מאמר שיטה

הדמיה קונפוקלית בתפוקה גבוהה של מטרימי ספייק SARS-CoV-2 מצומדים קוונטיים למעקב אחר כריכה ואנדוציטוזיס בתאי HEK293T

DOI:

10.3791/63202

⸱

21 באפריל 2022

 ,  ,  ,  , 
1National Center for Advancing Translational Sciences, 2Optical Sciences Division, Code 5600, Naval Research Laboratory, 3Jacobs Corporation

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול זה, נקודות קוונטיות המצומדות לספייק SARS-CoV-2 רקומביננטי מאפשרות בדיקות מבוססות תאים כדי לפקח על קשירת ספייק ל- hACE2 בקרום הפלזמה ואנדוציטוזיס לאחר מכן של החלבונים הכרוכים לתוך הציטופלסמה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתוח טכנולוגיות חדשות למיקרוסקופיה פלואורסצנטית תאית הקל על שיטות סינון בתפוקה גבוהה לגילוי תרופות. נקודות קוונטיות הן חלקיקים פלואורסצנטיים עם תכונות פוטופיזיות מעולות חדורות פוטולומינציה בהירה ויציבה, כמו גם רצועות פליטה צרות. נקודות קוונטיות הן כדוריות בצורתן, ועם השינוי הנכון של כימיית פני השטח, ניתן להשתמש בהן כדי להטות ביומולקולות עבור יישומים תאיים. מאפיינים אופטיים אלה, בשילוב עם היכולת לתפקד אותם עם ביומולקולות, הופכים אותם לכלי מצוין לחקירת אינטראקציות קולטן-ליגנד וסחר תאי. כאן, אנו מציגים שיטה המשתמשת בנקודות קוונטיות כדי לעקוב אחר הכריכה והאנדוציטוזיס של חלבון ספייק SARS-CoV-2. פרוטוקול זה יכול לשמש כמדריך לניסויים המעוניינים לנצל נקודות קוונטיות כדי לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון וסחר בהקשר של פיזיולוגיה תאית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מאפשרת לחוקרים להציץ לתוך הפעולות הפנימיות של התא באמצעות צבעים מיוחדים1, חלבונים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית2, וננו-חלקיקים פלואורסצנטיים בצורה של נקודות קוונטיות (QDs)3. לתסמונת הנשימה החריפה החמורה קורונה של 2019 (SARS-CoV-2) המגפה העולמית, חוקרים השתמשו מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי להבין כיצד הנגיף אינטראקציה עם התא הן בקרום הפלזמה והן בציטופלסמה. לדוגמה, חוקרים הצליחו לקבל תובנות על הכריכה של חלבון ספייק SARS-CoV-2 על פני השטח של הנגיף לאנזים אנושיים המרת אנגיוטנסין 2 (hACE2) על פני השטח של תאים אנושיים, הפנמה לאחר מכן באמצעות היתוך בקרום הפלזמה, אנדוציטוזיס ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קו התא HEK293T המשמש במחקר זה הוא קו תאים מונצח. במחקר זה לא נעשה שימוש בנבדקים אנושיים או בעלי חיים.

1. פולחן תאים וזריעה

  1. בתוך ארון בטיחות ביולוגית סטרילי, לבוש בציוד מגן אישי (כולל כפפות מעבדה, חלוק מעבדה ומשקפי בטיחות), הכן מדיום תרבית תאים על ידי השלמת מדיום הנשר המותאם של Dulbecco (DMEM) עם 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1% פניצילין / סטרפטומיצין (P / S), ו 250 מיקרוגרם / מ"ל G418.
    1. עבור 500 מ"ל של מדיה, הוסף 443.75 מ"ל של DMEM, 50 מ"ל של FBS, 5 מ"ל של P/S ו- 1.25 מ"ל של G418.
    2. לסנן דרך בקבוק מסנן 0.2 מיקרומטר ולשמור על סטריליות כדי למנוע זיהום חיידקי.
  2. בתוך ארון בטיחות ביולו....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאחר הטיפול, QDs יופנמו כמו חלקיקים ייקשרו ACE2 על קרום הפלזמה ולגרום אנדוציטוזיס. באמצעות קו תא מבטא ACE2-GFP, טרנסלוקציה של QDs ו- ACE2 ניתן לדמיין באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. לאחר ההפנמה, שני אותות QD ו- ACE2 מראים colocalization חזק. מתמונות אלה ניתן לבצע פילוח תמונות וניתוחים הבאים כדי לחלץ פרמטרים רלוונטיים כגון ספירת ספוטים (איור 1, איור 2B). איור 1A הוא מונטאז' של תאים המטופלים בריכוזים שונים של QD-Spike או מדיה רק כפק.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה המתוארת במאמר זה מספקת את השלבים הדרושים להדמיית QDs פונקציונליים בתאים אנושיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית בתפוקה גבוהה. שיטה זו מתאימה ביותר לתאים שבהם אנדוציטוזיס היא המסלול העיקרי של כניסה ויראלית ולא הפעילות של TMPRSS2 והיתוך ממברנה, כפי שהוא מאפשר את המחקר של SARS-CoV-2 ספייק ו hACE2 אנדוציטוזיס. בגלל אופיו של דגם QD וה- C-terminal His-tag על חותך ספייק הזמין מסחרית, כל מחשוף TMPRSS2 של דומיינים ספייק S1 ו- S2 ישאיר את ה- QD מחובר לתחום S2 רק 12. הדבר עשוי למנוע הפנמה, בהתחשב בכך שה-.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך בחלקו על ידי תוכנית המחקר הפנימית של המרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום, NIH. מעבדת המחקר הימית סיפקה מימון באמצעות המכון הפנימי שלה למדעי הננו- מדעים. הכנת ריאגנט נתמכה באמצעות קרן הבסיס NRL COVID-19.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
32% ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15714משמש לקיבוע תאים לאחר טיפול בנקודות קוונטיות, ריכוז סופי 3.2%
משמש לייצוב QDs ב-Optimem I ומניעת אינטראקציות לא ספציפיות, ריכוז סופי 0.1%
7.5% סרום בקר אלבומיןGibco15260-037משמש כצבע כדאיות תאים לספירת תאים פלואורסצנטיים
כתם תפוז אקרידין / פרופידיום יודידLogos BiosystemsF23001צלחות Microwell המשמשות לזריעת תאים ובדיקת QD-Spike
שחור תחתון שקוף 96 צלחת מצופה היטב מצופה פולי-D-ליזיןגריינר655946 משמש לתמיכה בתרבית תאים, תוסף DMEM
Character Fetal Bovine SerumCytiva/HyCloneSH30071.03תוכנת ניתוח תמונות מבוססת ענן בעלת תוכן גבוה; V2.9.1
מנתח קולומבוספרקין אלמרNAמשמש לתיוג גרעיני תאים וגופי תאים לאחר קיבוע, צבע גרעיני אדום עמוק
DRAQ5 (5 מ"מ)ThermoFisherScientific62252מדיה בסיסית לתרבית תאים HEK293T
המדיה החיונית המינימלית של Dulbecco, D-גלוקוז (4.5 גרם/ליטר), L-גלוטמין, נתרן פירובט (110 מ"ג/ליטר), פנול אדוםGibco11995-065משמש לסידור נתונים לאחר ייצוא מקולומבוס; V2110 Microsoft 365
ExcelMicrosoftNAמשמש להמשך הבחירה של תאים חיוביים hACE2-GFP, תוסף DMEM
G418InvivoGenant-gn-5קו תאי כליה עובריים אנושיים ביטוי יציב אנזים המרת אנגיוטנסין אנושי 2 מתויג עם GFP
HEK293T hACE2-GFPCodex BiosolutionsCB-97100-203מונה תאים אוטומטי
לונה מונה תאים אוטומטיLogos BiosystemsNAמשמש לספירת תאים פלואורסצנטיים
שקופיות ספירת תאי לונהLogos BiosystemsL12001פלטפורמת הדמיה בעלת תוכן גבוה
Opera PhoenixPerkin ElmerNAImaging media, המשמשת לדגירת תאים עם נקודות קוונטיות
Opti-MEM I Reduced Serum MediumGibco11058-021תמיסת מלח חוצצת פוספט ללא סידן או מגנזיום המשמשת לשטיפת תאים במהלך מעבר ובדיקה
PBS -/-Gibco10010-023משמש למניעת זיהום חיידקי של תרבית תאים, תוסף DMEM
פניצילין סטרפטומיציןGibco15140-122משמש לגרפים, הדמיית נתונים וניתוח סטטיסטי; V9.1.0
PrismGraphPadNAמשמש לבדיקת קשירת SARS-Cov-2 Spike ל-hACE2 ולניטור אנדוציטוזיס ספייק
Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike)בהתאמה אישית על ידי מעבדתהימית המשמש לעיכוב קשירת SARS-Cov-2 Spike ל-hACE2
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) נוגדן מנטרל ספייק, עכבר MabSino Biological40592-MM57משמש לניתוק תאים מבקבוק במהלך המעבר
TrypLE ExpressGibco12605-010
המחקר

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chazotte, B. Labeling Lysosomes in Live Cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571(2011).
  2. Mehta, S., Zhang, J. Biochemical activity architectures visualized-using genetically encoded fluorescent biosensors t....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

spike

מאמרים קשורים