מאמר שיטה

שימוש באופטוגנטיקה כדי להפוך גמישות מוחית ולעכב חיפוש קוקאין בחולדות

DOI:

10.3791/63185

⸱

5 באוקטובר 2021

 ,  , 
1Department of Psychiatry, University of Pittsburgh, 2Department of Psychiatry, Rutgers University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטות המתוארות כאן מתארות הליך המשמש להיפוך אופטוגנטי של פלסטיות הנגרמת על ידי קוקאין במעגל רלוונטי התנהגותית בחולדות. גירוי אופטי מתמשך בתדר נמוך של סינפסות תלמו-אמיגדלה גורם לדיכאון ארוך טווח (LTD). In vivo המושרה אופטיגנטית LTD בחולדות שחוו קוקאין הביאה לאחר מכן להחלשה של חיפוש סמים המונע על ידי רמזים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מדגים את הצעדים הדרושים לשימוש בכלים אופטוגנטיים כדי להפוך את הפלסטיות הנגרמת על ידי קוקאין במעגלי תלמו-אמיגדלה כדי להפחית התנהגויות חיפוש קוקאין עוקבות בחולדה. במחקר שלנו, מצאנו שכאשר חולדות מנהלות בעצמן קוקאין תוך ורידי בשילוב עם רמז אורקולי, סינפסות הנוצרות בקלט מגרעין הגניקולאט המדיאלי של התלמוס (MGN) אל תאי העצב העיקריים של האמיגדלה הצידית (LA) מתחזקות ככל שנלמד הקשר בין רמז לקוקאין. שיערנו כי היפוך הפלסטיות הנגרמת על ידי קוקאין בסינפסות אלה יפחית התנהגות המונעת על ידי קוקאין המונעת על ידי רמזים. על מנת להשיג סוג זה של נוירומודולציה in vivo, רצינו לגרום לדיכאון סינפטי לטווח ארוך (LTD), אשר מקטין את כוחן של סינפסות MGN-LA. לשם כך השתמשנו באופטוגנטיקה, המאפשרת נוירומודולציה של מעגלים מוחיים באמצעות אור. אופסין oChiEF מעורר בא לידי ביטוי על מסופי MGN presynaptic בלוס אנג'לס על ידי החדרת AAV המכיל oChiEF לתוך MGN. סיבים אופטיים הושתלו אז בלוס אנג'לס ואור לייזר 473 ננומטר פועם בתדר של 1 הרץ למשך 15 דקות כדי לגרום לפלסטיות המושרה על ידי קוקאין ולהפוך אותו. מניפולציה זו מייצרת הפחתה ארוכת טווח ביכולתם של רמזים הקשורים לקוקאין לגרום לפעולות חיפוש סמים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שימוש בסמים הוא נושא רציני מאוד לבריאות הציבור בארה"ב וברחבי העולם. למרות עשרות שנים של מחקר אינטנסיבי, יש מעט מאוד אפשרויות טיפוליות יעילות 1,2. מכשול עיקרי בטיפול הוא העובדה ששימוש כרוני בסמים יוצר זיכרונות אסוציאטיביים ארוכי טווח בין רמזים סביבתיים לבין התרופה עצמה. חשיפה חוזרת לרמזים הקשורים לסמים מניעה תגובות פיזיולוגיות והתנהגותיות המניעות את המשך השימוש בסמים והישנות3. אסטרטגיה טיפולית חדשנית היא ליישם טיפולים מבוססי זיכרון שמטרתם לתמרן את המעגלים המעורבים בוויסות אסוציאציות של רמזי סמים. לאחרונה, נצפה כי סינפסות באמיגדלה הצידית (LA), במיוחד אלה הנובעות מגרעין הגניקולאט המדיאלי (....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הניסויים המתוארים בפרוטוקול זה עלו בקנה אחד עם ההנחיות שנקבעו על ידי מדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת פיטסבורג. כל ההליכים בוצעו באמצעות חולדות בוגרות ותמימות של ספראג-דולי ששקלו 275-325 גרם עם הגעתן.

1. בניית שתלי סיבים אופטיים וכבלי טלאי

  1. הכינו שתלי סיבים אופטיים בהתאם לפרוטוקולים שפורסמו בעבר9. ניסויים המתוארים בפרוטוקול זה השתמשו בסיבי ליבה של 200 מיקרומטר (0.5 NA) ו-Ø1.25 מ"מ Multimode LC/PC Ceramic ferrule, בגודל חור Ø230 מיקרומטר.
    1. השתמש בכלי Dremel כדי להבקיע את השליש התחתון של fe....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ציר זמן המתאר את סדר הניסויים מוצג באיור 1. במהלך ניסויים התנהגותיים, מספר עירויי הקוקאין, כמו גם מספר התגובות המבוצעות על המנוף הפעיל, משמשים כמדד לעוצמת ההתנהגות המחפשת קוקאין. במהלך הימים הראשונים של מתן עצמי של קוקאין, מספר התגובות הפעילות אמור לגדול בהדרגה בכל יום רכישה, לפני שהוא מתייצב במהלך השבוע השני. לעומת זאת, תגובות מנוף לא פעילות צריכות להישאר נמוכות לאורך כל הניסוי (איור 2A). ביום הראשון של ההכחדה האינסטרומנטלית, יש בדרך כלל עלייה במספר תגובות המנו.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כפי שתואר לעיל, ישנם מספר שלבים קריטיים החשובים להשגת תוצאות הניסוי הנכונות. סביר להניח שהפרוטוקול יהיה יעיל רק בבעלי חיים שרוכשים כראוי קוקאין בניהול עצמי, ועד כה הוא נבדק רק באמצעות הפרמטרים שפורטו לעיל. ייתכן שניתן לשנות את מינון הקוקאין, לוח הזמנים של החיזוק ופרמטרים של רמזים עם השפעה מועטה ככל הנראה על התוצאות ההתנהגותיות, למעט העובדה שלוח זמנים של חיזוק מסדר שני עלול להוביל לחיפוש קוקאין שאינו תלוי באמיגדלה שיכול להפחית את יעילות ההליך, אם כי זה לא נבדק ישירות14 . ישנן מספר נקודות לאורך הפרו.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להכיר בתמיכה ממענקי USPHS K01DA031745 (MMT), R01DA042029 (MMT), DA035805 (YHH), F31DA039646 (MTR), T32031111 (MTR) ומשרד הבריאות של פנסילבניה.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.9% מלחפישר ScientificNC0291799
A.M.P.I. מבודד גירויאיזו-פלקס
AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomatoDuke Viral Vector Core (via Roger Tsien)#268ראה Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014
AAV5.hSyn.tdTomato (Control)Duke Viral Vector Core Controlראה Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014
דמעות מלאכותיות (משחה אופטלמולוגית)Covetrus70349
ATP מגנזיום מלחפישר סיינטיפיקA9187
בטדיןבאטלר שיין38250
סידן כלורידפישר סיינטיפיקC1016
צזיום כלורידפישר סיינטיפיק289329
צזיום הידרוקסידפישר סיינטיפיק516988
צזיום מתאן סולפונאטפישר סיינטיפיקC1426
קוקאין HClNIDA מרכז אספקת תרופות9041-001
CryostatLeicaCM1950
D-גלוקוזסיגמא-אולדריץ'G8270
DMSOפישר סיינטיפיקBP231-1
בקר טמפרטורה דו-ערוציוורנר אינסטרומנטסTC-344C
EGTAפישר סיינטיפיקE3889
אתנולאוניברסיטת פיטסבורג כימיה מחסן200C5000
כובעי אבק פרולמעבדות תורCAPLמכסי אבק מפלסטיק לבן עבור 1.25 מ"מ טבעות
שרוולי הזדווגות טבעתעדשות דוריותF210-3011Sleeve_BR_1.25, ברונזה, 1.25 מ"מ
ID טבעותמוצרי סיבים מדויקיםMM-FER2007C-2300Ø 1.25 מ"מ Multimode LC/PC טבעת קרמית, ואוסלאש; 230 μ m חור בגודל
סיבים אופטייםמעבדות תורFP200URT200 μ m סיבים מולטימוד ליבת (0.5 NA)
סיבים אופטיים סיבוב משותףPrizmatix(הוזמן מאמזון)קוטר 18 מ"מ, מחבר FC-FC לכלי
הפשטת סיביםסיבים Thor LabsT12S21
Fluoroshield עם DAPISigma-AldrichF6057
GentamicinHenry Schein6913
GTP נתרן מלחפישר מדעימזרק G8877
המילטוןהמילטון8008510 μ L נפח, 26 מד, 2 אינץ', סגנון נקודה 3
אקדח חוםAllied Electronics972-6966250 וולט, 750-800 ומעלות; F
מוצרי סיבי דיוקאפוקסי הניתנים לריפוי בחוםPFP-353ND-8OZ
הפריןהנרי שיין55737
HEPESסיגמא-אולדריץ'H3375
חומצה הידרוכלוריתפישר סיינטיפיק219405490
איזופלורןהנרי שיין29405
קטמין HClהנרי שיין55853קטמין הוא חומר מבוקר ויש לטפל בו בהתאם להנחיות המוסדיות
רינגר חלב sHenry Schein9846
לייזר, דרייבר ומצמד לייזר לסיביםOEM מערכות לייזרBL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0100 mW, 473-nm, לייזר מצב מוצק משואב דיודה (אפשרות אחת)
L-גלוטתיוןפישר סיינטיפיקG4251
לידוקאיןבאטלר שיין14583
חיישן אורThor LabsPM100Dקונסולת מד אנרגיה קומפקטית עם תצוגה דיגיטלית
דבק מיידי LoctiteGrainger5E207
מגנזיום גופרתיSigma-Aldrich203726
מגבר מיקרואלקטרודה / רכישת נתוניםהתקנים מולקולרייםMULTICLAMP700B / Digidata 1440A
משאבת מיקרו-מזרקהרווארד70-4501מזרק כפול
מיקרומניפולטורמכשירי סאטרMPC-200 / ROE-200
מיקרוסקופאולימפוסBX51WIמיקרוסקופ זקוף לאלקטרופיזיולוגיה
מיקרוסקופאולימפוסBX61VSמיקרוסקופ סריקת שקופיות אפיפלואורסצנטי
N-methyl-D-glucamineSigma-AldrichM2004
צמנט שיניים אורתוג'ט, נוזליLang Dental1504BLKשחור
Orthojet צמנט דנטלי, אבקהLang Dental1530BLKאבקה עכשווית, שחור
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
כבלי תיקוןThor LabsFP200ERTMultimode, FT030 צינורות
PicrotoxinFisher ScientificAC131210010
ליטוש דיסקThor LabsD50FC
כרית ליטושThor LabsNRS9139 אינץ' x 13 אינץ'
נייר ליטושThor LabsLFG5P5 μ m חצץ
נייר ליטושThor LabsLFG3P3 μ m חצץ
נייר ליטושThor LabsLFG1P1 μ m חצץ
נייר ליטושThor LabsLFG03P0.3 μ m חצץ
אשלגן כלוריסיגמא-אולדריץ'P9333
אשלגן הידרוקסידפישר סיינטיפיקP5958
אשלגן מתאן סולפונאטפישר סיינטיפיק83000
QX-314-ClAlomone LabsQ-150
רימדיל (קרפרופן)הנרי שיין24751
ניהול עצמי Chambers/SoftwareMed AssociatesMED-NP5L-D1
נתרן ביקרבונטסיגמא-אולדריץ'S5761
נתרן כלוריסיגמא-אולדריץ'S7653
נתרן הידרוקסידסיגמא-אולדריץ1064980500
נתרן L-אסקורבטסיגמא-אולדריץ'A7631
נתרן פנטוברביטלהנרי שיין24352
נתרן פוספטסיגמא-אולדריץ'S9638
נתרן פוספוקריאטיןפישר מדעיP7936
נתרן פירובטסיגמא-אולדריץ'P2256
ברגי מכונת נירוסטהWW Grainger  בורג מכונה 6GB25M2-0.40 מ"מ, פאן, פיליפס, A2 נירוסטה, רגיל, מתאם סטריאוטקסי באורך 3 מ"מ
לטבעותThor LabsXCL
מסגרת סטריאוטקסיתStoelting51603
סוכרוזSigma-AldrichS8501
חוט תפרFine Science Tools18020-50חוט משי; גודל: 5/0, קוטר: 0.12 מ"מ
TEA-כלורידפישר סיינטיפיקT2265
ThioureaSigma-AldrichT8656
דבק רקמותVetbond Covetrus001505
VibratomeLeicaVT1200S
XylazineButler Schein33198
מכשיר '

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Connors, N. J., Hoffman, R. S. Experimental treatments for cocaine toxicity: A difficult transition to the bedside. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 347 (2), 251-257 (2013).
  2. Makani, R., Pradhan, B., Shah, U., Parikh, T.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים