הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

חקר ארגינין מתילום על ידי ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית

1.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63245

⸱

16 בדצמבר 2021

 ,  ,  , 
1Gottfried Schatz Research Center for Cell Signaling, Metabolism and Aging, Molecular Biology and Biochemistry, Medical University of Graz, 2Ministry of Education, School of Basic Medical Sciences, Key Laboratory of Gastrointestinal Cancer (Fujian Medical University)

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הכנה ומדידה כמותית של ארגינין חופשי וקשור לחלבון ומתיל-ארגינינים על ידי ספקטרוסקופיית H-NMR 1.

תקציר

ארגינין הקשור לחלבון עובר מתילציה בדרך כלל בחלבונים רבים ומווסת את תפקודם על ידי שינוי התכונות הפיזיקוכימיות, האינטראקציה שלהם עם מולקולות אחרות, כולל חלבונים אחרים או חומצות גרעין. עבודה זו מציגה פרוטוקול קל ליישום לכימות ארגינין ונגזרותיו, כולל דימתילארגינין אסימטרי וסימטרי (ADMA ו-SDMA, בהתאמה) ומונומתיל ארגינין (MMA). לאחר בידוד חלבונים מנוזלי גוף ביולוגיים, רקמות או ליזטים של תאים, מתוארת שיטה פשוטה להומוגניזציה, משקעים של חלבונים והידרוליזה של חלבונים. מאחר שההידרוליזות מכילות רכיבים רבים אחרים, כגון חומצות אמינו אחרות, שומנים וחומצות גרעין, שלב טיהור באמצעות מיצוי בשלב מוצק (SPE) הוא חיוני. SPE יכול להתבצע באופן ידני באמצעות צנטריפוגות או רובוט pipetting. הרגישות ל-ADMA בפרוטוקול הנוכחי היא כ-100nmol/L. הגבול העליון של גילוי ארגינין הוא 3 mmol / L עקב רוויה SPE. לסיכום, פרוטוקול זה מתאר שיטה חזקה, המשתרעת מהכנת דגימות ביולוגיות לזיהוי מבוסס NMR, ומספקת רמזים ומלכודות יקרי ערך לעבודה מוצלחת בעת לימוד מתילום ארגינין.

מבוא

במהלך שני העשורים האחרונים, מתילציה של שאריות ארגינין הוכרה כשינוי חיוני לאחר תרגום של חלבונים. זה משפיע על תהליכים ביולוגיים בסיסיים כמו ויסות של שעתוק, העברת אותות, ועודרבים 1. החלבונים העיקריים המעורבים בוויסות מתילציה של ארגינין הם חלבון ארגינין מתילטרנספראזות (PRMTs)2. הנגזרות העיקריות של ארגינין הן ω-(N G,N G)-דימתילארגינין אסימטרי (ADMA), ω-(N G,N'G)-דימתילארגינין סימטרי (SDMA), ו-ω-N G-מונומתילארגינין (MMA)2.

PRMTs משתמשים ב-S-אדנוזיל-l-מתיונין כדי להעביר קבוצות מתיל לקבוצת גואנידינו הטרמינלית (עם שתי קבוצות אמינו שוות ערך) של ארגינין הקשור לחלבון1. ניתן להבחין בין שני אנזימים עיקריים: אנזימים מסוג I ואנזימים מסוג II מזרזים את שלב המתילציה הראשון ליצירת MMA (ובכך מאבד את הסימטריה שלו). לאחר שלב זה, אנזימים מסוג I (לדוגמה, PRMT1, 2, 3, 4, 6, 8) משתמשים ב-MMA כמצע ליצירת ADMA, בעוד שאנזימים מסוג II (בעיקר PRMT5 ו-PRMT9) מייצרים SDMA. PRMT1 היה החלבון הראשון ארגינין מתילטרנספראז שבודד מתאי יונקים3. עם זאת, PRMTs נשמרו אבולוציונית4 בבעלי חיים אחרים כמו בעלי חוליות שאינם יונקים, אקורדטים חסרי חוליות, אכינודרמים, פרוקי רגליים ונמטודות cnidarians5, צמחים6, ופרוטוזואה, כולל פטריות כמו שמרים7. במקרים רבים, נוקאאוט של אחד מ-PRMTs מוביל לאובדן כדאיות, וחושף את התפקיד החיוני של מיני ארגינין שעבר מתילציה המעורבים בתהליכים תאיים בסיסיים כמו שעתוק, תרגום, העברת אותות, אפופטוזיס והפרדת פאזה נוזלית-נוזלית (כלומר היווצרות אברונים חסרי קרום, למשל נוקלאולי), הכוללים באופן קבוע תחומים עשירים בארגינין 8,9,10 . בתורו, זה משפיע על הפיזיולוגיה ומצבי מחלה, כולל סרטן 11,12,13, מיאלומה נפוצה14, מחלות לב וכלי דם 15, פתוגנזה ויראלית, ניוון שרירים בעמוד השדרה 16, סוכרת 17, והזדקנות1. רמות ADMA מוגברות בזרם הדם, למשל שמקורן בריאה18 עקב פירוק חלבונים, נחשבות קשורות לתפקוד לקוי של האנדותל, מחלת ריאות כרונית19 ותסמונות אחרות של מחלות לב וכלי דם20. ביטוי יתר של PRMTs נמצא כמאיץ גידולים וקשור לפרוגנוזה גרועה21,22. חוץ מזה, אבלציה של PRMT6 ו- PRMT7 מפעילה פנוטיפ הזדקנות תאי23. ירידה משמעותית ב-ADMA וב-PRMT1 נמצאה במהלך ההזדקנות של פיברובלסטיםWI-38 24.

האתגר הוא להבין כיצד מתילציה פועלת בתהליכים פיזיולוגיים (פתו) היא זיהוי וכימות מתילציה של ארגינין חלבון. רוב הגישות הנוכחיות משתמשות בנוגדנים כדי לזהות ארגינינים מתילטים. עם זאת, נוגדנים אלה הם עדיין ספציפיים להקשר ועלולים להיכשל בזיהוי מוטיבים שונים של חלבונים מתילציה ארגינין25,26. בפרוטוקול המתואר, ניתן לכמת את כל נגזרות הארגינין שהוזכרו לעיל באופן מהימן על ידי ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR), כלומר לבד, בשילוב, או, כמו ברוב המקרים, בתוך מטריצות ביולוגיות מורכבות כמו תאים אאוקריוטים (למשל, משמרים, עכבר או ממקור אנושי) ורקמות27, כמו גם בסרום28. עבור חלבונים ומטריצות מורכבות אלה, הידרוליזה של חלבון29 היא תנאי מוקדם ליצירת חומצות אמינו חופשיות (מותאמות), כגון ארגינין, MMA, SDMA ו- ADMA. מיצוי שלב מוצק (SPE)30 מאפשר העשרת תרכובות העניין. לבסוף, ספקטרוסקופיית H-NMR 1מאפשרת זיהוי מקביל של ארגינין וכל נגזרות המתיל העיקריות של ארגינין. ספקטרוסקופיית NMR מגיעה עם היתרון שהיא באמת כמותית, ניתנת לשחזור ברמה גבוהה, וטכניקה חזקה31,32. את מדידות התמ"א הסופיות ניתן לבצע לאחר מכן לאחר איסוף והכנת דגימות רבות. לבסוף, פרוטוקול זה מתמקד בעיקר בהכנת דגימות מכיוון שזה אינו דורש ספקטרומטר NMR משלו. זה יכול להתבצע ברוב המעבדות הביוכימיות. עם זאת, כמה רמזים על אילו מדידות ספקטרוסקופיה NMR צריך להיעשות מובאים בעבודה זו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הידרוליזה של חלבון שמרים שימשה כדגימות לתוצאות המייצגות של עבודה זו. הפרוטוקול כולו מסוכם באיור 1.

1. הכנת חומרים וריאגנטים

  1. מתנול/מים: הכינו תערובת של שני חלקים של 99% מתנול (MeOH) וחלק אחד של H 2 O, המסומן כ-MeOH/H 2 O. אחסנו MeOH טהור ו-MeOH/H2O בטמפרטורה של-20°C כדי למזער את אידוי האלכוהול ולהגביר את יציבות הדגימה.
  2. חומצה הידרוכלורית (HCl): לדלל 9 mol/L מ HCl מרוכז (12.0 mol / L או 37%) כמו גם 0.1 mol / L של HCl. התמיסה המרוכזת יותר (9 mol/L) משמשת להידרוליזה של חלבונים, ואילו התמיסה המרוכזת יותר (0.1mol/L) משמשת למיצוי בשלב מוצק.
    אזהרה: יש לעבוד בתוך מכסה האדים.
  3. הכינו תמיסה חלופית ל-SPE המכילה 10% תמיסת אמוניה רוויה (במלאי: 30% עם אמוניה), 50% מתנול ו-40% מים (v/v).
  4. מאגר NMR: להמיס 5.56 גרם של דיסודיום מימן פוספט (Na 2 HPO 4, 0.08 mol/L), 0.4 גרם של 3-(trimethylsilyl) חומצה פרופיונית-2,2,3,3-d4 מלח נתרן (TSP, 5 mmol / L), 0.04% (w/v) של נתרן אזיד (NaN3) ב 500 מ"ל של דו תחמוצת דאוטריום (D2O) ולהתאים ל- pH7.4 (באמצעות HCl או NaOH, בהתאמה) (ראה טבלת חומרים). בדוק את הטוהר של כל אצווה חיץ חדשה על ידי ספקטרוסקופיית NMR.
    הערה: כמות המזהמים (למשל, אתנול) צריכה להיות נמוכה ככל האפשר.
  5. מלא צינורות עיסה בחרוזי תחמוצת זירקוניום (צינורות 2 מ"ל וחרוזים 1.4 מ"מ מתאימים לרוב היישומים, אך קיימות גרסאות שונות) (ראה טבלת חומרים). מלאו בערך 10-20 חרוזים ביד או קנו צינורות ממולאים מראש, הזמינים גם כן.
  6. שמור פיפטות ואת הקצוות המתאימים מוכן בטווח של 10-1,000 μL.
    הערה: מים טהורים מאוד, המסומנים כ-H 2 O, המוגדרים על ידי התנגדות גבוהה של ≥18.2 MΩ·cm-1, שימשו לאורך כל העבודה. זה מתאים למים מזוקקים כפולים.

2. איסוף ואחסון דוגמאות

  1. יש להקפיא את הדגימות הנוזליות (סרום/פלזמה, תרבית תאים וכו') בחנקן נוזלי ולאחסן אותן בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש.
  2. הכינו את החומרים המוצקים כמפורט להלן.
    1. אספו את התאים מתרביות תאים (3-5 מיליון תאים) על ידי איסוף תאים דבקים, לאחר שטיפה במי מלח חוצצי פוספט קר, גירוד וצנטריפוגה, או צנטריפוגה ישירה של תאים שגדלו בתרחיף.
    2. הסר את supernatants התא (אשר עשוי להיאסף לניתוח נוסף, או על ידי מדידה ישירה רצופה, ראה שלב 6, או לאחר משקעים של חלבונים מסיסים, ראה שלב 3.1), ולאחר מכן הבזק להקפיא את הכדוריות עם חנקן נוזלי ולאחסן ב -80 ° C. לעיבוד נוסף, ראה שלב 3.2.
    3. אחסן ואסוף את הרקמות בהתאם למטרת המחקר. עבור רקמות הומוגניות מאוד, כגון הכבד או השריר, לנתח כל חלק של זה. לדוגמה, במקרה של מוח עכבר, לקבוע מתילציה גלובלית ארגינין של המוח כולו או קטעי המוח.
      הערה: המשקל האידיאלי של רקמות להיות מעובד הוא 30-60 מ"ג. רצוי להקפיא ולכתוש את המוח כולו ולהשתמש באליציטוטים ממנו. לחלופין, ניתן להשתמש בחלקי מוח ספציפיים (למשל, חזיתית, המוח הקטן, אזורים עורפיים, או חצי כדור אחד, במשקל ~ 250 מ"ג).

3. הכנת מדגם ראשוני

הערה: בצע את העבודה על קרח, תוך שמירה על MeOH קר. הדגימות חייבות להישמר גם על קרח כדי למנוע פירוק חלבון.

  1. עבור דגימות נוזליות, הוסף 400 μL של מתנול קר כקרח ל 200 μL של הדגימה. המשך לשלב 3.3.
    הערה: אם יש פחות מדגם זמין, התאם את אמצעי האחסון בהתאם; רגישות NMR היא בדרך כלל גבוהה מספיק עבור כמויות מדגם קטנות יותר, אבל צריך לבדוק בנפרד.
  2. במקרה של חומרים מוצקים, להכין מספיק צינורות 1.5 מ"ל עבור lysates (להשתמש צנטריפוגה לאחר הומוגניזציה).
    1. בזהירות, אך ביסודיות, להשהות מחדש את כדורי התא ב 600 μL של MeOH/H2O ולהעביר את כל השלב הנוזלי לתוך צינורות עיסה.
    2. הכניסו רקמות לתוך צינורות עיסה (ניתן לשקול אותן ישירות לתוך הצינורות) והוסיפו 600 μL של MeOH/H2O (עבור 30-60 מ"ג; התאימו אם המשקל שונה באופן משמעותי).
    3. הכניסו את הצינורות לתוך ההומוגנייזר של הרקמה (ראו טבלת חומרים) ובצעו הומוגניזציה פעם אחת למשך 20 שניות עם טלטול כבד (עבור כדורי תאים, רקמות רכות) או פעמיים במשך 20 שניות כל אחת (או יותר במידת הצורך) עם מרווח של 5 דקות בין לבין (עבור רקמות נוקשות).
    4. לאחר הומוגניזציה, מיד לשים דגימות על הקרח שוב ולהעביר את כל lysates לתוך צינורות חדשים 1.5 מ"ל.
  3. יש לאחסן דגימות למשך 30 דקות לפחות (עד מספר ימים) בטמפרטורה של -20°C לפני עיבוד נוסף.
  4. צנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך 30 דקות ב-4°C. בינתיים, הכינו מספיק צינורות של 1.5 מ"ל כדי לאסוף את הסופרנאטנטים.
    הערה: סופרנאטנט זה (המסומן "(1)" באיור 1) עשוי להיזרק לפח, לעבור ליופיליזציה ולעבד ישירות עבור NMR (שלב 6) או לנתח אותו בדרך אחרת.
  5. בפרוטוקול זה, משקע MeOH (= גלולה המתקבלת לאחר שלב 3.1 או 3.2.2, בהתאמה) משמש לניתוח נוסף המכיל, בין היתר, רכיבים כגון חומצות גרעין ושומנים, חלבונים מתילציה ארגינין. המשך עם הידרוליזה חלבון או לאחסן את הכדוריות ב -20 ° C במשך כמה ימים.

4. הידרוליזה של חלבון

  1. הוסף 500 μL של 9mol/L של HCl לכל דגימה. לאחר מכן, חתכו את הכובעים של כל צינור עם מספריים והכניסו אותם לצינורות תרבית הזכוכית (איור 2A). בזהירות, אך בחוזקה, סגרו את הכובעים האדומים (ובכך בדקו את האיטום).
    הערה: לפני השימוש, יש לבדוק תמיד כל איטום (רדיד PTFE אפור בתוך מכסי הברגים האדומים) להידוק נכון ולנקות אותם באופן קבוע במים.
  2. בסיום, הניחו את הצינורות בתוך מלאה חלקית בחול (להעברת חום טובה יותר) ובצעו הידרוליזה במשך כ-16 שעות בטמפרטורה של 110°C בתא ייבוש.
  3. לאחר הידרוליזה, לקרר את הדגימות (~ 1 שעות).
  4. לאחר מכן, lyophilize לילה באמצעות צנטריפוגה עם ואקום גבוה (מתחת 100 Pa).
  5. להמיס את הכדוריות - אם יבש לחלוטין (אם לא, להמשיך lyophilization) - ב 1 מ"ל של 0.1 mol / L HCl ולהוסיף 50 μL של כלורופורם (CHCl3) לכל צינור; ממיסים היטב את הגלולה עם פיפטה של 1,000 מיקרוליטר, ובכך מערבבים את הנוזלים, ולאחר מכן מעבירים את הנפח המלא לצינור חדש.
    אזהרה: יש לעבוד תמיד עם כמויות קטנות כדי למזער אידוי נרחב
  6. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 8,000 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. אספו בזהירות את השלב העליון של הנוזל הדו-פאזי שמכיל את החלק המסיס במים (איור 2B, החלק עם הצפיפות הנמוכה יותר) עם פיפטה ומלאו אותו בצינורות חדשים. השתמשו בשפופרות של 1.5 מ"ל עבור SPE ידני (סעיף 5.2) או בבקבוקוני זכוכית עבור SPE רובוטי (סעיף 5.3 ואיור 2D). הימנעו מזליגה עלCHCl 3 ותכולתו (איור 2C).

5. מיצוי בשלב מוצק (SPE)

  1. לפני השימוש הראשון, נקה את מחסניות SPE פעמיים עם 1 מ"ל של הפתרון החלופי (שלב 1.3) ואחריו צנטריפוגה ב 800 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר (ממוקם לתוך צינורות 15 מ"ל). הם יכולים לשמש 10-20 פעמים כל אחד.
  2. SPE ידני
    1. התנה מראש את המחסניות (ראה טבלת חומרים) בכל ריצה עם 1 מ"ל מתנול טהור ו- 2 x 1 מ"ל PBS, בכל פעם ולאחר מכן צנטריפוגה ב 800 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר (מונח לתוך צינורות 15 מ"ל).
    2. לאחר מכן, טען את הדגימות (משלב 4.7) על מחסניות SPE וצנטריפוץ אותם ב 600 x גרם במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. לאחר מכן, יש למרוח מחזור כביסה כמפורט להלן.
      1. הוסף שלוש פעמים 1 מ"ל של H2O (כל אחד ואחריו צנטריפוגה במשך דקה אחת ב 800 x גרם בטמפרטורת החדר).
      2. יש להוסיף חמש פעמים 1 מ"ל של 0.1 mol/L HCl (כל אחד מהם ולאחר מכן צנטריפוגה למשך דקה אחת ב 800 x גרם בטמפרטורת החדר).
      3. הוסף פעמיים 1 מ"ל של MeOH (כל אחד ואחריו צנטריפוגה במשך דקה אחת ב 800 x גרם בטמפרטורת החדר).
    4. לאחר מכן, לפלוט ארגינין ונגזרותיו עם 3 x 1 מ"ל של פתרון חלופי (ואחריו צנטריפוגה 1 דקות ב 800 x גרם בטמפרטורת החדר) לתוך צינור יחיד 15 מ"ל.
      הערה: הפתרון החלופי משמש כמקל עבור ארגינין ונגזרות ומשמש גם לניקוי המחסניות (כל החומרים נשטפים לפני ההדחה או בערך החומציות הבסיסי של התמיסה החלופית). עם זאת, כדי למנוע זיהום לאורך זמן, השימוש החוזר צריך להיות מוגבל (ראה שלב 5.1).
  3. SPE רובוטי
    הערה: כאן, רובוט פיפטינג (החלק העיקרי המורכב ממחט צנרת, תחנת שטיפה למחט, אספקת מגיב ומיקומים עבור דגימות ואלואטים, ראה טבלת חומרים) מסופק עם מחזיק מחסנית עבור עמודות SPE. עבור מכשירים אחרים, הקפד להיות מצויד באופן מלא עם כל הדברים המפורטים.
    1. מלאו את הסופרנאטנט (משלב 4.7) ישירות לתוך בקבוקוני זכוכית עם איטום PTFE (איור 2D), הכינו מספיק ריאגנטים (100 מ"ל מכל אחד, כלומר תמיסת החלפה, 99% של MeOH, PBS, H 2 O ו-0.1 של mol/L HCl), צינורות של 5 מ"ל עבור אלוציה ותמיסת שטיפה עבור המחט של הרובוט (בדרך כלל H2O).
    2. השתמש ביישום או שיטה בתוכנה של הרובוט בהתבסס בדיוק על השלבים המתוארים עבור SPE ידני (שלב 5.2).
      הערה: הפרטים עשויים להשתנות מאוד בין ספקי מכשירים, לכן עיין במדריך התוכנה של הרובוט המתאים לתכנות. רובוט פיפטינג עובד בדרך כלל על ידי הפעלת לחץ אוויר על המחסניות במקום צנטריפוגה, וזה ההבדל העיקרי. אם הפרוטוקול מבוסס ומופעל בפעם הראשונה, כלול פקדים (לדוגמה, L-ארגינין בריכוז ידוע) כדי לאמת זרימת עבודה מיטבית.

6. הכנה סופית לתמ"א

  1. דגימות Lyophilize לילה כדי יובש מוחלט להיפטר אמוניה H2O.
  2. ממיסים כל דגימה ב-500 מיקרוליטר של מאגר NMR (שלב 1.4) ומעבירים לצינורות NMR. חשוב לציין, הנפח חייב להיות זהה בכל הצינורות, והדגימות חייבות להיות הומוגניות (ללא שאריות ושומנים, הנוטים להצטבר).
    הערה: הפרטים של ספקטרוסקופיית NMR חורגים מעבר לסקירת שיטה זו ומתוארים בפירוט רב יותר במקום אחר27. כאן, רק הדרישות העיקריות ואת השלבים מוסברים. כימות הארגינין והמטבוליטים שלו מבוצעים על ספקטרומטר NMR של 600 מגה-הרץ (ראה טבלת חומרים). באופן עקרוני, ניתן להשתמש בכל עוצמות שדה אחרות של ספקטרומטר NMR/NMR, בתנאי שניתן לזהות את אותות ה-NMR של ארגינין וארגינינים שעבר מתילציה ברגישות מספקת וללא חפיפת אותות. ניתן להשתמש בכל ראש בדיקה עם שיפועים של ציר z המסוגל להקליט ספקטרום H אחד, בתנאי שרצפי הפולסים מוגדרים בהתאם.
  3. הקלט ספקטרום 1D באמצעות רצף פולסים CPMG (Carr-Purcell-Meiboom-Gill)33,34 (cpmgpr1d, 512 סריקות, גודל fid 73728, רוחב ספקטרלי של 11904.76 הרץ ב- NMR של 600 MHz, עיכוב מיחזור 4 שניות) עם דיכוי אות מים באמצעות רוויה.
  4. בניסויים אלה, הסירו את הצימודים הסקלריים של 1H על ידי ניתוק וירטואלי, ובכך הפחיתו את חפיפת האותות. הקלט נוסף עבור שאלות ספציפיות ו / או דגימות מורכבות או מטריצות, למשל, 1 H-13 C-heteronuclearSingle Quantum Coherence (HSQC) ספקטרום27.
    הערה: עבור מטריצות מורכבות יותר שבהן אותות1H NMR של ארגינינים מתילציה יכולים להיות חופפים חלקית עם אותות1 H NMR של מטבוליטים אחרים (למשל, ליזין ), 1H הומו-גרעיני J-resolved spectra (JRES)35 נדרשים.
  5. בצע כימות מוחלט על ידי שילוב עוצמות השיא בהתאמה של תקנים של ריכוז ידוע, למשל, 100 μmol / arginine.
    הערה: באופן שגרתי, ADMA, SDMA ו-MMA (ראה טבלת חומרים) מדווחים כיחס ביחס לארגינין. יש לכך יתרון משמעותי שאין צורך לבצע נורמליזציה נפרדת (למשל, מספר תאים, מסת רקמות, ריכוזי חלבונים). במקרה כזה, ארגינין משמש כסטנדרט פנימי, ודי בכימות יחסי כדי לקבל מידע רלוונטי מבחינה ביולוגית.
  6. לצורך התמיינות של SDMA ו-MMA, ליופיליזציה של הדגימות שוב כדי להיפטר מ-D2O (אם הן הושעו מחדש במאגר NMR בעבר), אשר מוחלף בדימתיל סולפוקסיד (d6-DMSO), המאפשר רזולוציה של תהודה מתיל27. לכן, לשאוף את הדגימות מן צינורות NMR עם פיפטות פסטר, lyophilize, ולהמיס אותם ב 500 μL של d6-DMSO.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

באופן שגרתי, תחזיות1 H 1D של ספקטרום NMR דו-ממדי J-resolved (JRES), כמעט מנותק, משמשות למשימות שיא וכימות במעבדה36 שלנו. איור 3 מראה ספקטרום JRES מייצג של הידרוליזה של חלבון שמרים מטוהרים באמצעות פרוטוקול SPE הנוכחי. אם כי בריכוזים שונים מאוד, ניתן להפריד ולכמת את שני החומרים במטריצה תאית. בהתבסס על מספר הפרוטונים של קבוצת המתיל הספציפית (-CH3) או מתילן (-CH2-) בשינוי הכימי המתאים, ספקטרוסקופיית H-NMR 1מאפשרת כימות מדויק. כפ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בחלק הבא, המוקד העיקרי הוא על השיטה עצמה; ההשלכות הביולוגיות של מתילציה של ארגינין מתוארות בחלק המבוא.

ראשית, רקמות בעלות נוקשות שונה עשויות להזדקק להתאמה של ליזה דגימה: תאים מתרבית תאים (כולל חיידקים, שמרים וכו') ורקמות כמו מוח, כבד צעיר, שריר חלק וכו', יכולים להיות הומוגניים במהירות. עבור רקמות בעלות קשיחות גבוהה (כולל כבד של נבדקים קשישים, עורקים, עצמות וכו '), ההומוגניזציה צריכה להיעשות פעמיים (ראה שלב 3.2.3). עם זאת, אין להמשיך בתהליך זה לעתים קרובות יותר, גם אם נותרו כמה שרידים בלתי מסיס...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

תודות

העבודה נתמכה על ידי מענקי קרן המדע האוסטרית (FWF) P28854, I3792, doc.funds BioMolStruct DOC 130, DK-MCD W1226 BioTechMed-Graz (פרויקט דגל DYNIMO), מענקי הסוכנות האוסטרית לקידום המחקר (FFG) 864690 ו- 870454, המרכז לחקר מטבוליזם אינטגרטיבי גראץ; תוכנית התשתיות האוסטרית 2016/2017, ממשלת סטיריה (Zukunftsfonds) וקרן סטארט-אפ לכישרונות ברמה גבוהה של האוניברסיטה הרפואית פוג'יאן (XRCZX2021020). אנו מודים למרכז למחקר רפואי על הגישה למתקני תרביות תאים. F.Z. הוכשר במסגרת תוכנית הדוקטורט רפואה מולקולרית, האוניברסיטה הרפואית של גראץ. Q.Z. הוכשר במסגרת תוכנית הדוקטורט מטבולית ומחלות לב וכלי דם, האוניברסיטה הרפואית של גראץ.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
15 מ"ל צינורותGreiner Bio One188271
3-(trimethylsilyl) חומצה פרופיונית-2,2,3,3-d4 מלח נתרן (TSP)Alfa AesarA1448
5 מ"ל צינורות, תמיסת אמוניה תחתונה עגולהGreiner Bio One115101
תמיסת אמוניה 32%RothA990.1
ספקטרומטר תמ"ג Bruker 600 מגה-הרץ, מצויד בראש בדיקה TXIBruker-
צנטריפוגה, בקירור, למשל 5430 REppendorf5428000010
Chloroform ≥ 99% לשנהRoth3313.1
CryocoolThermo ScientificSCC1עבור מערכת SpeedVac
תחמוצת דאוטריום (D2O)מעבדות איזוטופ קיימברידג'DLM-10-PK
דימתיל סולפוקסיד-d6 (d6-DMSO)מעבדות איזוטופ קיימברידג'DLM-6-1000
קלסרתא ייבוש9090-0018
צינורות תרבית דוראן, 13 x 100 מ"מ, GL 14, 9 מ"לVWR International212-0375
משאבת שמן ואקום עמוק אדוארדס RV5Thermo Scientific16234611חלק ממערכת SpeedVac
צינורות Eppendorf 1.5 מ"לגריינר ביו וואן616201
רובוט פיפטינג גילסון GX-241 AspecGilson Inc.
L-ארגיניןAppliChemA3675
מתנול ≥ 99%Roth8388.4
Milli-Q מים aparatusMilliporeZIQ7000T0
Oasis MCX 1 סמ"ק/30 מ"ג, 1 מ"ל מחסניותמים186000252
https://www.waters.com/waters/en_US/Waters-Oasis-Sample-Extraction-SPE-Products/ תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)LonzaLONBE17-512F
Precellys 24 רקמות הומוגנייזרברטין מכשיריםP000669-PR240-A https://www.bertin-instruments.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys24-tissue-homogenizer/
צינורות Precellys (צינורות עיסת)VWR International432-0351
Precellyse 1.4 מ"מ חרוזי תחמוצת זירקוניוםVWR International432-0356
Reacti-Therm/ReactiVap מודולי חימום, ערבוב ואידויתרמו ScientificTS-18820רוטור https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/TS-18820
לצינורות 1.5 מ"ל, FA-45-30-11Eppendorf5427753001
Savant מלכודת קירור בקירורThermo Scientific15996161חלק ממערכת SpeedVac
רכז ואקום Savant SpeedVac SPD210Thermo Scientific15906181חלק ממערכת SpeedVac; מצויד עם רוטור לצינורות 1.5 מ"ל
מכסי בורג לבקבוקוני זכוכית עם איטום PTFE, DN9Dr. R. Forche ChromatographieCT11B3011
SeasandRoth8441.3
בקבוקוני זכוכית עם חוט קצר 1.5 מ"ל, ND9Dr. R. Forche ChromatographieVT1100309
נתרן אזיד (NaN3)RothK305.1
נתרן הידרוקסיד (NaOH)VWRBDH7363-4
נתרן פוספט דו-בסיסי (Na2HPO4)VWR80731-078
TopSpin 4.0 (תוכנה)Bruker-https://www.bruker.com
&-NG-דימתילארגינין אסימטרי (ADMA)Santa Cruz Biotechnologysc-208093
ω-NG-monomethylarginine (MMA)סנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-200739A
ω-NG-NG'-דימתילארגינין סימטרי (SDMA)סנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-202235A
נוזל העברת חום26150008

מקורות

  1. Guccione, E., Richard, S. The regulation, functions and clinical relevance of arginine methylation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 642-657 (2019).
  2. Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).
  3. Lin, W. J., Gary, J. D., Yang, M. C., Clarke, S., Herschman, H. R. The mammalian immediate-early TIS21 protein and the leukemia-associated BTG1 protein interact with a protein-arginine N-methyltransferase. Journal of Biological Chemistry. 271 (25), 15034-15044 (1996).
  4. Bachand, F. Protein arginine methyltransferases: from unicellular eukaryotes to humans. Eukaryotic Cell. 6 (6), 889-898 (2007).
  5. Wang, Y. C., Li, C. Evolutionarily conserved protein arginine methyltransferases in non-mammalian animal systems. FEBS Journal. 279 (6), 932-945 (2012).
  6. Ahmad, A., Cao, X. Plant PRMTs broaden the scope of arginine methylation. Journal of Genetics and Genomics. 39 (5), 195-208 (2012).
  7. Fisk, J. C., Read, L. K. Protein arginine methylation in parasitic protozoa. Eukaryotic Cell. 10 (8), 1013-1022 (2011).
  8. Hofweber, M., et al. Phase Separation of FUS Is Suppressed by Its Nuclear Import Receptor and Arginine Methylation. Cell. 173 (3), 706-719 (2018).
  9. Chong, P. A., Vernon, R. M., Forman-Kay, J. D. RGG/RG Motif Regions in RNA Binding and Phase Separation. Journal of Molecular Biology. 430 (23), 4650-4665 (2018).
  10. Nott, T. J., et al. Phase transition of a disordered nuage protein generates environmentally responsive membraneless organelles. Molecular Cell. 57 (5), 936-947 (2015).
  11. Fong, J. Y., et al. Therapeutic targeting of RNA splicing catalysis through inhibition of protein arginine methylation. Cancer Cell. 36 (2), 194-209 (2019).
  12. Yang, Y., Bedford, M. T. Protein arginine methyltransferases and cancer. Nature Reviews Cancer. 13 (1), 37-50 (2013).
  13. Wang, S. M., Dowhan, D. H., Muscat, G. E. O. Epigenetic arginine methylation in breast cancer: emerging therapeutic strategies. Journal of Molecular Endocrinology. 62 (3), 223-237 (2019).
  14. Gulla, A., et al. Protein arginine methyltransferase 5 has prognostic relevance and is a druggable target in multiple myeloma. Leukemia. 32 (4), 996-1002 (2018).
  15. Wang, Z., Tang, W. H., Cho, L., Brennan, D. M., Hazen, S. L. Targeted metabolomic evaluation of arginine methylation and cardiovascular risks: potential mechanisms beyond nitric oxide synthase inhibition. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (9), 1383-1391 (2009).
  16. Friesen, W. J., Massenet, S., Paushkin, S., Wyce, A., Dreyfuss, G. SMN, the product of the spinal muscular atrophy gene, binds preferentially to dimethylarginine-containing protein targets. Molecular Cell. 7 (5), 1111-1117 (2001).
  17. Lee, J. H., Park, G. H., Lee, Y. K., Park, J. H. Changes in the arginine methylation of organ proteins during the development of diabetes mellitus. Diabetes Research and Clinical Practice. 94 (1), 111-118 (2011).
  18. Bulau, P., et al. Analysis of methylarginine metabolism in the cardiovascular system identifies the lung as a major source of ADMA. American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 292 (1), 18-24 (2007).
  19. Zakrzewicz, D., Eickelberg, O. From arginine methylation to ADMA: a novel mechanism with therapeutic potential in chronic lung diseases. BMC Pulmonary Medicine. 9, 5(2009).
  20. Fulton, M. D., Brown, T., Zheng, Y. G. The biological axis of protein arginine methylation and asymmetric dimethylarginine. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), (2019).
  21. Aliferis, K. A., Chrysayi-Tokousbalides, M. Metabolomics in pesticide research and development: review and future perspectives. Metabolomics. 7 (1), 35-53 (2011).
  22. Chiang, K., et al. PRMT5 Is a Critical Regulator of Breast Cancer Stem Cell Function via Histone Methylation and FOXP1 Expression. Cell Reports. 21 (12), 3498-3513 (2017).
  23. Blanc, R. S., Vogel, G., Chen, T., Crist, C., Richard, S. PRMT7 preserves satellite cell regenerative capacity. Cell Reports. 14 (6), 1528-1539 (2016).
  24. Lim, Y., Lee, E., Lee, J., Oh, S., Kim, S. Down-regulation of asymmetric arginine methylation during replicative and H2O2-induced premature senescence in WI-38 human diploid fibroblasts. Journal of Biochemistry. 144 (4), 523-529 (2008).
  25. Bhatter, N., et al. Arginine methylation augments Sbp1 function in translation repression and decapping. FEBS Journal. 286 (23), 4693-4708 (2019).
  26. Lee, Y. H., Stallcup, M. R. Minireview: protein arginine methylation of nonhistone proteins in transcriptional regulation. Molecular Endocrinology. 23 (4), 425-433 (2009).
  27. Zhang, F., et al. Global analysis of protein arginine methylation. Cell Reports Methods. 1 (2), (2021).
  28. Zinellu, A., Sotgia, S., Scanu, B., Deiana, L., Carru, C. Determination of protein-incorporated methylated arginine reference values in healthy subjects whole blood and evaluation of factors affecting protein methylation. Clinical Biochemistry. 41 (14-15), 1218-1223 (2008).
  29. Weiss, M., Manneberg, M., Juranville, J. F., Lahm, H. W., Fountoulakis, M. Effect of the hydrolysis method on the determination of the amino acid composition of proteins. Journal of Chromatography A. 795 (2), 263-275 (1998).
  30. Davids, M., et al. Simultaneous determination of asymmetric and symmetric dimethylarginine, L-monomethylarginine, L-arginine, and L-homoarginine in biological samples using stable isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 900, 38-47 (2012).
  31. Stryeck, S., Birner-Gruenberger, R., Madl, T. Integrative metabolomics as emerging tool to study autophagy regulation. Microbial Cell. 4 (8), 240-258 (2017).
  32. Vignoli, A., et al. High-throughput metabolomics by 1D NMR. Angewandte Chemie International Edition. 58 (4), 968-994 (2019).
  33. Carr, H. Y., Purcell, E. M. Effects of diffusion on free precession in nuclear magnetic resonance experiments. Physical Review. 94 (3), 630-638 (1954).
  34. Meiboom, S., Gill, D. Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation times. Review of Scientific Instruments. 29 (8), 688-691 (1958).
  35. Nagayama, K., Wuthrich, K., Bachmann, P., Ernst, R. R. Two-dimensional J-resolved 1H n.m.r. spectroscopy for studies of biological macromolecules. Biochemical and Biophysical Research Communications. 78 (1), 99-105 (1977).
  36. Stryeck, S., et al. Serum concentrations of Citrate, Tyrosine, 2- and 3- Hydroxybutyrate are associated with increased 3-month mortality in acute heart failure patients. Scientific Reports. 9 (1), 6743(2019).
  37. Zhang, F., et al. Tissue-specific landscape of metabolic dysregulation during ageing. Biomolecules. 11 (2), (2021).
  38. Zhang, F., et al. Growing human hepatocellular tumors undergo a global metabolic reprogramming. Cancers. 13 (8), (2021).
  39. Pahlich, S., Zakaryan, R. P., Gehring, H. Protein arginine methylation: Cellular functions and methods of analysis. Biochimica et Biophysica Acta. 1764 (12), 1890-1903 (2006).
  40. Habisch, H. J., et al. Neuroectodermally converted human mesenchymal stromal cells provide cytoprotective effects on neural stem cells and inhibit their glial differentiation. Cytotherapy. 12 (4), 491-504 (2010).
  41. Ibanez, G., McBean, J. L., Astudillo, Y. M., Luo, M. An enzyme-coupled ultrasensitive luminescence assay for protein methyltransferases. Analytical Biochemistry. 401 (2), 203-210 (2010).
  42. Hevel, J. M., Price, O. M. Rapid and direct measurement of methyltransferase activity in about 30min. Methods. 175, 3-9 (2020).
  43. Altincekic, N., et al. Site-specific detection of arginine methylation in highly repetitive protein motifs of low sequence complexity by NMR. Journal of the American Chemical Society. 142 (16), 7647-7654 (2020).
  44. Kaneb, H. M., Dion, P. A., Rouleau, G. A. The FUS about arginine methylation in ALS and FTLD. The EMBO Journal. 31 (22), 4249-4251 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

NMR
חקר ארגינין מתילום על ידי ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.