הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

סינתזה של מסארימיצין, מעכב מולקולה קטנה של צמיחת חיידקים גראם חיובית

1.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63191

⸱

7 בינואר 2022

 ,  , 
1Department of Science and Technology, Bryant University, 2Center for Health and Behavioral Sciences, Bryant University

במאמר זה

סיכום

מוצג פרוטוקול מפורט להכנת הבקטריוסטטי דיאמיד מסארימיצין, בדיקה של מולקולה קטנה המעכבת את צמיחתם של Bacillus subtilis ודלקת ריאות סטרפטוקוקוס על ידי התמקדות בהתדרדרות דופן התא. היישום שלה כבדיקה כימית מודגם במבחני סינרגיה/אנטגוניזם ובמחקרים מורפולוגיים עם B. subtilis ו-S. pneumoniae.

תקציר

פפטידוגליקן (PG) בדופן התא של החיידקים הוא מבנה מקרומולקולרי ייחודי המקנה צורה, והגנה מפני הסביבה. מרכיב מרכזי בהבנת הצמיחה והחלוקה של התאים הוא הידע על האופן שבו פירוק PG משפיע על הביוסינתזה ועל הרכבת דופן התא. לאחרונה דווח על תיוג מטבולי של PG באמצעות הכנסת סוכרים מותאמים או חומצות אמינו. בעוד שחקירה כימית של צעדים ביו-סינטטיים עם מעכבי מולקולות קטנות אפשרית, כלים לביולוגיה כימית לחקר השפלת PG על ידי אוטוליזינים אינם מפותחים מספיק. אוטוליזינים חיידקיים הם סוג רחב של אנזימים המעורבים בפירוק מתואם היטב של PG. כאן מוצג פרוטוקול מפורט להכנת גשושית מולקולה קטנה, masarimycin, שהיא מעכבת של N-אצטיל-גלוקוסאמינידאז LytG ב-Bacillus subtilis, ומטבוליזם של דופן התא בסטרפטוקוקוס דלקת ריאות. הכנת המעכב באמצעות סינתזה אורגנית בסיוע מיקרוגל וקלאסית מסופקת. תחולתו ככלי לחקר פיזיולוגיה גראם-חיובית במבחנים ביולוגיים מוצגת.

מבוא

פפטידוגליקן (PG) הוא פולימר דמוי רשת התוחם את צורת ומבנה התא הן בחיידק גראם חיובי והן בחיידק גראם-שלילי 1,2. הטרופולימר זה הוא מטריצה של סוכרים אמיניים המקושרים על ידי פפטידים קצרים 3,4,5,6 עם עמוד שדרה המורכב משאריות N-אצטילגלוקוסאמין (GlcNAc) ו-N-אצטילמוראמית (MurNAc) המקושרות β(1,4) הקשורות לסירוגין (איור 1)1. מחובר ל-C-3 לקטיל מואטי של MurNAc הוא פפטיד הגבעול. חילוף החומרים של PG כולל מערכת מתואמת היטב של אנזימים ביוסינטטיים ומשפילים כדי לשלב חומר חדש בדופן התא 7,8. השפלה של PG מתבצעת על ידי אנזימים המכונים באופן קולקטיבי אוטוליזינים9 ומסווגים עוד יותר על סמך הספציפיות של הקשר שנבקע. אוטוליסינים משתתפים בתהליכים תאיים רבים, כולל גדילת תאים, חלוקת תאים, תנועתיות, התבגרות PG, כימוטקסיס, הפרשת חלבונים, יכולת גנטית, התמיינות ופתוגניות10,11. חשיפת הפונקציות הביולוגיות הספציפיות של אוטוליזינים בודדים יכולה להיות מרתיעה, בין השאר בשל יתירות תפקודית. עם זאת, מחקרים ביופיזיים אחרונים 8,12,13 ומחקרים חישוביים12 סיפקו תובנות חדשות על תפקידם בחילוף החומרים של PG. בנוסף, הדו"חות האחרונים סיפקו תובנה נוספת לגבי סינתזה14 ו-15,16,17 שלבים בתיווך ממברנה בחילוף החומרים של PG. הבנה מעמיקה של הקשר בין מסלולים מתכלים וסינתטיים של חילוף החומרים של PG עשויה להוליד מטרות אנטיביוטיות שלא נוצלו בעבר.

אמנם חלה התקדמות משמעותית במתודולוגיה לחקר הגליקוביולוגיה באאוקריוטים, אבל הגליקוביולוגיה החיידקית, ובמיוחד, חילוף החומרים של PG לא התקדם בקצב דומה. הגישות הכימיות הנוכחיות לחקר חילוף החומרים של PG כוללות אנטיביוטיקה מסומנת פלואורסצנטית18, בדיקות פלואורסצנטיות19,20, ותיווג מטבולי 21,22,23,24. גישות חדשות אלה מספקות דרכים חדשות לחקור את חילוף החומרים של דופן תאי החיידקים. בעוד שחלק מהאסטרטגיות הללו מסוגלות לתייג PG in vivo, הן יכולות להיות ספציפיות למין19, או לעבוד רק בזנים שחסרים להם אוטוליזיןמסוים 25. אסטרטגיות תיוג PG רבות מיועדות לשימוש עם דפנות תא מבודדות26 או עם מסלולי ביוסינתזה של PG משוחזרים במבחנה 20,27,28. השימוש באנטיביוטיקה עם תווית פלואורסצנטית מוגבל כיום לצעדים ביו-סינטטיים ולטרנספטידציה18.

הידע הנוכחי על אוטוליזינים חיידקיים ותפקידם בחילוף החומרים של דופן התא מגיע מניתוח ביוכימי גנטי ובמבחנה 11,29,30,31,32. בעוד שגישות אלה סיפקו שפע של מידע על סוג חשוב זה של אנזימים, פענוח תפקידם הביולוגי יכול להיות מאתגר. לדוגמה, בשל יתירות תפקודית33, מחיקה של אוטוליזין ברוב המקרים אינה גורמת לעצירת צמיחת החיידקים. זאת למרות תפקידם המרומז בצמיחת התאיםובחלוקתם 7,12. סיבוך נוסף הוא שמחיקה גנטית של אוטוליזין חיידקי יכולה להוליד מטא-פנוטיפים34. מטא-פנוטיפים נובעים מיחסי הגומלין המורכבים בין המסלול המושפע מהמחיקה הגנטית לבין מסלולים מקושרים אחרים. לדוגמה, מטא-פנוטיפ יכול להיווצר באמצעות השפעה ישירה כגון היעדר אנזים, או השפעה עקיפה כגון הפרעה של הרגולטורים.

נכון לעכשיו, ישנם רק כמה מעכבים של גליקוזידאז אוטוליזינים כגון N-אצטילגלוקוסאמינידס (GlcNAcase) ו- N-acetylmuramidases, אשר יכולים לשמש כבדיקות כימיות כדי לחקור את הפירוק של PG. כדי להתמודד עם זה, הדימיד מסארימיצין (שנקרא בעבר fgkc) זוהה ואופיין35 כמעכב בקטריוסטטי של צמיחת Bacillus subtilis המכוון ל-GlcNAcase LytG32 (איור 1). LytG הוא GlcNAcase36 בעל משחק אקסו-אקטיבי, חבר באשכול 2 במשפחת ההידרולאזים הגליקוזיליים 73 (GH73). זהו ה-GlcNAcase הפעיל העיקרי במהלך צמיחה וגטטיבית32. למיטב ידיעתנו, מסארימיצין הוא המעכב הראשון של GlcNAcase הפועל על ידי PG ומעכב את צמיחת התאים. מחקרים נוספים על מסרימיצין עם דלקת ריאות סטרפטוקוקוס מצאו כי מסרימיצין ככל הנראה מעכב את חילוף החומרים של דופן התא באורגניזם זה37. כאן, ההכנה של masarimycin מדווח לשימוש כבדיקה ביולוגיה כימית כדי לחקור פיזיולוגיה באורגניזמים גראם חיוביים B. subtilis, ו S. pneumoniae. דוגמאות לניתוח מורפולוגי של טיפול בריכוז מעכב תת-מינימלי עם מסרימיצין, כמו גם בדיקת סינרגיה/אנטגוניזם מוצגות. מבחני סינרגיה ואנטגוניזם באמצעות אנטיביוטיקה עם דרכי פעולה מוגדרות היטב יכולים להיות דרך שימושית לחקור קשרים בין תהליכים תאיים 38,39,40.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. שיטות כלליות

הערה: כל התרכובות נרכשו מספקים סטנדרטיים ושימשו ללא טיהור נוסף.

  1. בצע כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) על לוח אלומיניום מצופה מראש בג'ל סיליקה XG F254. זהה כתמים מתחת למנורת UV, על ידי טבילה בכתם p-anisaldehyde, או על ידי חשיפה לאדים I2.
  2. הקלט את כל ספקטרום התהודה המגנטית הגרעינית (NMR) בספקטרומטר של 400 מגה-הרץ.
    הערה: 1H- NMR ו-13ספקטרום C-NMR הוזכרו לפסגות ממס שיוריות. קבועי צימוד ניתנים ב-[Hz] ותזוזות כימיות ב-[ppm].
  3. שיא יינון כימי בלחץ אטמוספרי (APCI) ספקטרומטריית מסה ספקטרום של מסארימיצין על ספקטרומטר מסה קומפקטי המצויד בגשושית ניתוח מוצקים אטמוספרית.

2. הליך כללי להכנת מסארימיצין

הערה: בצע את השלבים הבאים במכסה אדים.

  1. הכן תמיסה של 0.1 M במתנול של כל מגיב: ציקלוהקסילאמין, ציקלוהקסיל קרבוקסלדהיד, חומצה o-יודובנזואית וציקלוהקסיל איזוציאניד35.
    אזהרה: ציקלוהקסילאמין, ציקלוהקסיל איזוציאניד וציקלוהקסיל קרבוקסלדהיד הם דליקים. הם יכולים לגרום לקורוזיה בעור ולגרום לרעילות דרך הפה, העור, הנשימה או הרבייה. הרחיקו תרכובות מלהבות פתוחות, משטחים חמים ומקורות הצתה. ללבוש עור מתאים והגנה על העיניים, לעבוד באזור מאוורר היטב ולמנוע שאיפה של אדים או ערפל. לאחסון, השאירו את הבקבוקים סגורים היטב ואחסנו אותם במקום קריר ויבש. אחסן ציקלוהקסיל קרבוקסלדהיד במייבש תחת אטמוספירה N2 .
  2. יש לערבב 5 מ"ל של ציקלוהקסילאמין (תמיסת 0.1 M במתנול) ו-5 מ"ל של ציקלוהקסיל קרבוקסלדהיד (0.1 מ' במתנול) בבקבוקון תחתון עגול מכוסה ולערבב את התמיסה באמצעות מוט ערבוב מגנטי על פלטה חמה/ערבוב למשך 30 דקות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס באמבטיית חול. עקוב אחר הטמפרטורה באמצעות מדחום הממוקם כ -1 ס"מ מתחת לפני החול.
  3. לאחר 30 דקות, הוסיפו 5 מ"ל של ציקלוהקסיל איזוציאניד (תמיסת 0.1 מטר במתנול) לתמיסה משלב 2.2 וערבבו במשך 20 דקות נוספות בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס. לבסוף, מוסיפים 5 מ"ל של חומצה o-יודובנזואית (תמיסת 0.1 M במתנול) לתערובת התגובה וממשיכים לערבב בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך 3-5 שעות.
  4. עקוב אחר התקדמות התגובה מעת לעת על ידי TLC בערך כל שעה לאחר שתערובת התגובה הנ"ל התערבבה במשך 3 שעות.
  5. חתכו רצועה בגודל 3 ס"מ על 6 ס"מ של צלחת TLC מגובה אלומיניום. באמצעות עיפרון #2, ציירו קו כ-1 ס"מ מלמטה. באמצעות מיקרו-קפילר מזכוכית, יש לזהות כ-5 μL של תערובת התגובה על צלחת ה-TLC ולאפשר לה להתייבש.
  6. לכוס של 150 מ"ל, הוסיפו מספיק פאזה ניידת (הקסאן 90:10: איזופרופנול) כדי לכסות את החלק התחתון של הכוס. באמצעות זוג פינצטה, הניחו בזהירות את צלחת ה-TLC הנ"ל לתוך הכוס, כדי להבטיח שצלחת ה-TLC תיכנס לפאזה הניידת באופן שווה. מכסים את החלק העליון של הכוס בחתיכת פח.
    הערה: ודא שהפאזה הניידת אינה מכסה את הקו ואת הדגימה המנוקדת.
  7. אפשרו לפאזה הניידת לנוע במעלה צלחת ה-TLC עד שהיא תהיה כ-1 ס"מ מתחת לחלק העליון של הצלחת. הסר את לוחית ה- TLC ובאמצעות עיפרון, צייר קו המציין את המרחק שעובר השלב הנייד. אפשרו לצלחת ה-TLC להתייבש במכסה אדים.
  8. לאחר הייבוש, מניחים את צלחת ה-TLC בכוס המכילה כמות קטנה של מוצק I2 ומכסים את הכוס בחתיכת רדיד פח. עקוב אחר ה- TLC לפיתוח כתמים צהובים/חומים. לאחר הפיתוח, הסר את לוחית ה- TLC וסמן את מיקום הכתמים באמצעות עיפרון (איור משלים 1).
    הערה: אם אני2 כתמים לא מסומנים, הכתם יתפוגג עם הזמן. ניתן גם לדמיין כתמים על צלחת ה-TLC על ידי אור UV, צביעת p-anisaldehyde או צביעת אשלגן פרמנגנט (ראו מידע משלים).
  9. חישוב ערכי Rf עבור כל הכתמים המוצגים באופן חזותי באמצעות הנוסחה הבאה:
    Rf = figure-protocol-1
  10. שקול את התגובה שלמה כאשר רק נקודה אחת עם Rf = 0.3 נראית על לוח TLC. הסר את הממס במאייד מסתובב בלחץ מופחת ויבש את המוצר הגולמי (המתקבל כשמן חום-צהבהב) תחת ואקום גבוה עד שכל המתנול מתאדה.
  11. ממיסים את המוצר הגולמי המיובש ב-30 מ"ל של אתיל אצטט ומעבירים אותו למשפך מפריד. חלץ אתיל אצטט ברצף עם 1 M HCl (2 x 30 מ"ל), H2O (30 מ"ל), תמיסת NaHCO3 רוויה (2 x 30 מ"ל), H2O (30 מ"ל) ותמיסת NaCl רוויה (2 x 30 מ"ל). יש להשליך את השכבות המיימיות.
    הערה: שכבת האתיל אצטט היא השכבה העליונה בכל אחת מהעקירות. עבור כל מיצוי, יש לנער במרץ את המשפך המפריד המכיל את האתיל אצטט והתמיסה המימית (HCl, H2O, NaHCO3 או NaCl) ולאפשר לשכבות להיפרד לחלוטין.
  12. הסר את שכבת האתיל אצטט מהמשפך המפריד ואסוף אותה בבקבוקון ארלנמאייר. הוסיפו מרית מלאה ב-Na2SO4 (נטולת מים) כדי להסיר שאריות מים מאתיל אצטט.
    הערה: תמיסת האתיל אצטט נחשבת יבשה כאשר Na2SO4 בבקבוקון פועלת בחופשיות ואינה מתגבשת. אם Na2SO4 מסתבך, ניתן להוסיף מרית נוספת של Na2SO4 .
  13. סנן את תמיסת האתיל אצטט המיובשת דרך נייר מסנן #1 כדי להסיר את Na2SO4. לשטוף את נייר המסנן עם כמות קטנה של אתיל אצטט. מניחים את תמיסת האתיל אצטט המסוננת בבקבוקון תחתון עגול ומסירים את הממס על מאייד סיבובי בלחץ מופחת כדי להשיג מסארימיצין כשמן לאחר הסרת כל האתיל אצטט.
  14. ממיסים את שמן המסרימיצין המתקבל לעיל בכמות מינימלית (1-2 מ"ל) של הקסאן 9:1: איזופרופנול ומערבבים על צלחת ערבוב מגנטית עד שכל התרכובת מומסת.
  15. טהרו את המסרימיצין המומס על ידי כרומטוגרפיית פלאש באמצעות עמודת הבזק סיליקה בפאזה רגילה של 12 גרם.
    1. שיווי משקל את עמודת הפלאש עם 10 נפחי עמודה של פאזה ניידת (הקסאן 99:1: איזופרופנול) כאשר המכשיר נקבע בקצב זרימה של 15 מ"ל לדקה.
      הערה: לאחר השלמת שיווי המשקל, עצרו את הזרימה ונתקו את החלק העליון של העמודה מהמערכת.
    2. ציירו מסארימיצין מומס באמצעות מזרק 5 מ"ל. חבר את המזרק ישירות לראש עמודת הפלאש המשוזנת והזריק את התמיסה לעמודה. חבר מחדש את העמודה הטעונה למערכת כרומטוגרפיית ההבזק והתחל את ההבראה המקדמית.
    3. Elute masarimycin מהעמודה באמצעות elution הדרגתי לריכוז פאזה ניידת סופית של 10:90 הקסאן: איזופרופנול על פני 12 נפחי עמודה. עקוב אחר ההתרוממות של masarimycin באמצעות ספיגה ב 230 ו 254 ננומטר.
    4. אסוף את התרכובות שהורכבו מהעמודה על ידי אספן שברים שאוסף 20 מ"ל של ממס לכל שבר.
      הערה: אם מערכת כרומטוגרפיית פלאש אינה זמינה, ניתן לבצע טיהור של מסרימיצין באמצעות עמוד סיליקה כבידה עם פאזה ניידת 3:1 (הקסן: אתיל אצטט). שברים המכילים masarimycin ניתן לזהות על ידי TLC באמצעות אותו שלב נייד. ההדמיה של כתמי TLC נעשתה עם אור UV, אדי I2 , או צביעת אשלגן פרמנגנט.
    5. זהה שברים המכילים מסארימיצין על ידי TLC (שלבים 2.5-2.9) או ספקטרומטריית מסה על ספקטרומטר מסה קומפקטי המצויד בגשושית ניתוח מוצקים אטמוספרית. מייבשים את המוצר הסופי תחת ואקום (כ-0.3 mbar).
      הערה: Masarimycin מתקבל באופן שגרתי כמו שמן חסר צבע או מוצק עם תשואה של 55%-70% ביחס mmol של cyclohexyl carboxaldehyde הוסיף לתגובה. חישוב התשואה הסופית של masarimycin על ידי קבלת המסה של masarimycin מטוהר וחישוב התשואה התיאורטית של התגובה באמצעות הנוסחה הבאה:
      % תשואה = figure-protocol-2 x 100%
  16. אשר את המבנה של masarimycin על ידי NMR.
    1. ממיסים כ-10 מ"ג דגימת מסארימיצין ב-0.5 מ"ל של CDCl3. באמצעות צינור פסטר, להעביר את הפתרון לצינור NMR 5 מ"מ ולכסות את הצינור. מקם את צינור ה- NMR בספקטרומטר.
    2. רכוש ספקטרה של 1H ו - 13C NMR באמצעות ניסויים מוגדרים מראש של היצרן. מטלות משמרות כימיות וספקטרום מייצג מופיעות באיורים משלימים 3-4.
  17. יש לאחסן מסרימיצין יבש או מומס ב-DMSO (ריכוז סופי של 25 מ"מ) בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

3. הליך מיקרוגל להכנת מסארימיצין

  1. הכן 0.6 M תמיסות של ציקלוהקסילאמין, ציקלוהקסיל קרבוקסלדהיד, ציקלוהקסיל איזוציאניד וחומצה o-יודובנזואית באצטוניטריל.
  2. הוסיפו מוט ערבוב ו-10 מ"ל של אצטוניטריל לבקבוקון תגובת מיקרוגל מזכוכית.
  3. הוסיפו 2 מ"ל של ציקלוהקסילאמין (0.6 מ' באצטוניטריל), 2 מ"ל של ציקלוהקסיל קרבוקסלדהיד (0.6 מ' באצטוניטריל) ו-7 מ"ל של אצטוניטריל לבקבוקון.
  4. מניחים את בקבוקון תגובת המיקרוגל בקרוסלת המיקרוגל. מערבבים את התערובת, מחממים אותה במשך 30 דקות בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס בעוצמה של 400 ואט, ומאפשרים לה להתקרר לטמפרטורת החדר.
  5. הוסף 2 מ"ל של חומצה o-יודובנזואית (0.6 M במתנול) ו-2 מ"ל של ציקלוהקסיל איזוציאניד (0.6 M באצטוניטריל) לבקבוקון. מערבבים את התערובת, מחממים אותה ל-100 מעלות צלזיוס במיקרוגל למשך 40 דקות בהגדרת הספק של 400 ואט ומאפשרים לה להתקרר לטמפרטורת החדר.
  6. עקוב אחר התקדמות התגובה על ידי TLC (90:10 הקסאן: איזופרופנול) באמצעות אדי I2 לאחר השלמת שלב 3.5.
    הערה: אם TLC מראה שהתגובה אינה שלמה (כלומר, כתמים מרובים ב- TLC), מקם את בקבוקון התגובה בחזרה במיקרוגל והגדר את תנאי המיקרוגל המתוארים בשלב 3.5.
  7. לאחר השלמת התגובה, שפכו את התמיסה לתוך בקבוקון תחתית עגולה של 100 מ"ל והתאדו אותה ליובש באמצעות מאייד סיבובי.
  8. בצע את השלבים 2.6-2.16 לעיל כדי להשלים את העבודה המימית, הטיהור והאפיון של מסרימיצין.

4. סינרגיה ובדיקת אנטגוניזם

  1. לגדל סטרפטוקוקוס דלקת ריאות R6 על צלחות אגר מולר-הינטון (MH) המכילות 5% (v/v) דם כבשים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים. בכל הניסויים, השתמש בתאי מעבר שני הגדלים ב-5 מ"ל של ציר MH בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים עד ש-OD600 הוא ~0.4.
  2. הכפיפו את המעכבים מסארימיצין ואופטוצ'ין לדילול סדרתי של 1:2 בממסים המתאימים, כאשר הריכוזים המתקבלים מקיפים את ערכי הריכוז המעכב המינימלי (MIC) של כל מעכב.
    1. בצע את הדילול הראשוני של masarimycin ב dimethyl sulfoxide (DMSO) עד להגיע לריכוז של 100 μM. מנקודה זו, לעשות דילול masarimycin במרק MH. הכינו תמיסת מלאי אופטוצ'ין (3.5 מ"מ) על ידי המסת אופטוצ'ין זמין מסחרית (ראו טבלת חומרים) בציר MH סטרילי.
      הערה: פתרונות מלאי Masarimycin נעשו ב 25 mM ב DMSO.
  3. לצלחת מיקרוטיטר סטרילית של 96 בארות, הוסיפו 2 μL aliquots של כל דילול אופטוצ'ין לכל שורה בצלחת. לאותה צלחת, הוסיפו 2 μL aliquots של כל דילול מסרימיצין לכל עמודה כדי ליצור מערך של ריכוזי אופטוצ'ין ומסארימיצין על הצלחת (איור 2).
  4. הוסיפו מרק MH סטרילי (93 μL) לכל באר המכילה את המעכבים הנ"ל. חסן את לוחות המיקרוטיטר עם 5 μL של תרבית (OD600 ~ 0.4) משלב 4.1.
    הערה: חיסון של צלחת 96 הבאר נעשה בדרך כלל בתנאים אנאירוביים בתחנת עבודה אנאירובית. הנפח הסופי בבאר הוא 100 μL.
  5. גידול תרביות במשך 18 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים, ולאחר מכן תוספת של 30 μL של תמיסה של 0.01% (m/v) של מלח נתרן רזאורין. דגירה של הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות כדי לאפשר היווצרות וייצוב של צבע.
    הערה: תמיסת Resazurin מוכנה על ידי המסת התרכובת במים מזוקקים וניתן לאחסן אותה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים.
  6. קרא ישירות את ערכי הריכוז מהצלחת והקצה את ריכוז המעכבים הנמוך ביותר שעבורו לא נצפתה צמיחה חיידקית (צבע כחול) כ-[X] (ראה שלב 4.7.1), כלומר, הריכוז המעכב הנמוך ביותר של התרופה בנוכחות התרופה המשותפת.
    הערה: צמיחת חיידקים חיובית מזוהה בבארות על ידי צבע הרסזורין שהופך ורוד. ערכי MIC עבור כל תרופה בלבד (כלומר, בהיעדר קו-סם) נקבעים באופן דומה באמצעות בדיקת MIC של רזאורין35 עם כל תרופה בנפרד (איור משלים 5). MICs ב S. דלקת ריאות הם 7.8 μM ו 15.85 μM עבור masarimycin ו optochin, בהתאמה.
  7. קבע את ריכוז מעכב השבר (FIC) ואת מדד FIC (FICI) באמצעות המשוואות הבאות.
    1. FIC= [X]/MICx, כאשר [X] (משלב 4.6) הוא הריכוז המעכב הנמוך ביותר של התרופה בנוכחות התרופה המשותפת, ו-MICx הוא הריכוז המעכב הנמוך ביותר של התרופה בהיעדר התרופה המשותפת.
    2. FICI = FICmasarimycin +אנטיביוטיקה FIC
      הערה: FICI < 0.5 = סינרגטי, 0.5 < FICI < 1 = תוסף, 1 < FICI < 4 = אדיש, FICI > 4 = אנטגוניסטי.

5. מחקר מורפולוגי

  1. לגדל את Bacillus subtilis 11774 על צלחות אגר לוריא-ברטאני (LB) (10 גרם/ל' טריפטון, 5 גרם/ליטר תמצית שמרים ו-5 גרם/ל' NaCl) המכילות 1.5% בקט אגר ב-37 מעלות צלזיוס. בכל הניסויים, השתמש בתאי מעבר שני הגדלים במרק של 5 מ"ל בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד OD600 = 1. לגדל S.pneumoniae באותו אופן כמו בשלב 4.1.
  2. לאחר קבלת צפיפות תרבית תאים עם OD600nm = 1 עבור B. subtilis, או OD600nm = 0.4 עבור S. pneumoniae, הוסף מסרימיצין באמצעות פיפטה לצינור התרבית שכותרתו "מטופל" לריכוז סופי של 3.8 μM (0.75x MIC עבור B.subtilis), או 5.85 μM (0.75x MIC עבור S.pneumoniae). לצינור התרבות השני שכותרתו "שליטה", הוסף נפח שווה ערך של DMSO.
  3. עבור B.subtilis, הניחו את הדגימות באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות עם רעידות ב-150 סל"ד. עבור S. דלקת ריאות, הדגירה של התאים מבלי לרעוד בתנאים אנאירוביים.
  4. לאחר 90 דקות, לתקן כימית את התרביות בתערובת 1:10 (v/v) של מדיה תרבית וחיץ תיקון (20 mM HEPES, 1% פורמלדהיד (pH 6.8)) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בלילה. לאחר השלמת התיקון, יש למרוח 10-20 μL של דגימות על מגלשות מיקרוסקופ זכוכית באמצעות פיפטה ולאפשר להן להתייבש באוויר. תקן את הדגימות המיובשות באוויר על ידי חימום מגלשות הזכוכית באמצעות מבער Bunsen.
  5. לאחר קיבוע חום, דגימות כתם בתוספת של 100 μL של 0.1% (m/v) מתילן כחול (תמיסה ב 20% (v/v) אתנול). דגירו את המגלשות המוכתמות למשך 10 דקות ושטפו את הצבע העודף עם dH2O. לאחר מכן, מחממים בעדינות את המגלשות המוכתמות ל-60 מעלות צלזיוס בתנור למשך 15-20 דקות כדי להביא את התאים למישור מוקד משותף.
  6. אטמו את הדגימות המוכתמות על ידי הנחת כיסוי מיקרוסקופ מעל התאים המוכתמים. לאחר מכן, אטמו את הקצוות באמצעות מלט החלקה במיקרוסקופ. הניחו את שקופית המיקרוסקופ האטומה על במת המיקרוסקופ והביאו את התמונה למוקד בהגדלה של פי 100 באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר.
  7. הניחו טיפה של שמן טבילה על שקופית המיקרוסקופ והביאו את שדה הראייה למיקוד באמצעות הגדלה של פי 1000. רכשו מיקרוגרפים באמצעות מצלמה המחוברת למיקרוסקופ ולתוכנה הנלווית אליו. השג תמונות באמצעות הגדרות האיזון הלבן האוטומטי ומפתח הצמצם בתוכנה.
    הערה: לחלופין, ניתן לעבד תמונות באמצעות תוכנת ImageJ בקוד פתוח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

Masarimycin הוא מעכב בקטריוסטטי של מולקולה קטנה של B. subtilis ו- S. pneumoniae והוכח כמעכב את GlcNAcase LytG הפועל כאקסו ב- B. subtilis35,37 ומכוון את דופן התא ב- S. pneumoniae37. ניתן להכין את Masarimycin ביעילות על ידי סינתזה אורגנית קלאסית או בסיוע מיקרוגל עם תשואות בטווח של 55%-70%. לסינתזה בסיוע מיקרוגל יש יתרון של הפחתה משמעותית בזמן לסינתזה של התרכובת. סינתזה בסיוע מיקרוגל מקצרת את הסינתזה מ-5-6 ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

Masarimycin הוא מעכב בקטריוסטטי מיקרומולרי יחיד של B. subtilis35 ו S. דלקת ריאות37 צמיחה. ב - B. subtilis, מסארימיצין הוכח כמעכב את GlcNAcase LytG35, בעוד שהמטרה המולקולרית המדויקת בדופן התא של S. pneumoniae לא זוהתה37. סינתזה של masarimycin באמצעות סינתזה אורגנית קלאסית או הליך מיקרוגל מספק את המעכב בתפוקה טובה וטוהר גבוה. יבולים נמוכים של מסרימיצין ניתן לייחס בדרך כלל לחמצון של ציקלוהקסיל קרבוקסלדה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לריד, C. W. יש קניין רוחני הכרוך ביישומים ספציפיים של masarimycin.

תודות

המחקר נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע תחת מענק מספר 2009522. ניתוח NMR של מסרימיצין נתמך על ידי פרס תוכנית מכשור המחקר הגדולה של הקרן הלאומית למדע תחת מענק מספר 1919644. כל הדעות, הממצאים והמסקנות, או ההמלצות המובעות בחומר זה הן של המחברים ואינן משקפות בהכרח את דעותיה של הקרן הלאומית למדע.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2-חומצה יודובנזואיתSIGMA-ALDRICHI7675-25Gאבקה קורוזיבית, מגרה, צהובה בהירה עד כתומה-חומה
2-פרופנולSIGMA-ALDRICH109827-4Lנוזל דליק, מגרה, חסר צבע
אצטוניטרילSIGMA-ALDRICH34851-4Lדליק, מגרה, נוזל חסר צבע
לוחות סיליקה מגובים אלומיניוםSorbtech4434126סיליקה ג'ל XG F254 על צלחות מגובות אלומיניום
כלורופורם-dSIGMA-ALDRICH151823-50Gממס עבור NMR
ספקטרומטר מסה קומפקטיAdvion-InterchimAdvion CMSספקטרומטר מסה קומפקטי מצויד במקור APCI ובדיקת ניתוח מוצקים אטמוספריים
קורנינג קוסטאר 96 היטב צלחות תחתונות שטוחות-כימיקל פישר סטרילי07-200-90למבחני סינרגיה / אנטגוניזם
החלקות כיסויפישר כימיקל12-547למיקרוסקופיה
CyclohexanecarboxaldehydeCHEM-IMPEX INT'L INC.24451נוזל דליק, מגרה, חסר צבע עד ורוד
Cyclohexyl isocyanideSIGMA-ALDRICH133302-5Gמגרה, נוזל חסר צבע, ריח לא נעים במיוחד
CyclohexylamineSIGMA-ALDRICH240648-100MLנוזל מאכל, דליק, מגרה, חסר צבע אלא אם כן מזוהם
אתיל אצטטSIGMA-ALDRICH537446-4Lדליק, מגרה, חסר צבע
מחסנית סיליקה פלאש נוזלי (12 גרם)Advion-InterchimPF-50SIHP-F0012חבילת עמודי סיליקה פלאש (12 גרם) לטיהור מסרימיצין
פורמלדהידSIGMA-ALDRICHF8775-25MLחומר קיבוע למיקרוסקופיה
HEPESSIGMA-ALDRICHH8651-25Gמאגר לתמיסת קיבוע מיקרוסקופיה
הקסאן, תערובת איזומריםSIGMA-ALDRICH178918-4Lמזיק לסביבה, דליק, מגרה, סכנה בריאותית, נוזל חסר צבע
ספקטרומטר מסה קומפקטי בעל ביצועים גבוהיםביטויAdvionבדיקת ניתוח מוצקים אטמוספריים (ASAP), ואקום אפנדורף ברזולוציה
נמוכהבתוספת ואקום בסיוע כוח וטמפרטורה צנטריפוגלי
חומצה הידרוכלוריתSIGMA-ALDRICH258148-2.5Lחומצה הידרוכלורית נוזלית מאכלת, מגרה, חסרת צבע
SIGMA-ALDRICH320331-2.5Lחומצה חזקה
פישר כימי12-365-19למיקרוסקופיה
יוד, גבישים סובלימייםאלפא Aesar41955מזיק לסביבה, מגרה, סכנה בריאותית, גבישים אפורים כהים/סגולים
MestreMestre MestreLab Researchתוכנה לעיבוד ספקטרום NMR
מתנולSIGMA-ALDRICH439193-4Lדליק, רעיל, סכנה בריאותית,
נוזלי חסר צבע מתילן כחול SIGMA-ALDRICHM9140-25Gמיקרוסקופיה כתם להכתמת דפנות תאים
צלחות אגר מולר-הינטון + 5% דם כבשיםפישר כימיB21176Xמצע גידול לסטרפטוקוקוס פנאומוניה
מרק מולר-הינטוןפישר כימיקלDF0757-17-6אמצעי גידול עבור שקופיות מיקרוסקופ סטרפטוקוקוס פנאומוניה
פישר כימיקל22-310397למיקרוסקופיה
מעבדת סינתזה במיקרוגלMILESTONESTART SYNTHהדורש אוורור של מכסה אדים, מצויד בצינורות NMR קרוסלה סינתזה
SIGMA-ALDRICHZ562769-5EA5 מ"מ צינורות NMR 600 מגה-הרץ
תהודה מגנטית גרעינית (NMR)BrukerAscend 400מגנט מוליך-על גדול (400 מגה-הרץ)
אופטוכיןפישר AAB21627MC כימיאתילהידרוקופרין הידרוכלוריד
צלחות פטריCelltreat229695להכנת לוחות אגר לגידול חיידקים
מיקרוסקופ ניגודיות שדה / פאזה פרימו סטאר בהיר עם מצלמת ERc5sZeissעבור מחקרי מורפולוגיה
puriFlashinterchimXS520plusמערכת טיהור כרומטוגרפיה פלאש
resazurinSIGMA-ALDRICHR7017-1Gלבדיקות סינרגיה/אנטגוניזם
מאייד סיבוביHeidolphHei-VAP ערך "The Collegiate"מאייד ממס
נתרן ביקרבונטSIGMA-ALDRICHS6014-500Gמגרה, לבן אבקה
נתרןכלורי פישר כימיקלS271-1גבישי, חסר צבע
נתרן כלוריSIGMA-ALDRICHS5886-500Gלגידול B.subtilis והכנת מדיה LB
נתרן גופרתיSIGMA-ALDRICH7985592-500Gפישר לבן נטול מים, גרגירי לבן,
BP1421-500לגידול של B.subtilis ו הכנת מדיה LB
תחנת עבודה וויטני DG250 תחנת עבודהמיקרוביולוגיה בינלאומיתDG250תחנת עבודה אנאירובית. תערובת גז אנאירובית בשימוש: 5% מימן, 10% פחמן דו חמצני, תמצית שמרי חנקן מאוזנת
פישר כימיקלBP1422-500לגידול B.subtilis והכנת תוכנת LB
Zen Lite (כחול)Zeissלרכישת מיקרוגרפים
שמן טבילה מכשיר כימיקל טריפטון

מקורות

  1. Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiology Review. 32 (2), 149-167 (2008).
  2. Munita, J. M., Bayer, A. S., Arias, C. A. Evolving resistance among Gram-positive pathogens. Clinical Infectious Diseases. 61, suppl-2 48-57 (2015).
  3. Vollmer, W., Bertsche, U. Murein (peptidoglycan) structure, architecture and biosynthesis in Escherichia coli. Biochimica Biophysica Acta. 1778 (9), 1714-1734 (2008).
  4. Vollmer, W., Höltje, J. -V. The architecture of the murein (peptidoglycan) in Gram-negative bacteria: vertical scaffold or horizontal layer(s). Journal of Bacteriology. 186 (18), 5978-5987 (2004).
  5. Clarke, A. J. Compositional analysis of peptidoglycan by high-performance anion-exchange chromatography. Analytical Biochemistry. 212 (2), 344-350 (1993).
  6. Kim, S. J., Chang, J., Singh, M. Peptidoglycan architecture of Gram-positive bacteria by solid-state NMR. Biochimica Biophysica Acta. 1848, 350-362 (2014).
  7. Koch, A. L., Doyle, R. J. Inside-to-outside growth and turnover of the wall of gram-positive rods. Journal of Theoretical Biology. 117 (1), 137-157 (1985).
  8. Beeby, M., Gumbart, J. C., Roux, B., Jensen, G. J. Architecture and assembly of the Gram-positive cell wall. Molecular Microbiology. 88 (4), 664-672 (2013).
  9. Shockman, G. D., Daneo-Moore, L., Kariyama, R., Massidda, O. Bacterial walls, peptidoglycan hydrolases, autolysins, and autolysis. Microbial Drug Resistance. 2 (1), 95-98 (1996).
  10. Dijkstra, A. J., Keck, W. Peptidoglycan as a barrier to transenvelope transport. Journal of Bacteriology. 178 (19), 5555-5562 (1996).
  11. Blackman, S. A., Smith, T. J., Foster, S. J. The role of autolysins during vegetative growth of Bacillus subtilis 168. Microbiology. 144, 73-82 (1998).
  12. Misra, G., Rojas, E. R., Gopinathan, A., Huang, K. C. Mechanical consequences of cell-wall turnover in the elongation of a Gram-positive bacterium. Biophysical Journal. 104 (11), 2342-2352 (2013).
  13. Wheeler, R., et al. Bacterial cell enlargement requires control of cell wall stiffness mediated by peptidoglycan hydrolases. mBio. 6 (4), 00660(2015).
  14. Taguchi, A., Kahne, D., Walker, S. Chemical tools to characterize peptidoglycan synthases. Current Opinion in Chemical Biology. 53, 44-50 (2019).
  15. Welsh, M. A., Schaefer, K., Taguchi, A., Kahne, D., Walker, S. Direction of chain growth and substrate preferences of shape, elongation, division, and sporulation-family peptidoglycan glycosyltransferases. Journal of the American Chemial Society. 141 (33), 12994-12997 (2019).
  16. Rubino, F. A., et al. Detection of transport intermediates in the peptidoglycan flippase MurJ identifies residues essential for conformational cycling. Journal of the American Chemical Society. 142 (12), 5482-5486 (2020).
  17. Sjodt, M., et al. Structure of the peptidoglycan polymerase RodA resolved by evolutionary coupling analysis. Nature. 556 (7699), 118-121 (2018).
  18. Tiyanont, K., et al. Imaging peptidoglycan biosynthesis in Bacillus subtilis with fluorescent antibiotics. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 103 (29), 11033-11038 (2006).
  19. Lebar, M. D., et al. Reconstitution of peptidoglycan cross-linking leads to improved fluorescent probes of cell wall synthesis. Journal of the American Chemical Society. 136 (31), 10874-10877 (2014).
  20. Do, T., Page, J. E., Walker, S. Uncovering the activities, biological roles, and regulation of bacterial cell wall hydrolases and tailoring enzymes. Journal of Biological Chemistry. 295 (10), 3347-3361 (2020).
  21. Liang, H., et al. Metabolic labelling of the carbohydrate core in bacterial peptidoglycan and its applications. Nature Communications. 8, 15015(2017).
  22. DeMeester, K. E., et al. Metabolic incorporation of N-acetyl muramic acid probes into bacterial peptidoglycan. Current Protocol in Chemical Biology. 11 (4), 74(2019).
  23. Lazor, K. M., et al. Use of Bioorthogonal N-acetylcysteamine (SNAc) analogues and peptidoglycan O-acetyltransferase B (PatB) to label peptidoglycan. The FASEB Journal. 32, 630(2018).
  24. Wang, Y., Leimkuhler-Grimes, C. Fluorescent labeling of the carbohydrate backbone of peptidoglycan to track degradation in vivo. The FASEB Journal. 29, (2015).
  25. Kuru, E., et al. In probing of newly synthesized peptidoglycan in live bacteria with fluorescent D-amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 51 (50), 12519-12523 (2012).
  26. Zhou, R., Chen, S., Recsei, P. A dye release assay for determination of lysostaphin activity. Analytical Biochemistry. 171 (1), 141-144 (1988).
  27. Qiao, Y., et al. Lipid II overproduction allows direct assay of transpeptidase inhibition by β-lactams. Nature Chemical Biology. 13 (7), 793-798 (2017).
  28. Lebar, M. D., et al. Forming cross-linked peptidoglycan from synthetic Gram-negative lipid II. Journal of the American Chemical Society. 135 (12), 4632-4635 (2013).
  29. Chen, R., Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. Role of the D-dependent autolysins in Bacillus subtilis population heterogeneity. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5775-5784 (2009).
  30. Yukie, S., Miki, K., Yoshio, N., Kuniaki, T., Yoshihisa, Y. Identification and characterization of an autolysin-encoding gene of Streptococcus mutans. Infection and Immunity. 73 (6), 3512-3520 (2005).
  31. Domenech, M., García, E., Moscoso, M. In vitro destruction of Streptococcus pneumoniae biofilms with bacterial and phage peptidoglycan hydrolases. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (9), 4144-4148 (2011).
  32. Horsburgh, G. J., Atrih, A., Williamson, M. P., Foster, S. J. LytG of Bacillus subtilis is a novel peptidoglycan hydrolase: the major active glucosaminidase. Biochemistry. 42 (2), 257-264 (2003).
  33. Vermassen, A., et al. Cell wall hydrolases in bacteria: insight on the diversity of cell wall amidases, glycosidases and peptidases toward peptidoglycan. Frontiers in Microbiology. 10, 331(2019).
  34. Martin-Galiano, A. J., Yuste, J., Cercenado, M. I., de la Campa, A. G. Inspecting the potential physiological and biomedical value of 44 conserved uncharacterised proteins of Streptococcus pneumoniae. BMC Genomics. 15, 652(2014).
  35. Nayyab, S., et al. Diamide inhibitors of the Bacillus subtilis N-acetylglucosaminidase LytG that exhibit antibacterial activity. ACS Infectioius Diseases. 3 (6), 421-427 (2017).
  36. Lipski, A., et al. Structural and biochemical characterization of the β-N-acetylglucosaminidase from Thermotoga maritima: Toward rationalization of mechanistic knowledge in the GH73 family. Glycobiology. 25 (3), 319-330 (2014).
  37. Haubrich, B. A., et al. Inhibition of Streptococcus pneumoniae autolysins highlight distinct differences between chemical and genetic inactivation. bioRxiv. , 300541(2020).
  38. Farha, M. A., et al. Inhibition of WTA synthesis blocks the cooperative action of PBPs and sensitizes MRSA to β-lactams. ACS Chemical Biology. 8 (1), 226-233 (2013).
  39. Lehár, J., et al. Chemical combination effects predict connectivity in biological systems. Molecular Systems Biology. 3 (1), 80(2007).
  40. Farha, M. A., et al. Antagonism screen for inhibitors of bacterial cell wall biogenesis uncovers an inhibitor of undecaprenyl diphosphate synthase. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (35), 11048-11053 (2015).
  41. Palomino, J. C., et al. Resazurin microtiter assay plate: simple and inexpensive method for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (8), 2720-2722 (2002).
  42. Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (1), 1(2003).
  43. Arrigucci, R., Pozzi, G. Identification of the chain-dispersing peptidoglycan hydrolase LytB of Streptococcus gordonii. PLoS One. 12 (4), 0176117(2017).
  44. Bai, X. -H., et al. Structure of pneumococcal peptidoglycan hydrolase LytB reveals insights into the bacterial cell wall remodeling and pathogenesis. of Biological Chemistry. 289 (34), 23403-23416 (2014).
  45. Garcia, P., Gonzalez, M. P., Garcia, E., Lopez, R., Garcia, J. L. LytB, a novel pneumococcal murein hydrolase essential for cell separation. Molecular Microbiology. 31 (4), 1275-1281 (1999).
  46. Giladi, M., Altman-Price, N., Levin, I., Levy, L., Mevarech, M. FolM, a new chromosomally encoded dihydrofolate reductase in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 185 (23), 7015-7018 (2003).
  47. Chua, P. R., et al. Effective killing of the human pathogen Candida albicans by a specific inhibitor of non-essential mitotic kinesin Kip1p. Molecular Microbiology. 65 (2), 347-362 (2007).
  48. Rico-Lastres, P., et al. Substrate recognition and catalysis by LytB, a pneumococcal peptidoglycan hydrolase involved in virulence. Scientific Reports. 5, 16198(2015).
  49. Vollmer, W., et al. The cell wall of Streptococcus pneumoniae. Microbiology Spectrum. 7 (3), (2019).
  50. Massidda, O., Nováková, L., Vollmer, W. From models to pathogens: how much have we learned about Streptococcus pneumoniae cell division. Environmental Microbiology. 15 (12), 3133-3157 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

MasarimycinFlash ChromatographyBacillus subtilisStreptococcus pneumoniae
סינתזה של מסארימיצין, מעכב מולקולה קטנה של צמיחת חיידקים גראם חיובית
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.