	כל יצרן
שמן מינרלי	MiliporeSigma	m5904-5ml	למיקרו-הזרקה
MS-222 (טריקאין-D)	כל יצרן		מאושר על ידי ה-FDA
Na2 HPO4	MiliporeSigma	S3264
NaCl	MiliporeSigma	S5886
NaHC03	MiliporeSigma	S5761
Nanodrop	כל יצרן
NaOH	MiliporeSigma	567530
Nonstick, צינורות מיקרופוגה ללא RNase, 1.5 מ"ל	אמביון	AM12450	סינתזה של gRNA
מים נטולי נוקלאז	כל יצרן
מגבת נייר	כל יצרן
פסטרו פיפטס	כל יצרן
צינורות רצועת PCR	כל יצרן
צלחות פטרי קוטר 100 מ"מ	כל יצרן
תמיסת פנול אדום	MiliporeSigma	P0290	עבור מיקרו הזרקת
פלסטיק pestals	VWR	47747-358	עבור IVF
כף פלסטיק	IVF כל יצרן		עבור IVF
פרימיום כיתה מלח שרימפס ביצי	שרימפס ישיר		רשת עדינה
RNA ג'ל טעינת צבע		נמצא ב MEGAshortscript T7 ערכת תמלול	עבור ג'ל אלקטרופורזה
RNAse AWAY	תרמו פישר מדעי	21-402-178
קנה מידה	כל יצרן
שארפי	כל יצרן
מרית	כל יצרן
סטרילי H2O	כל יצרן		לתערובת PCR
T4 DNA פולימראז	NEB	M0203	סינתזה של קלטת gRNA
	כל יצרן
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10x	כל יצרן		עבור ג'ל אלקטרופורזה
מכתים תה	אמזון	IMU-71133W	אספקת
דגיםThermo Scientific Owl מסרק 12 שיניים, עובי 1.0/1.5 מ"מ, דו צדדי עבור B2	Thermo Fischer Scientific	B2-12	לאלקטרופורזה של ג'ל
Thermo Scientific  ינשוף EasyCast B2 מיני ג'ל מערכות אלקטרופורזה	תרמו פישר סיינטיפיק	09-528-110B	לאלקטרופורזה של ג'ל
תרמו-סייקלר	כל יצרן
Thermocycler	כל יצרן
Transilluminator	כל יצרן
מנורת UV	UVP	דגם XX-15 (Cat מס' UVP18006201)	למשקפי בטיחות UV IVF
	כל יצרן		עבור
IVF לשטוף בקבוק	תרמו פישר מדעי	S39015	אספקת דגים
דג זברה קופסאות הזדווגות	אקווה שוורץ	SpawningBox1	אספקת דגים
1.5 מ"ל צינורות אפנדורף	פישר סיינטיפיק	05-402-11
10 טוחנת dNTPs	תרמו פישר סיינטיפיק	18427013
100 BP סולם	תרמו פישר סיינטיפיק	15628019
100% אתנול ללא RNAse	כל יצרן
5 מ' אמוניום אצטט	תרמו פישר סיינטיפיק
70% אתנול			70 מ"ל אתנול ו-30 מ"ל מים ללא נוקלאז
אביזרים לתיבת ג'ל אופקית	פישר סיינטיפיק		0.625 מ"מ
אגרוז	כל יצרן
CaCl2	Sigma	10043-52-4
CaCl2, dihydrate	Sigma	10035-04-8	E3
צינורות נימיים בינוניים	Cole-Parmer	UX-03010-68	למחטי הזרקה
Cas9 חלבון	Thermo Fischer Scientific	A36496
ChopChop	https://chopchop.cbu.uib.no/
מחשב	כל יצרן
ניתוח תפיסות	כל יצרן
ניתוח מיקרוסקופ	כל יצרן
ניתוחי מספריים	כל יצרן
DNA נקי & רכז -5	Zymo Research	D4014
DNA צבע טעינת ג'ל (6X)	Thermo Fischer Scientific	R0611
EconoTaq DNA פולימראז	Lucigen	30032-1
אנסמבל	https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Microloader PipetteTips	Fischer Scientific	10289651	20 מיקרוליטר
אתנול (200 הוכחה, ללא נוקלאז)	כל יצרן
אתידיום ברומיד	תרמו פישר מדעי	15585011
רשת דגים	כל יצרן		רשת עדינה
שרימפס מלח קפוא	LiveAquaria	CD-12018	מזון
דגים מסרק ג'ל (0.625 מ"מ)	כל יצרן
ג'ל אלקטרופרזיס מערכת	כל יצרן
משולבות אוליגונוקלאוטידים ספציפיות לגן	(IDT)
מחט קפילרית זכוכית	21TZ99		https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88 VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL w_wcB:G:s& s_kwcid=AL!2966!3! 264955916096!!! g!438976 780705!& gucid=N:N:PS:משולם :GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501 231& gclid=Cj0KCQjw8IaGBh CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI 964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw _wcB& gclsrc=aw.ds
כלי זכוכית	כל יצרן
פתרון			9.9 מ"ל של Hank's Premix עם 0.1 מ"ל HS Stock #6
Hank's Premix			שלב את הדברים הבאים לפי הסדר: (1) 10.0 מ"ל HS #1, (2) 1.0 מ"ל HS#2, (3) 1.0 מ"ל HS#4, (4) 86 מ"ל ddH2O, (5) 1.0 מ"ל HS#5. אחסן את כל תחליפי HS ב-4C
Hanks Solution
Hank's Solution
https://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization-Hank's Stock Solution #1			8.0 גרם NaCl, 0.4 גרם KCl ב-100 מ"ל ddH2O
Hank's Stock Solution #2			0.358 גרם Na2HPO4 נטול מים; 0.60 גרם K2H2PO4 ב-100 מ"ל ddH2O
תמיסת המלאי של האנק #4			0.72 גרם CaCl2 ב-50 מ"ל ddH2O
תמיסת המלאי של האנק #5			1.23 גרם MgSO47H2O ב-50 מ"ל ddH20
תמיסת המלאי של האנק #6			0.35 גרם NaHCO3 ב-10.0 מ"ל ddH20; הפוך את יום השימוש הטרי
HCl	Sigma	7647-01-0
דלי קרח	לכל יצרן
מלח אוקיינוס מיידי	כל יצרן		עבור מי דגים
ערכת תמלול במבחנה מגה סקריפט קצר	תרמו פישר מדעי	AM1354
Invitrogen™ UltraPure&Trade; DNase/RNase ללא מים מזוקקים	Fisher Scientific	10-977-023
KCl	Sigma	7447-40-7	E3 בינוני
KH2PO4	Sigma	7778-77-0
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666
זכר ונקבה דג
Mega Short Script T7 Transciption Kit	Thermo Fischer Scientific	AM1354
מתילן כחול	פישר מדעי	AC414240250	E3 בינוני
MgSO2-7H2O	סיגמא	M2773
Microimicromanipulator
עובש פלסטיק מיקרו-הזרקה	מכשירים דיוק עולמי	Z-תבניות
מיקרו-מזרק
מיקרו-מחט שקופיות
Micropipeter (1-10) עם טיפים	כל יצרן		צריך p10 מסוננים טיפים
Micropipetter (20-200) עם טיפים	כל יצרן
Micropippetter (100-1000) עם טיפים	כל יצרן
מיקרופלסטיק שקופיות
מיקרוגל	כל יצרן
MiliQ מים	כל יצרן
שמן מינרלי	סיגמא-אולדריץ'	M5904-5 מ"ל
Na2HPO4	Sigma
NaCl	Sigma	S9888
NaHC02	Sigma	223441
Nanodrop
NaOH	Sigma	567530
מרית צרה	כל יצרן
חולץ מחט	Sutter	P-97
מגבת נייר	כל יצרן
Pastro Pipettes	Fisher Scientific	13-678-20A
PCR פריימר מאגף מדריך אתר טכנולוגיות	DNA משולבות (IDT)
PCR פריימרים מאגפים מדריך RNA אתר חיתוך טכנולוגיות	DNA משולבות (IDT)		סטנדרטי מותפל
צינורות רצועת PCR	תרמו פישר מדעי	AB0771W
פטרי כלים	פישר מדעי	FB0875714	10 ס"מ קוטר 100 מ"מ x 15 מ"מ
פנול אדום	פישר מדע	S25464
https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464 טיפים פיפטה	כל יצרן		טיפים 10ul, 200ul ו-1000ul
מזיקים מפלסטיק	פישר סיינטיפיק	12-141-364
כפית פלסטיק	כל יצרן
מדריך פריימר אתר	DNA משולבות (IDT)
סכין גילוח	Uline	H-595B
RNA ג'ל טוען צבע	בערכת סקריפט מגה קצר (ערכת העברה במבחנה)
RNAse	משם פישר	21-402-178
צינורות מיקרוצנטריפוגה מפוליפרופילן ללא RNA	תרמו פישר AM12400 מדעי		https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400
מים ללא RNAse	פישר סיינטיפיק	10-977-023
קנה מידה	כל יצרן
שארפי	כל יצרן
נתרן ביקרבונט (תא נבדק תרבית)	Sigma	S5761	מי דגים
נתרן ברומיד סולוטיון	Sigma	E1510
תוכנה לניתוח
ספקטרופוטומטר
Sterlie H2O	כל מותג
T4 DNA פולימראז	NEB	M0203S	https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information
הדבק	כל מותג
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10X	Thermo Fischer Scientific	B52
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52 Tea Stainer	אמזון	IMU-71133W	זמין ברוב חנויות המטבחים
Thermocycler
העברת פיפטה	Uline	S-24320
Transilluminator
Tricaine	fisher Scientific	NC0872873
Tris HCl 7.5	Thermo Fischer Scientific	15567027
Universal Primer	Integrated DNA Technologies (IDT)		AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG CCTTATTTTTTAACTTGCTATTTCTA GCTCTAAAAC
מנורת UV	UVP
משקפי בטיחות	UV כל יצרן
בקבוק	כביסה פישר מדעי	S39015
קופסאות הזדווגות דג זברה	כל יצרן
PCR מתכון	מאגרהוסף 171.12 מ"ל H20 סטרילי; 0.393 מ"ל 1M MgCl2; 2.616 מ"ל 1M MgCl2; 2.618 מ"ל 1M Tris-HCl (pH 8.4) 13.092 מ"ל 1M KCl; 0.262 מ"ל 1% ג'לטין. אוטוקלאב למשך 20 דקות ואז מצננים את הסולו על קרח. לאחר מכן הוסף 3.468 מ"ל 100 מ"ג/מ"ל BSA; 0.262 מ"ל dATP (100 מ"מ), 0.262 מ"ל dCTP (100 מ"מ); 0.262 מ"ל dGTP (100 מ"מ);   0.262 מ"ל dTTP (100 מ"ל). אליציטוט לצינורות אפנדורף סטריליים