הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

חקירת חילוף החומרים הלבבי בלב עכבר מבודד עם היפרפולריזציה [1-13C] פירובט וספקטרוסקופיית NMR 13C/31P

2.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63188

⸱

21 באפריל 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Radiology, Hadassah Medical Organization and Faculty of Medicine, Hebrew University of Jerusalem, 2The Wohl Institute for Translational Medicine

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים מערך ניסיוני לניהול מטבוליטים היפרפולריים 13בעלי תווית C במצב זילוח רציף ללב עכבר מבודד ומחורר. גישה ייעודית לרכישת 13C-NMR אפשרה לכמת את פעילות האנזים המטבולי בזמן אמת, וניתוח מולטי-פרמטרי של 31P-NMR איפשר לקבוע את תכולת ה-ATP וה-pH של הרקמה.

תקציר

חילוף החומרים הוא הבסיס לתהליכים חשובים בחיים התאיים. אפיון האופן שבו רשתות מטבוליות מתפקדות ברקמות חיות מספק מידע חיוני להבנת מנגנון המחלות ולתכנון טיפולים. בעבודה זו, אנו מתארים נהלים ומתודולוגיות לחקר פעילות מטבולית בתוך התא בלב עכבר מחורר בזמן אמת. הלב בודד באתרו, בשילוב עם דום לב כדי למזער את איסכמיה שריר הלב והיה מחורר בתוך ספקטרומטר תהודה מגנטית גרעינית (NMR). בעודו בספקטרומטר ותחת זילוח מתמשך, פירובט היפרפולרי [1-13 C] ניתן ללב, וקצבי הייצור ההיפרפולריים הבאים [1-13C] לקטט ו[13C] ביקרבונט שימשו לקביעה, בזמן אמת, את שיעורי ייצור לקטט דהידרוגנאז ופירובט דהידרוגנאז. פעילות מטבולית זו של פירובט היפרפולרי [1-13C] כומתה באמצעות ספקטרוסקופיית NMR במודל חופשי תוך שימוש בגישת רכישת עירור רווי סלקטיבי של המוצר. 31 ספקטרוסקופיית P יושמה בין הרכישות ההיפרפולריות כדי לעקוב אחר אנרגיית הלב וה- pH. מערכת זו שימושית באופן ייחודי לחקר פעילות מטבולית בלב עכבר בריא וחולה.

מבוא

שינויים במטבוליזם הלב קשורים למגוון של קרדיומיופתיות ולעתים קרובות מהווים את הבסיס למנגנונים הפתופיזיולוגיים הבסיסיים1. עם זאת, ישנם מכשולים רבים לחקר חילוף החומרים ברקמות חיות, שכן רוב הבדיקות הביוכימיות דורשות הומוגניזציה של הרקמה וליזה התא ו / או מעקב רדיואקטיבי. לכן, יש צורך דחוף בכלים חדשים לחקור את חילוף החומרים של שריר הלב ברקמות חיות. תהודה מגנטית (MR) של מצעים היפרפולריים 13בעלי תווית C מאפשרת מדידות בזמן אמת של חילוף החומרים ברקמות חיות2, ללא שימוש בקרינה מייננת, על ידי הגדלת יחס אות ה-MR לרעש (SNR) של האתר(ים) המסומנים במספר סדרי גודל3. כאן אנו מתארים מערך ניסויי, גישת רכישה וגישה אנליטית לחקר חילוף החומרים המהיר בלב העכבר המבודד, ובמקביל מציגים אינדיקטורים של אנרגיה וחומציות כללית של רקמות. ה- pH הלבבי הוא אינדיקטור חשוב, שכן איזון בסיס חומצה מופר בשלבים המוקדמים של מחלות לב ותנאים כגון איסכמיה שריר הלב, היפרטרופיה לא מסתגלת ואי ספיקת לב6.

ייצור היפרפולרי [1-13 C]לקטט ו-[13 C]ביקרבונט מהיפרפולריזציה [1-13C]פירובט מסייע בקביעת שיעורי הייצור של לקטט דהידרוגנאז (LDH) ופירובט דהידרוגנאז (PDH). רוב המחקרים הקודמים שבוצעו באמצעות סובסטרטים היפרפולריים בלב המכרסם המבודד השתמשו במודלים קינטיים מורכבים כדי לגזור את הפעילות האנזימטית של LDH ו- PDH, או דיווחו על יחסי עוצמת האות של המוצר ההיפרפולרי למצע מבלי לחשב את שיעורי פעילות האנזים בפועל 2,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. כאן, השתמשנו במוצר סלקטיבי רוויה-עירור גישה 15, המאפשרת ניטור של פעילות האנזים באופן ללא מודל15,16. בדרך זו נקבעו השיעורים האנזימטיים המוחלטים (כלומר, מספר השומות של המוצר המיוצר ליחידת זמן). 31 ספקטרוסקופיית P שימשה לצפייה באותות של פוספט אנאורגני (Pi), פוספוקריאטין (PCr) ואדנוזין טריפוספט (ATP). ניתוח רב-פרמטרי שימש לאפיון התפלגות ה- pH של הלב, כפי שהודגם על ידי השינוי הכימי ההטרוגני באות פאי של הרקמה.

לב העכבר המחורר לאחור (לב לנגנדורף) 17,18,19 הוא מודל אקס ויו ללב פועם שלם. במודל זה, כדאיות הלב וה- pH נשמרים לפחות 80 דקות20, והוא הראה פוטנציאל התאוששות לאחר פגיעה איסכמית ממושכת21,22. עם זאת, שונות לא מכוונת במהלך מיקרו-כירורגיה עלולה להוביל לשונות בכדאיות הרקמה בין הלבבות. מחקרים קודמים דיווחו על הידרדרות הלב הזה לאורך זמן19; לדוגמה, נצפתה ירידה בתפקוד ההתכווצות של 5%-10% לשעה18. האות אדנוזין טריפוספט (ATP) הוכח בעבר כמדווח על המצב האנרגטי של שריר הלב ועל הכדאיות23. כאן, ציינו כי הלב המחורר עשוי להראות מדי פעם שונות לא מכוונת ברמות הכדאיות, כפי שמודגם על ידי תוכן ATP, למרות העובדה שיש לנו זילוח רצוף ואספקת חמצן. אנו מראים כאן כי נרמול שיעורי LDH ו- PDH לתכולת ה- ATP של הלב מפחית את השונות בין הלב בשיעורים אלה.

בפרוטוקול הבא, אנו מתארים את ההליך הכירורגי המשמש לקנולציה של הלב, בידוד וזילוח כתוצאה מכך בספקטרומטר NMR. יש לציין כי גישות כירורגיות אחרות שמטרתן לבודד ולבלבל את לב העכבר תוארו לפני24,25.

כמו כן מתוארות המתודולוגיות המשמשות לרכישת נתונים הקשורים לקצב אנזימטי בלב הפועם (באמצעות ספקטרוסקופיה של 13 C ופירובט היפרפולרי [1-13C]) ויכולת הקיום והחומציות של הלב (באמצעות ספקטרוסקופיית NMR של 31P). לבסוף, מוסברות המתודולוגיות האנליטיות לקביעת פעילויות אנזימים מטבוליים וכדאיות וחומציות רקמות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

ועדת האתיקה המשותפת לאוניברסיטה העברית ולמרכז הרפואי הדסה אישרה את פרוטוקול המחקר לרווחת בעלי חיים (MD-19-15827-1).

1. הכנת חיץ קרבס-הנסלייט

  1. יום לפני הניסוי, הכינו גרסה שונה של חיץ קרבס-הנסלייט (KHB)26. בתחילה, יש להמיס 118 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 0.5 mM פירובט, 1.2 mM MgSO 4, 25 mM NaHCO3 ו-1.2 mM KH 2 PO4 בזיקוק כפול H2O.
  2. ערבבו תערובת זו עם 95%/5% O 2/CO 2 למשך 20 דקות, ולאחר מכן הוסיפו 1.2 mM CaCl2.
  3. כוונן את רמת החומציות של המאגר ל-7.4 עם HCl או NaOH.
  4. ביום הניסוי, הוסף גלוקוז 10 mM ואינסולין 72 U/L ל- KHB שהוכן בשלב 1.2.
    הערה: אינסולין מתווסף למאגר הזילוח כפי שתואר בעבודתם של Kolwicz et al.26 ובהסכמה עם מחקרים קודמים שדיווחו כי אינסולין מגביר את תפקוד ההתכווצות27 ואת עוצמת אות ההיפרפולריזציה [13C] ביקרבונט 28.

2. הכנת מערכת זילוח

  1. שמור מאגר של 200 מ"ל של KHB באמבט מים ב 40 ° C, ובועה עם 95% / 5% O 2 / CO2 בקצב זרימה של 4 L / min במשך 1 שעה לפני זילוח הלב. שמור על החיץ מבעבע ללא הרף עם תערובת גז זו לאורך כל הניסוי.
    1. ראשית, הגדר את אמבט המים ל -40 מעלות צלזיוס. הכנס את מאגר KHB. השתמש במשאבה פריסטלטית (ראה טבלת חומרים) ובצינורות מאריכים ברמה רפואית כדי למחזר את ה- KHB בין מאגר החיץ לצינור NMR 10 מ"מ בקצב זרימה קבוע של 7.5 מ"ל לדקה.
    2. חבר שלושה צינורות סיליקון מצופים פלטינה (3 מ"מ i.d.) למשאבה (צינור זרימה אחד ושני צינורות זרימה עבור חיץ KH). הכנס את קווי הזרימה והזרימה למאגר KH המחומם. לאחר מכן, הכנס את צינור החמצן למאגר KH המחומם.
    3. השתמש בקווי קטון אתר פוליאתר דק (PEEK, ראה טבלת חומרים) כדי שהמאגר והסוכן ההיפר-מקוטב יזרמו אל צינור ה-NMR וממנו בתוך משעמם הספקטרומטר.
  2. ודא כי הטמפרטורה נשמרת ב 37-37.5 מעלות צלזיוס. בצע את השלבים הבאים.
  3. עטפו את קו הזרימה (ממאגר החיץ לצינור ה-NMR) בסרט חימום המוגדר ל-42°C.
  4. חממו את צינור ה-NMR בתוך הספקטרומטר עם זרימת אוויר חמה המווסתת על ידי הספקטרומטר.
  5. השתמש בחיישן טמפרטורה תואם NMR (ראה טבלת חומרים) כדי למדוד את הטמפרטורה בתוך צינור NMR. הטמפרטורה מותאמת ל 37-37.5 מעלות צלזיוס.

3. כיול והכנת ספקטרומטר NMR לרכישה

  1. ביום הניסוי, הכניסו לספקטרומטר דגימה סטנדרטית של 13 C המכילה 1,4-דיוקסן (טבלת חומרים), וכוונו והתאימו את הגשושית NMR ל-13C. לאחר מכן, קבל ספקטרום המראה את אות שיווי המשקל התרמי של 1,4-דיוקסן עם זווית אגוז של 90°.
  2. כעת החליפו את הדגימה הסטנדרטית של 13C בדגימה סטנדרטית של 31 P (טבלת חומרים), המכילה 105 מילימטר של ATP ב-D2O. Tune והתאימו את הגשושית NMR ל-31P.
    הערה: ספקטרום המציג את אותות שיווי המשקל התרמי פוספט מתקבל עם זווית אגוז של 50°.
  3. הכנס את קו הזרימה, את קו הזרימה ואת בדיקת הטמפרטורה לתוך צינור NMR של 10 מ"מ, ולאחר מכן הכנס את הצינור לתוך השעמום המגנטי. כוונן את סרט החימום ל 42 ° C.
  4. רכשו ספקטרום NMR של 31 P של מאגר KH במחזור שישמש בניסוי זה למשך 30דקות, עם זווית אגוז של 50° ות"ר של 1.1 שניות (1,640 רכישות).

4. הכנת בעלי חיים, הליך כירורגי וזילוח הלב בצינור NMR

  1. הרדימו עכבר HSD:ICR (CD-1) זכר עם 3.3% איזופלורן באוויר החדר (טבלת חומרים) במהירות של 340 מ"ל/דקה למשך 5 דקות באמצעות מערכת הרדמת גז (Table of Materials) בתא אינדוקציה.
  2. השתמש בהרדמה מהאף לשמירה על הרדמה כללית עם 2.9% איזופלורן.
    הערה: יש להקפיד למזער את הכאב ואי הנוחות לבעל החיים.
  3. אבטח את הגפיים של החיה עם קלטת, להבטיח רפלקס כאב דוושה שלילי, ולאחר מכן להזריק 300 IU של נתרן הפרין intraperitoneally.
  4. יש להרטיב היטב את דופן בית החזה והבטן של העכבר עם 70% אלכוהול כדי להבטיח ניקיון ולמנוע זיהום שיער או חסימה במהלך ההליך הכירורגי.
  5. בדקה אחת לאחר הזרקת הפרין, לחתוך את העור ואת השריר של חלל הבטן עם מספריים קטנים.
  6. הניחו את מהדק היתוש הקטן בעל הלסת המעוקלת הנועל את המוסטט בין תהליך הקסיפואיד לבין עור החזה כדי להרים את החזה ולחשוף את הסרעפת. לנקב ולחתוך את האונה הימנית של הסרעפת.
  7. חותכים את החזה לאורך קו האמצע, נסוגים לצדדים ואז מסירים אותו.
  8. הזריקו לחדר השמאלי של הלב 200 IU של נתרן הפרין כדי למנוע קרישת דם. לאחר מכן, הזריקו 0.1 מ"ל של 0.5 mol/L KCl קר כקרח כדי להשיג דום לב, כפי שתואר קודם לכן25. דום לב הוא חיוני כדי להיות מסוגל cannulate הלב.
  9. זהו את בלוטת התימוס והוציאו אותה בעזרת מספריים כדי לחשוף את אבי העורקים. הסר רקמת כלוב צלעות שיורית.
  10. זהו את קשת אבי העורקים, והשתמשו במלקחיים מעוקלות כדי להניח קשר רופף עם תפר משי 3-0 (טבלת חומרים) סביב אבי העורקים העולה. הזריקו 3 מ"ל של KHB לחדר השמאלי כדי להסיר קרישי דם מאבי העורקים.
  11. השתמש במלקחיים מעוקלות כדי למשוך את הלב בצורה נחותה להדמיה טובה יותר של אבי העורקים העולה.
  12. ביצוע קנולציה באתרו עם צנתר תוך ורידי 22 G (טבלת חומרים). החל דבק cyanoacrylate באזור cannulated, ולאחר מכן לבצע קשירת תפר כפול. הזריקו חיץ KH נוסף ללב, וודאו שהוא זורם דרך צינור הקנולציה.
  13. הסר את המלקחיים המעוקלים. נתקו את הלב מהקרביים שמסביב, ונקבו אותו בנסיגה עם KHB קר כקרח (4 מעלות צלזיוס) דרך הצנתר התוך-ורידי.
  14. חבר את הלב לקו הזרימה של מערכת הזילוח באמצעות הצנתר התוך-ורידי. עם תחילת זילוח עם חיץ חם (37-37.5 מעלות צלזיוס) ב 7.5 מ"ל / דקה, הלב מתחיל לפעום באופן ספונטני.
  15. תקן את צינור ה- NMR עם הלב הפועם, קווי הזרימה ובדיקת הטמפרטורה, והכנס לבור הספקטרומטר, וודא שהלב נמצא במרכז בדיקת NMR.

5. רכישת נתונים עבור אנרגיית לב ו- pH

  1. רכוש ספקטרום של 31P למשך כשעה עם זווית היפוך של 50° ו- TR של 1.1 שניות.

6. קיטוב ופירוק ספין DNP

  1. הכינו נוסחה של 28.5 מ"ג של [1-13C]פירובט. נוסחה זו מורכבת מ 11.1 mM עד 14.0 mM OX063 רדיקל בחומצה מסודרת.
  2. מכינים 4 מ"ל של מדיום המסה. מדיום הפירוק מורכב ממאגר TRIS-פוספט, המכיל 11.2 mM NaH 2 PO 4, 38.8 mM Na 2 HPO4, 33 mM TRIS ו-2mM HCl. הרכב בינוני זה מותאם כך שעם תוספת של 28.5 מ"ג של [1-13C] פורמולציה של חומצה פירובית ל -4 מ"ל של חיץ זה (בשלב המסה), ה- pH של התמיסה המתקבלת יהיה 7.4.
  3. ביצוע קיטוב ספין ופירוק מהיר במכשיר קיטוב ספין dissolution-DNP (dDNP) בהתאם להוראות היצרן (Table of Materials). החל הקרנת מיקרוגל בתדר של 94.110 GHz לקיטוב של נוסחת חומצה פירובית [1-13C] ב- 1.45 K עד 1.55 K למשך כשעה וחצי.
  4. ערבב במהירות את 4 מ"ל של מדיום היפרפולרי מהתקן dDNP עם תמיסה מחומצנת היטב המשלימה את מדיום המסה היפרפולרית כדי לקבל הרכב התואם באופן הדוק את מדיום הזלוף.
    הערה: הנפח הסופי של התווך המנקב את הלב במהלך הזריקות ההיפרפולריות עם היפרפולריזציה של 14 מילימטר [1-13C]פירובט הוא 26 מ"ל. ההרכב הסופי של המדיום המוזרק (לאחר ערבוב) מכיל 4.7 mM KCl, 1.2 mM MgSO 4, 70 mM NaCl, 25 mM NaHCO3, 1.2 mM KH 2 PO4, 10 mM גלוקוז, 1.2 mM CaCl2, ו 72 U/L אינסולין.
  5. יש לתת את התווך המכיל פירובט היפרפולרי [1-13C] ללב המבודד באמצעות מערך זרימה רציפה29.
    הערה: זה נעשה כדי להבטיח כי זילוח הלב אינו מופרע בשום שלב במהלך הניסוי וכי התווך hyperpolarized מנוהל בקצב ידוע למשך זמן ידוע.

7. ספקטרוסקופיה היפרפולרית 13C

  1. קבל נתונים היפרפולריים של 13 C באמצעות פעימות עירור רוויה סלקטיביות של המוצר 15 על ידי הפעלת פולסי סינוס קרדינלי (Sinc) של 2.5 אלפיות השנייה, כפי שתואר קודם לכן15,16. לעורר באופן סלקטיבי [1-13C] לקטט ו [13 C] ביקרבונט ברציפות במרווחים של 6 שניות כדי לקבל מרווח של 12שניות עבור כל מטבוליט.
  2. עבור [1-13 C] זיהוי לקטט, מרכז את פולס Sinc סלקטיבי בתדר הידרט פירובט [1-13 C] (179.4 ppm), מה שמביא ליחס עוצמת אות (lac) של 0.113 עבור אותות C 1 של [1-13 C] פירובט ל [1-13C]לקטט.
  3. עבור [13 C] זיהוי ביקרבונט, מרכז את פולס Sinc סלקטיבי ב 157.7 ppm, שהוא 214 הרץ במורד השדה של אות [13C] ביקרבונט (161.1 ppm); התוצאה היא יחס עוצמת אות (BIC) של 0.139 עבור אות C 1 של [1-13C]פירובט ל [13C]ביקרבונט.

8. קביעת המשקל והנפח הרטוב של הרקמה

  1. בסוף הניסוי מנתקים את הלב ממערכת הזלוף, ומייבשים אותו בעדינות עם נייר טישו. לאחר מכן, לשקול את הלב כדי לקבל את הרקמה משקל רטוב.
  2. קבע את נפח הלב באמצעות מקדם צפיפות של 1.05 גרם לסמ"ק3, כפי שנקבע קודם לכן עבור לב העכבר30.

9. כימות תוכן ATP

  1. שלב את אות ה-γ-ATP של רכישה יחידה של דגימת תקן ATP ורכישה של 30 דקות (TR של 1.1 שניות ו-1,640 רכישות) של הלב המבודד.
  2. לכמת את תכולת ה- ATP של הלב על ידי השוואת האינטגרל של אות γ-ATP של הלב לזה של התקן (טבלה של חומרים), שבו האחרון יש ריכוז ידוע (105 mM), ונכון עבור מספר רכישות והשפעות הרפיה.

10. פתרון אות פאי של הלב

הערה: על מנת להעריך את רמת החומציות של הרקמה, ראשית יש צורך להפריד בין אות ה-Pi של הלב לזה של אות ה-Pi הכולל (Pit). זה נעשה על ידי השמטת האות של KHB Pi (PiKH) מזה של Pit.

  1. בספקטרום של 31 P שלKHB שמראה אות Pi יחיד (Pi KH, איור 1A), התאימו את אות PiKH לפונקציה לורנציאנית באמצעות Excel (רשימת חומרים).
  2. הנפח הנראה לבדיקת NMR (Vp, 1.375 מ"ל), מכיל יותר KHB כאשר צינור הדגימה אינו מכיל את הלב. כדי לתקן אפקט מילוי זה, חשב את אות המאגר המוחלש (Pib) באמצעות Eq. 1A.
    figure-protocol-1Eq. 1A
    כאשר Vh הוא נפח הלב, כפי שנקבע בשלב 8.
  3. החסרו את האות הזה מה-Pit לפי Eq. 1B כדי לקבל את אות ה-Pi שנובע אך ורק מהלב המחורר (Pih, איור 1B).
    figure-protocol-2Eq. 1B

11. ניתוח pH רב-פרמטרי

  1. בצע את ההמרה של התפלגות השינוי הכימי של אות Pih ל- pH תוך התייחסות לשינוי הכימי של PCr באמצעות Eq. 231.
    figure-protocol-3פרק 2
    כאשר Δδ הוא הפרש ההסטה הכימית, pKa הוא 6.72, בסיס חופשי δ הוא 5.69, וחומצה חופשית δ היא 3.27, כפי שתואר קודם לכן31.
  2. תקן את עקומת התפלגות ה- pH המתקבלת עבור אי-ליניאריות בין סולם ההסטה הכימית Pih לבין סולם ה- pH על פי Lutz et al.32. התפלגות pH טיפוסית הנובעת מחישוב זה מוצגת באיור 1C.
  3. לנתח את התפלגות ה- pH של הרקמה בגישה רב-פרמטרית תוך שימוש בשבעה פרמטרים סטטיסטיים בעקבות עבודתם של לוץ ואחרים. 32. ארבעה פרמטרים אלה מוצגים כאן כפי שהם נראים התיאוריים ביותר של pH רקמה: 1) pH מרבי גלובלי; 2) pH ממוצע משוקלל; 3) pH חציוני משוקלל; ו-4) הטיה של חלקת ה-pH (איור 1C).

12. חישוב פעילויות LDH ו- PDH

הערה: קצבי הייצור של מטבוליטים היפרפולריים [1-13C]לקטט ו-[13C] ביקרבונט משמשים לחישוב פעילויות LDH ו-PDH, בהתאמה. בגישת עירור רוויה סלקטיביתשל המוצר 15, רק מטבוליטים היפרפולריים מסונתזים חדשים מזוהים על ידי כל עירור סלקטיבי.

  1. השתמש באות פירובט היפרפולרי [1-13C] כהפניה כדי לקבוע את רמת ייצור המטבוליטים המתאימה.
    1. במהלך הזילוח עם התווך ההיפרפולרי, ריכוז הפירובט [1-13 C] בצינור NMR עולה (שטיפה), לאחר מכן מישורי (בריכוז מקסימלי של 14מילימול), ולאחר מכן יורד (שטיפה).
    2. כדי לזהות את נקודות הזמן שבהן ריכוז הפירובט הגיע לרמה קבועה (מישור), תקן את אות הפירובט [1-13C] לדעיכת אות כתוצאה מהרפיה T1 ופעימת RF באמצעות קבוע ההרפיה היעיל, Teff.
    3. עבור כל הזרקה, הגדר אתT eff בהתבסס על יכולתו לתקן את עקומת הדעיכה [1-13C] פירובט כדי להראות את דינמיקת הזרימה הזו (Eq.3).
      figure-protocol-4Eq. 3
      כאשר figure-protocol-5 הוא אות [1-13 C]pyruvate שנרכש במהלך רכישת [13C]bicarbonate. Teff הממוצע בניסויים המתוארים כאן נמצא 35.8 שניות ± 2.3 שניות (n = 5 לבבות).
    4. בחר את נקודות הנתונים שבהן הריכוז הוא בתוך 10% מהאות המרבי המתוקן [1-13C] פירובט לניתוח נוסף.
  2. השתמש בנתונים המתאימים של [1-13 C]לקטט ו[13C] ייצור ביקרבונט עבור נקודות הזמן שנבחרו בשלב 12.1לחישוב קצבי ייצור המטבוליטים באמצעות Eq. 4A ו- Eq. 4B, בתנאי שה- SNR של אות המטבוליט גדול מ- 2 (סף לניתוח). דוגמה טיפוסית לבחירה כזו של נקודות זמן מוצגת באיור 2B (חלון זמן מודגש).
  3. חשב את קצבי הייצור של כל אחת מנקודות הנתונים שנבחרו באמצעות Eq. 4A ו- Eq. 4B:
    figure-protocol-6Eq. 4A
    figure-protocol-7Eq. 4B
    כאשר figure-protocol-8 וfigure-protocol-9- הם קצבי הייצור של [1-13 C]לקטט או [13 C] ביקרבונט בכל נקודת זמן, בהתאמה. והם figure-protocol-10 גורמים המייצגים את העירור היחסי של [1-13 C]פירובט והמוצרים [1-13C]לקטט או [13C]ביקרבונט, בהתאמה.figure-protocol-11 גורמים אלה נקבעו בעבר כ-0.113 ו-0.139, בהתאמה29. V p הוא הנפח שמזוהה על ידי בדיקת NMR (1.375 מ"ל), TR מציין את מרווח הזמן בין שני עירורים רוויים סלקטיביים עוקבים של מוצרים (12 שניות לכל מוצר), figure-protocol-12 והם האותות של [1-13 C]לקטט ו[13 C]ביקרבונט, בהתאמה, והם figure-protocol-13 figure-protocol-14 figure-protocol-15 האותות של [1-13 C]פירובט שנרכשו במהלך [1-13C]לקטט ו [13C] C]עירור ביקרבונט, בהתאמה. [Pyr] הוא ריכוז [1-13 C]pyruvate, שהיה 14mM בשלב הרמה.
    1. קבע את הקצב עבור כל נקודה ולאחר מכן ממוצע לכל זריקה היפרפולרית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ספקטרום 31P שתועד מלב עכבר מחורר עם KHB ומהמאגר לבדו מוצג באיור 1A. האותות של α-, β-, ו-γ-ATP, PCr ו-Pi נצפו בלב. אות ה-Pi היה מורכב משני מרכיבים עיקריים: בשדה הגבוה יותר (הצד השמאלי של האות), אות ה-Pi נבע בעיקר מה-KHB ב-pH של 7.4; בשדה התחתון (הצד הימני של האות), אות ה-Pi היה רחב יותר ופחות הומוגני בשל הסביבה החומצית יותר. הדפוס האחרון נובע מרקמת הלב. אות ה-Pi של רקמת הלב מופק על-ידי חיסור אות ה-Pi של ה-KHB (איור 1B), ולאחר מכן מומר מסולם ppm לסולם ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אנו מדגימים מערך ניסויי שנועד לחקור מטבוליזם היפרפולרי [1-13C] פירובט, אנרגטיקה של רקמות ו- pH במודל לב עכבר מבודד.

השלבים הקריטיים בפרוטוקול הם כדלקמן: 1) להבטיח כי ה- pH של המאגר הוא 7.4; 2) לוודא שכל רכיבי המאגר כלולים; 3) הימנעות קרישת דם בכלי הלב על ידי זריקות הפרין; 4) הימנעות מנזק איסכמי ללב על ידי הפחתת הפעילות המטבולית (הזרקת KCl וחיץ קר כקרח); 5) הימנעות מהכנסת בועות אוויר ללב בכל שלב של ההליך; 6) אימות קנולציה מוצלחת של אבי העורקים על ידי צבע הרקמה, המשתנה מאדום כהה לוורו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין גילויים.

תודות

פרויקט זה קיבל מימון מהקרן הלאומית למדע במסגרת הסכם מענק מס' 1379/18; מלגת ז'בוטינסקי של משרד המדע והטכנולוגיה למדעים יישומיים והנדסיים לדוקטורנטים ישירים מס' 3-15892 לד"ש; ותוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם מענק מס' 858149 (AlternativesToGd).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ציוד
HyperSense DNP PolariserOxford Instruments52-ZNP91000HyperSense, 3.35 T, ספקטרומטר NMR של היפרפולרייזר פרה-DNP
 RS2D, 5.8 T, מצוידת במשאבה פריסטלטית בפס רחב 10 מ"מ
 Cole-Parmer07554-95
בדיקת טמפרטורהOsensaFTX-100-LUX+NMR בדיקת טמפרטורה תואמת
Somnosuite מערכת הרדמה בזרימה נמוכהKent Scientific
קווים, צינורות, תפרים
צינורות סיליקון מרפאים פלטינוםCole-ParmerHV-96119-16L/S 16 I.D. 3.1 מ"מ&. נ.ב.פ;
קווי פוליאתר אתר קטון דקים (PEEK) UpchurchScientificid. 0.040 אינץ'
קטטר תוך ורידי BD Medical38132322 גרם
תפר משיEthiconW577Hקוטר חוט של 3-0
<חזק>כימיקלים ותרופות
[1-13C] חומצה פירוביתמעבדות איזוטופ קיימברידג'CLM-8077-1
סידן כלוריסיגמא-אולדריץ'21074CAS: 10043-52-4
D-(+)-גלוקוזסיגמא-אולדריץ'G7528CAS: 50-99-77
הפרין נתרןרוטקסמדיקהHEP5A0130C0160
חומצה הידרוכלורית 37%סיגמא-אולדריץ'258148CAS: 7647-01-0
אינסולין אספרט (NovoLog)נובו נורדיסק
איזופלורןטרל
מגנזיום סולפטסיגמא-אולדריץ'793612CAS: 7487-88-9
אשלגן כלוריסיגמא-אולדריץ'P4504CAS: 7447-40-7
אשלגן פוספט מונו-בסיסיסיגמא-אולדריץ'P9791CAS: 7778-77-0
נתרן ביקרבונטקבוצתCAS: 144-55-8
נתרן כלוריסיגמא-אולדריץ'S9625CAS: 7647-14-5
נתרן הידרוקסידסיגמא-אולדריץ'655104CAS: 1310-73-2
נתרן פוספט דו-בסיסיסיגמא-אולדריץ'S7907CAS: 7558-79-4
נתרן פוספט מונו-בסיסי דיהידראטMerck6345CAS: 13472-35-0
TRIS (דרגת ביוטכנולוגיה)אמרסקו0826CAS: 77-86-1
טריטיל רדיקל OX063GE Healthcare ASNC100136OX063
<תקני >NMR חזקים
13C מדגם סטנדרטימעבדות איזוטופ קיימברידג'DLM-72A40% p-dioxane בדגימה סטנדרטית של בנזן-D6
31P מיוצרבבית105 מ"מ ATP ו-120 מ"מ חומצה פנילפוספונית ב-D2O
תוכנה
Excel 2016Microsoft
MNovaמחקר
קוביית תמ"ג גדות Mestrelab

מקורות

  1. Aquaro, G. D., Menichetti, L. Hyperpolarized 13C-magnetic resonance spectroscopy: Are we ready for metabolic imaging. Circulation. Cardiovascular Imaging. 7 (6), 854-856 (2014).
  2. Schroeder, M. A., et al. Real-time assessment of Krebs cycle metabolism using hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy. FASEB Journal. 23 (8), 2529-2538 (2009).
  3. Ardenkjaer-Larsen, J. H., et al. Increase in signal-to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-state NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (18), 10158-10163 (2003).
  4. Merritt, M. E., et al. Hyperpolarized C-13 allows a direct measure of flux through a single enzyme-catalyzed step by NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (50), 19773-19777 (2007).
  5. Ball, D. R., et al. Hyperpolarized butyrate: A metabolic probe of short chain fatty acid metabolism in the heart. Magn Reson Med. (5), 1663-1669 (2014).
  6. Khemtong, C., Carpenter, N. R., Lumata, L. L., et al. Hyperpolarized 13C NMR detects rapid drug-induced changes in cardiac metabolism. Magnetic Resonance in Medicine. 74 (2), 312-319 (2015).
  7. Mariotti, E., et al. Modeling non-linear kinetics of hyperpolarized [1-13C] pyruvate in the crystalloid-perfused rat heart. NMR in Biomedicine. 29 (4), 377-386 (2016).
  8. Moreno, K. X., Sabelhaus, S. M., Merritt, M. E., Sherry, A. D., Malloy, C. R. Competition of pyruvate with physiological substrates for oxidation by the heart: implications for studies with hyperpolarized [1-13C]pyruvate. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (5), H1556-H1564 (2010).
  9. Purmal, C., et al. Propionate stimulates pyruvate oxidation in the presence of acetate. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 307 (8), H1134-H1141 (2014).
  10. Weiss, K., et al. Developing hyperpolarized 13C spectroscopy and imaging for metabolic studies in the isolated perfused rat heart. Applied Magnetic Resonance. 43 (1), 275-288 (2012).
  11. Merritt, M. E., Harrison, C., Storey, C., Sherry, A. D., Malloy, C. R. Inhibition of carbohydrate oxidation during the first minute of reperfusion after brief ischemia: NMR detection of hyperpolarized 13CO2and H13CO3. Magnetic Resonance in Medicine. 60 (5), 1029-1036 (2008).
  12. Schroeder, M. A., et al. Measuring intracellular pH in the heart using hyperpolarized carbon dioxide and bicarbonate: a 13C and 31P magnetic resonance spectroscopy study. Cardiovascular Research. 86 (1), 82-91 (2010).
  13. Ball, D. R., et al. Metabolic imaging of acute and chronic infarction in the perfused rat heart using hyperpolarised [1-13C]pyruvate. NMR in Biomedicine. 26 (11), 1441-1450 (2013).
  14. Atherton, H. J., et al. Role of PDH inhibition in the development of hypertrophy in the hyperthyroid rat heart: a combined magnetic resonance imaging and hyperpolarized magnetic resonance spectroscopy study. Circulation. 123 (22), 2552-2561 (2011).
  15. Harris, T., et al. Hyperpolarized product selective saturating-excitations for determination of changes in metabolic reaction rates in real-time. NMR in Biomedicine. 33 (2), e4189(2020).
  16. Shaul, D., et al. Correlation between lactate dehydrogenase/pyruvate dehydrogenase activities ratio and tissue pH in the perfused mouse heart: A potential noninvasive indicator of cardiac pH provided by hyperpolarized magnetic resonance. NMR in Biomedicine. 34 (2), e4444(2021).
  17. Jian, Z., et al. In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models. PLoS One. 11 (8), e0160605(2016).
  18. Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
  19. Lateef, R., Al-Masri, A., Alyahya, A. Langendorff's isolated perfused rat heart technique: A review. International Journal of Basic and Clinical Pharmacology. 4, 1314-1322 (2015).
  20. Cross, H. R., Radda, G. K., Clarke, K. The role of Na+/K+ ATPase activity during low-flow ischemia in preventing myocardial injury - A 31P, 23Na and 87Rb NMR spectroscopic study. Magnetic Resonance in Medicine. 34 (5), 673-685 (1995).
  21. Cross, H. R., Clarke, K., Opie, L. H., Radda, G. K. Is lactate-induced myocardial ischaemic injury mediated by decreased pH or increased intracellular lactate. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 27 (7), 1369-1381 (1995).
  22. Clarke, K., O'Connor, A. J., Willis, R. J. Temporal relation between energy metabolism and myocardial function during ischemia and reperfusion. American Journal of Physiology. 253 (2), H412-H421 (1987).
  23. Yabe, T., Mitsunami, K., Inubushi, T., Kinoshita, M. Quantitative measurements of cardiac phosphorus metabolites in coronary artery disease by 31P magnetic resonance spectroscopy. Circulation. 92 (1), 15-23 (1995).
  24. Bakrania, B., Granger, J. P., Harmancey, R. Methods for the determination of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. Journal of Visualized Experiments. (115), e54497(2016).
  25. Cordeiro, B., Clements, R. Murine isolated heart model of myocardial stunning associated with cardioplegic arrest. Journal of Visualized Experiments. (102), e52433(2015).
  26. Kolwicz, S. C., Tian, R. Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (42), e2069(2010).
  27. Nakadate, Y., et al. Glycemia and the cardioprotective effects of insulin pre-conditioning in the isolated rat heart. Cardiovascular Diabetology. 16 (1), 43(2017).
  28. Lauritzen, M. H., et al. Enhancing the C-13 bicarbonate signal in cardiac hyperpolarized 1-C-13 pyruvate MRS studies by infusion of glucose, insulin and potassium. NMR in Biomedicine. 26 (11), 1496-1500 (2013).
  29. Adler-Levy, Y., et al. In-cell determination of lactate dehydrogenase activity in a luminal breast cancer model - ex vivo investigation of excised xenograft tumor slices using dDNP hyperpolarized [1-13C]pyruvate. Sensors. 19 (9), 2089(2019).
  30. Young, A. A., Barnes, H., Davison, D., Neubauer, S., Schneider, J. E. Fast left ventricular mass and volume assessment in mice with three-dimensional guide-point modeling. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 30 (3), 514-520 (2009).
  31. Bailey, I. A., Williams, S. R., Radda, G. K., Gadian, D. G. Activity of phosphorylase in total global ischaemia in the rat heart. A phosphorus-31 nuclear-magnetic-resonance study. Biochemical Journal. 196 (1), 171-178 (1981).
  32. Lutz, N. W., Le Fur, Y., Chiche, J., Pouyssegur, J., Cozzone, P. J. Quantitative in vivo characterization of intracellular and extracellular pH profiles in heterogeneous tumors: A novel method enabling multiparametric pH analysis. Cancer Research. 7 (15), 4616-4628 (2013).
  33. Harris, T., Gamliel, A., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. Impurities of [1-13C]pyruvic acid and a method to minimize their signals for hyperpolarized pyruvate metabolism studies. Applied Magnetic Resonance. 49 (10), 1085-1098 (2018).
  34. Cunningham, C. H., et al. Hyperpolarized 13C metabolic MRI of the human heart initial experience. Circulation Research. 119 (11), 1177-1182 (2016).
  35. Kurhanewicz, J., et al. Hyperpolarized 13C MRI: Path to clinical translation in oncology. Neoplasia. 21 (1), 1-16 (2019).
  36. Miloushev, V. Z., et al. Metabolic imaging of the human brain with hyperpolarized 13C pyruvate demonstrates 13C lactate production in brain tumor patients. Cancer Research. 78 (14), 3755-3760 (2018).
  37. Park, I., et al. Development of methods and feasibility of using hyperpolarized carbon-13 imaging data for evaluating brain metabolism in patient studies. Magnetic Resonance in Medicine. 80 (3), 864-873 (2018).
  38. Grist, J. T., et al. Quantifying normal human brain metabolism using hyperpolarized [1-13C]pyruvate and magnetic resonance imaging. Neuroimage. 189, 171-179 (2019).
  39. Nelson, S. J., et al. Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-C]pyruvate. Science Translational Medicine. 5 (198), (2013).
  40. Stødkilde-Jørgensen, H., et al. Pilot study experiences with hyperpolarized [1-13C]pyruvate MRI in pancreatic cancer patients. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 51 (3), 961-963 (2019).
  41. Autry, A. W., et al. Measuring tumor metabolism in pediatric diffuse intrinsic pontine glioma using hyperpolarized carbon-13 MR metabolic imaging. Contrast Media and Molecular Imaging. 2018, 3215658(2018).
  42. Chung, B. T., et al. First hyperpolarized [2-13C]pyruvate MR studies of human brain metabolism. Journal of Magnetic Resonance. 309, 106617(2019).
  43. Rider, O. J., et al. Noninvasive in vivo assessment of cardiac metabolism in the healthy and diabetic human heart using hyperpolarized 13C MRI. Circulation Research. 126 (6), 725-736 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

פירובאט בהיפר-פולריזציהספקטרוסקופיה של פחמן 13ספקטרוסקופיה של זרחן 31מטבוליזם של פירובאטלקטט דהידרוגנאזפירובאט דהידרוגנאזאנרגטיקה לבבית
חקירת חילוף החומרים הלבבי בלב עכבר מבודד עם היפרפולריזציה [1-13C] פירובט וספקטרוסקופיית NMR 13C/31P
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.