כאן, אנו מתארים את הבנייה של מוטציות ריקות של אירומונס בגליקוזילטרנספראזות ספציפיות או באזורים המכילים גליקוזילטרנספראזות, מבחני תנועתיות וטיהור פלגלה שבוצעו כדי לבסס את המעורבות והתפקוד של האנזימים המקודדים שלהם בביוסינתזה של גליקאן, כמו גם את תפקידו של גליקאן זה בפתוגנזה חיידקית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
יצירת מוטציות ריקות כדי להבהיר את תפקידם של גליקוזילטרנספראזות חיידקיות בתנועתיות חיידקית
במאמר זה
סיכום
תקציר
המחקר של גליקוסילציה אצל פרוקריוטים הוא אזור שגדל במהירות. על פני השטח שלהם יש לחיידקים מבנים גליקוסיליים שונים, שהגליקנים שלהם מהווים ברקוד ספציפי לזן. הגליקנים הקשורים אליהם מראים גיוון גבוה יותר בהרכב הסוכר ובמבנהו בהשוואה לאלה של אאוקריוטים, והם חשובים בתהליכי זיהוי חיידקים-מארחים ובאינטראקציה עם הסביבה. בחיידקים פתוגניים, גליקופרוטאינים היו מעורבים בשלבים שונים של תהליך הזיהום, ושינויי גליקאן יכולים להפריע לתפקודים ספציפיים של גליקופרוטאינים. עם זאת, למרות ההתקדמות שנעשתה בהבנת ההרכב, המבנה ומסלולי הביוסינתזה של הגליקנים, הבנת תפקידם של גליקופרוטאינים בפתוגניות או באינטראקציה עם הסביבה נותרה מוגבלת מאוד. יתר על כן, בחיידקים מסוימים, האנזימים הדרושים לגליקוזילציה של חלבונים משותפים עם מסלולים ביוסינטטיים אחרים של פוליסכרידים, כגון ליפופוליסכריד ומסלולים ביוסינטטיים כמוסות. החשיבות התפקודית של גליקוסילציה הובהרה במספר חיידקים באמצעות מוטציה של גנים ספציפיים שנחשבו מעורבים בתהליך הגליקוזילציה וחקר השפעתה על הביטוי של גליקופרוטאין המטרה והגליקן המשתנה. לאירומונס מזופילי יש פלגלום קוטבי יחיד ו-O-גליקוזילי. גליקנים פלאגלארים מראים גיוון בהרכב הפחמימות ובאורך השרשרת בין זני אירומונס . עם זאת, כל הזנים שנותחו עד כה מראים נגזרת של חומצה פסאודמינית כסוכר המקשר המשנה שאריות סרין או תראונין. נגזרת החומצה הפסאודמינית נדרשת להרכבת פלגלה קוטבית, ולאובדן שלה יש השפעה על הידבקות, היווצרות ביופילם והתיישבות. הפרוטוקול המפורט במאמר זה מתאר כיצד ניתן להשתמש בבניית מוטנטים ריקים כדי להבין את המעורבות של גנים או אזורי גנום המכילים גליקוזילטרנספראזות פוטטיביות בביוסינתזה של גליקאן פלאגלאר. זה כולל את הפוטנציאל להבין את תפקודם של הגליקוזילטרנספראזות המעורבות ואת תפקידו של הגליקן. זה יושג על ידי השוואת המוטציה חסרת הגליקן לזן מסוג בר.
מבוא
גליקוזילציה של חלבונים תוארה הן בחיידקים גראם-חיוביים והן בחיידקים גראם-שליליים והיא מורכבת מהצמדה קוולנטית של גליקאן לשרשרת צד של חומצת אמינו 1,2. אצל פרוקריוטים, תהליך זה מתרחש בדרך כלל באמצעות שני מנגנונים אנזימטיים עיקריים: O- ו- N-glycosylation 3. ב-O-glycosylation, הגליקן מחובר לקבוצת ההידרוקסיל של שאריות סרין (Ser) או תראונין (Thr). ב-N-גליקוזילציה, הגליקן מחובר לשרשרת הצדדית של חנקן אמיד של שאריות אספרגין (Asn) בתוך רצפי הטריפפטידים Asn-X-Ser/Thr, כאשר X יכול להיות כל חומצת אמינו למעט פרולין.
גליקנים יכולים....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הייצוג הסכמטי של ההליך מוצג באיור 1.
1. זיהוי ביואינפורמטי של אי הגליקוזילציה פלאגלה (FGIs) באיארומונס
- כדי לזהות את האשכולות הביו-סינטטיים של PseAc בגנומים של אירומונס , השתמש בכלי ה-tblastn מתוך מסד הנתונים NCBI26. ראשית, לאחזר חלבונים אורתולוגיים ל-PseC ול-PseI של A. piscicola AH-3 (קודי הזיהוי הם OCA61126.1 ו-OCA61113.1) ממסדי נתונים של זני אירומונס מרוצפים, ולאחר מכן השתמש בכלי ה-tblastn כדי לחפש את רצפי הנוקלאוטידים המתורגמים שלהם.
הערה: הגנים של pse מקיפים את ה-Aeromonas FGIs, כאשר....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מתודולוגיה זו מספקת מערכת יעילה ליצירת מוטנטים ריקים בגנים או באזורים כרומוזומליים של אירומונס שיכולים להשפיע על הגליקוזילציה של פלאגלה ועל תפקידו של חוט פלגלה (איור 1).
הפרוטוקול מתחיל עם זיהוי ביואינפורמטי של FGIs putative ואת הגנים המקודדים GTs מציג באזור זה. ב-Aeromonas, המיקום הכרומוזומלי של FGIs מבוסס על זיהוי של שלושה סוגים של גנים: גנים המעורבים בביוסינתזה של החומצה הפסאודאמינית (pseI ו-pseC), גנים של פלגלין קוטבי ו-.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השלב המוקדם הקריטי של שיטה זו הוא זיהוי של אזורים המעורבים בגליקוסילציה של פלגלה ו-GTs פוטטיביים מכיוון שאנזימים אלה מראים הומולוגיה גבוהה ומעורבים בתהליכים רבים. ניתוח ביואינפורמטי של גנומים של אירומונס במאגרי מידע ציבוריים מראה כי אזור זה צמוד לאזור הדגלה הקוטבי 2, המכיל את הגנים פלאגלין בזנים רבים ומכיל גנים המעורבים בביוסינתזה של חומצה פסאודמינית27. זה איפשר לפתח קו מנחה לאיתור איי גליקוזילציה של פלגלה ב-Aeromonas שיכולים לשמש לזיהוי אזור זה בחיידקים אחרים שהגליקן הפלגלרי שלה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מועצת המחקר הלאומית של קנדה, עבור תוכנית Nacional de I + D (Ministerio de Economía y Competitividad, ספרד) ועבור הגנרליטאט דה קטלוניה (מרכז ההתייחסות לביוטכנולוגיה).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequering Ready Reaction Kit | Applied Biosystems | 4337455 | משמש לריצוף |
| AccuPrime Taq DNA Polymerase, נאמנות גבוהה | Invitrogen | 12346-086 | משמש להגברה של שברי AB, CD ו-AD |
| Agarose | Conda-Pronadise | 8008 | משמש לאלקטרופורזה של DNA |
| פוספטאז אלקליין, מעי עגל (CIAP) | Promega | M1821 | משמש להסרת פוספט בקצה 5' |
| Bacto agar | Becton Dickinson | 214010 | השתמש לניתוח תנועתיות |
| BamHI | Promega | R6021 | משמש להגבלת אנדונוקלאז |
| BglII | Promega | R6081 | משמש להגבלת אנדונוקלאז |
| BioDoc-It Imagin System | UVP | תחנת הדמיה ביולוגית משמש להדמיית DNA | |
| Biotaq פולימראז | Bioline | BIO-21040 | משמש להקרנת מושבה |
| צזיום כלוריד | Applichem | A1126,0100 | משמש לטיהור דגלים |
| Chloramphenicol | Applichem | A1806,0025 | משמש להזדווגות תלת-הורית |
| Cytiva illustra GFX PCR DNA וערכת טיהור להקת ג'ל | Cytivia | 28-9034-71 | משמש לטיהור אמפליקונים PCR ושברי DNA. |
| EDTA | Applichem | 131026.1211 | משמש לאלקטרופורזה של DNA |
| קובטות אלקטרופורציה פער 2 מ"מ | VWR | 732-1133 | משמש לטרנספורמציה |
| אתידיום ברומיד | Applichem | A1152,0025 | שימוש להדמיית DNA |
| HyperLadder 1 סמן KB | Bioline | BIO-33053 | סמן DNA |
| Invitrogen Easy-DNA gDNA ערכת | טיהורInvitrogen | 10750204 | משמש לטיהור DNA כרומוזומלי חיידקי |
| Luria-Bertani (LB) Miller agar | Condalab | 996 | משמש לEscherichia coli culture |
| Luria-Bertani (LB) מרק מילר | Condalab | 1551 | משמש לEscherichia coli culture |
| Nanodrop ND-1000 | NanoDrop Techonologies Inc | ספקטרופוטומטר משמש לכימות DNA | |
| Rifampicin | Applichem | A2220,0005 | משמש להזדווגות תלת-הורית |
| SOC Medium | Invitrogen | 15544034 | משמש לשחזור אלקטרופורציה |
| Spectinomycin | Applichem | A3834,0005 | משמש להזדווגות תלת-הורית |
| SW 41 Ti רוטור דלי מתנדנד | בקמן | 331362 | משמש לטיהור |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224017 | משמש לתגובת קשירה |
| טריפטיקזאין אגר סויה | Condalab | 1068 | שגדל ב-Aeromonas |
| Condalab | 1224 | משמש לגידול Aeromonas | |
| Tryptone | Condalab | 1612 | השתמש לניתוח תנועתיות |
| Tris | Applichem | A2264,0500 | משמש לאלקטרופורזה של DNA וטיהור דגלים |
| Triton X-100 | Applichem | A4975,0100 | משמש לליזה חיידקית |
| צינורות אולטרה ברורים (14 מ"מ x 89 מ"מ) | בקמן | 344059 | משמש לטיהור דגלים |
| Veriti 96 באר Thermal Cycler | Applied Biosystems | המשמשות לתגובות PCR | |
| Zyppy Plasmid Miniprep II Kit | מחקר Zymmo | D4020 | משמש לבידוד DNA פלסמיד |
מקורות
- Schäffer, C., Messner, P. Emerging facets of prokaryotic glycosylation. FEMS Microbiology Review. 41 (1), 49-91 (2017).
- De Maayer, P., Cowan, D. A. Flashy flagella: flagellin modification is relatively common and highly versatile among the Enterobac....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
