מאמר שיטה

טיהור של תעלות פוטנציאליות של קולטן חולף דרוזופילה אנדוגנית

1.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63260

⸱

28 בדצמבר 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Shenzhen Key Laboratory for Neuronal Structural Biology, Biomedical Research Institute, Shenzhen Peking University-The Hong Kong University of Science and Technology Medical Center

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

בהתבסס על מנגנון ההרכבה של קומפלקס החלבון INAD, בפרוטוקול זה פותחה אסטרטגיית טיהור זיקה משופרת בתוספת אסטרטגיית תחרות כדי לטהר את ערוץ ה- TRP האנדוגני Drosophila .

תקציר

פוטו-טרנסדוקציה של דרוזופילה היא אחד ממסלולי האיתות המצומדים לחלבון G המהירים ביותר הידועים. כדי להבטיח את הספציפיות והיעילות של מפל זה, תעלת הקטיון החדירה של הסידן (Ca2+), פוטנציאל הקולטן הארעי (TRP), נקשרת בחוזקה לחלבון הפיגום, D (INAD) ללא הפסקה-ללא-אחרי-פוטנציאל, ויוצרת קומפלקס גדול של חלבון איתות עם חלבון קינאז C ספציפי לעין (ePKC) ופוטנציאל פוספוליפאז Cβ/No קולטן A (PLCβ/NORPA). עם זאת, התכונות הביוכימיות של ערוץ ה- TRP של דרוזופילה עדיין אינן ברורות. בהתבסס על מנגנון ההרכבה של קומפלקס חלבוני INAD, פותחה אסטרטגיית טיהור זיקה שונה בתוספת אסטרטגיית תחרות כדי לטהר את ערוץ ה- TRP האנדוגני. ראשית, שבר ההיסטידין המטוהר (שלו) מתויג NORPA 863-1095 נקשר לחרוזי Ni ושימש כפיתיון למשיכת קומפלקס חלבון INAD אנדוגני מראש דרוזופילה הומוגנטים. לאחר מכן, גלוטתיון S-transferase (GST) מטוהר יתר על המידה מתויג TRP 1261-1275 קטע נוסף ל- Ni-beads כדי להתחרות בערוץ TRP. לבסוף, תעלת ה-TRP בסופר-נטנט הופרדה מהפפטיד המוגזם TRP 1261-1275 על ידי כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל. שיטה זו מאפשרת לחקור את מנגנון הגטינג של תעלת ה-TRP Drosophila מזוויות ביוכימיות ומבניות כאחד. את התכונות האלקטרופיזיולוגיות של תעלות TRP דרוזופילה מטוהרות ניתן למדוד גם בעתיד.

מבוא

פוטו-טרנסדוקציה היא תהליך שבו פוטונים נספגים מומרים לקודים חשמליים של נוירונים. הוא מעביר באופן בלעדי אופסינים ואת מפל האיתות המצומד לחלבון G הבא הן אצל בעלי חוליות והן אצל חסרי חוליות. ב-Drosophila, על-ידי שימוש בחמשת תחומי ה-PDZ שלה, פיגום חלבון ההשבתה-ללא-אחרי-פוטנציאל D (INAD) מארגן קומפלקס איתות סופראמולקולרי, המורכב מתעלת פוטנציאל קולטן חולף (TRP), פוספוליפאז Cβ/ללא פוטנציאל קולטן A (PLCβ/NORPA), וחלבון קינאז C ספציפי לעין (ePKC)1. היווצרותו של קומפלקס איתות סופראמולקולרי זה מבטיחה לוקליזציה תת-תאית נכונה, יעילות גבוהה וספציפיות של מכונות פוטו-טרנסדוקציה של דרוזופילה. בקומפלקס זה, ערוצי TRP רגישים לאור פועלים כאפקטים במורד הזרם של NORPA ומתווכים את זרם הסידן ואת הדה-פולריזציה של פוטורצפטורים. מחקרים קודמים הראו כי פתיחת ערוץ ה-TRP של דרוזופילה מתווכת על ידי פרוטונים, שיבוש של סביבת השומנים המקומית או כוח מכני 2,3,4. ערוץ ה- TRP של Drosophila מקיים אינטראקציה גם עם calmodulin5 ומווסת על ידי סידן על ידי משוב חיובי ושליליכאחד 6,7,8.

עד כה, מחקרים אלקטרופיזיולוגיים על מנגנון הגידור של תעלות Drosophila TRP ו-TRP דמויות TRP (TRPL) התבססו על טלאי ממברנה שנכרתה, הקלטות של תאים שלמים מפוטורצפטורים מסוג Drosophila מסוג פרא מנותקים, ותעלות הטרו-ביטוי בתאי S2, SF9 או HEK 2,9,10,11,12,13, אך לא בערוצים מטוהרים. גם המידע המבני של ערוץ ה-TRP Drosophila באורך מלא עדיין אינו ברור. על מנת לחקור את התכונות האלקטרופיזיולוגיות של חלבון מטוהר בסביבת ממברנה משוחזרת ולקבל מידע מבני של תעלת ה- Drosophila TRP באורך מלא, קבלת תעלות TRP מטוהרות באורך מלא היא הצעד הראשון הנחוץ, בדומה למתודולוגיות המשמשות במחקרי תעלות TRP של יונקים 14,15,16,17.

לאחרונה, בהתבסס על מנגנון ההרכבה של קומפלקס חלבוני INAD 18,19,20, פותחה לראשונה אסטרטגיית טיהור זיקה בתוספת תחרות כדי לטהר את תעלת ה-TRP מהומוגנטים של ראש דרוזופילה על ידי חרוזי סטרפטווידין 5. בהתחשב בקיבולת הנמוכה ובהעלות היקרה של חרוזי סטרפטווידין, מוצג כאן פרוטוקול טיהור משופר המשתמש בחלבון הפיתיון המתויג שלו ובחרוזי Ni תואמים בעלות נמוכה עם קיבולת גבוהה בהרבה. השיטה המוצעת תסייע לחקור את מנגנון ה-gating של תעלת ה-TRP מזוויות מבניות ולמדוד את התכונות האלקטרופיזיולוגיות של תעלת ה-TRP באמצעות חלבונים מטוהרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. טיהור מקטעי TRP המתויגים ב-GST ושברי NORPA המתויגים שלו

  1. לטהר את שבר TRP 1261-1275 המתויג ב-GST
    1. הפוך את pGEX 4T-1 TRP 1261-1275 פלסמיד10 לתאי Escherichia coli (E. coli) BL21 (DE3) באמצעות שיטת התמרת הלם חום CaCl2 21. לחסן מושבה בודדת ב 10 מ"ל של לוריא ברטאני בינוני (LB) ולגדול בן לילה ב 37 °C (84 °F). לאחר מכן, הגבר את 10 מ"ל של תרבות הזריעה ב-1 ליטר של LB בינוני ב-37 מעלות צלזיוס.
    2. לאחר שהצפיפות האופטית (OD600) של התאים מגיעה ל-0.5, יש לקרר את התאים ל-16°C ולהוסיף 0.1 mM איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG; ריכוז סופי) כדי לגרום לביטוי יתר של חלבון המטרה ולדגום בטמפרטורה של 16 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות.
    3. לאחר הבעת יתר, גלולה 1 ליטר של תאים בתרבית על ידי צנטריפוגה ב 3,993 × גרם במשך 20 דקות ו resuspend ב 40 מ"ל של 40 מ"ל של מאגר מלוחים (PBS) חצוף פוספט.
    4. טען את התאים המחודשים בהומוגנייזר בלחץ גבוה מקורר מראש בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לאט לאט להגדיל את לחץ הומוגנייזר ל 800 בר. פתח את ברז הכניסה ותן לתאים המוחזרים לעבור באופן מעגלי דרך שסתום עם חריצים צרים מאוד.
      הערה: התאים הומוגניים על ידי כוחות הגזירה הגבוהים הנגרמים על ידי ירידת לחץ גדולה וקוויטציה.
    5. טענו 5 מ"ל של חרוזי גלוטתיון לעמוד זרימת כבידה ושטפו את החרוזים עם 50 מ"ל של חיץ PBS בסך הכל שלוש פעמים.
    6. צנטריפוגה התא ליזט מההומוגנייזר בלחץ גבוה ב 48,384 x g. הוסיפו את הסופרנאטנט של הליסאט התא הצנטריפוגי (40 מ"ל) לחרוזי הגלוטתיון המשוזנים בעמודת זרימת הכבידה ודגרו במשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. החייאת חרוזי הגלוטתיון כל 10 דקות.
    7. לאחר 30 דקות של דגירה, פתחו את ברז היציאה של העמודה כדי להפריד בין החרוזים לשבר הזרימה. יש להשליך את שבר הזרימה. שטפו פעמיים את חרוזי הגלוטתיון הנותרים עם 50 מ"ל של מאגר PBS.
    8. מוסיפים 15 מ"ל של חיץ אלוטיון לחרוזי הגלוטתיון ודגירה למשך 30 דקות. החייאת החרוזים כל 10 דקות.
    9. לאחר 30 דקות של דגירה, הורידו את שבר TRP 1261-1275 המתויג ב-GST בצינור חרוטי של 50 מ"ל וטענו בעמודת אי-הכללת גודל (ציון הכנה), אשר משוווית באמצעות חיץ 50 mM Tris (pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT).
    10. שמור על קצב זרימת האלוטציה של עמודת אי-הכללת הגודל ל- 3 מ"ל לדקה. אספו את החלבונים החמקמקים בקצב של 5 מ"ל/שפופרת.
    11. זהה את השיא של חלבון המטרה בעמודת אי-הכללת הגודל על-ידי ניתוח אותות ספיגת ה-UV ב-280 ננומטר ואמת על-ידי ניתוח ג'ל SDS-PAGE (פרמטרים של אלקטרופורזה: 150 וולט עבור ג'ל הערימה; 200 וולט לג'ל הפירוק). הכתימו את הג'ל בכחול Coomassie R250.
    12. מרכז את שבר TRP 1261-1275 המטוהר המתויג ב-GST מעמודת אי-הכללת הגודל ל-1 מ"ל באמצעות עמודת ספין אולטרה-סינון של 15 מ"ל עם צנטריפוגה של 3,000 x g ב-4 °C בצנטריפוגה בקירור שולחנית.
    13. קבעו את ריכוז החלבון המרוכז באמצעות חוק באר-למברט. מדוד את ספיגת ה- UV של שבר TRP 1261-1275 המתויג ב- GST ב- 280 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר.
    14. קבל את מקדם ההכחדה ב-280 ננומטר על ידי ייבוא רצפי החלבונים לתוכנית Protparam (https://web.expasy.org/protparam/). בדרך כלל, תרבית 1 L של TRP 1261-1275 המתויג ב-GST מניבה 1 מ"ל של 600 מיקרומטר חלבון (6 x 10-7 מול). ראה טבלה 1 לחומרים הדרושים.
  2. טיהור קטע NORPA 863-1095 המתויג שלו
    1. הפוך את pETM.3C NORPA 863-1095 פלסמיד20 לתאי E. coli BL21 (DE3) באמצעות שיטת התמרת הלם חום CaCl21. לחסן מושבה בודדת ב 10 מ"ל של LB בינוני ולגדול בן לילה ב 37 °C (84 °F). לאחר מכן, הגבר את תרבות הזריעה של 10 מ"ל ב-1 ליטר של LB בינוני ב-37 מעלות צלזיוס.
    2. לאחר שה-OD600 של התאים מגיע ל-0.5, קררו את התאים ל-16 מעלות צלזיוס והוסיפו 0.1 mM IPTG (ריכוז סופי) כדי לגרום לביטוי יתר של חלבון המטרה ולדגירה ב-16 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות.
    3. לאחר ביטוי יתר, גלולה 1 L של תאים בתרבית על ידי צנטריפוגה ב 3,993 x g במשך 20 דקות ו resuspend ב 40 מ"ל של חיץ קשירת. לאחר מכן, lyse את התאים resuspendeded בהומוגנייזר בלחץ גבוה ב 4 °C כפי שתואר בשלב 1.1.4.
    4. טען 5 מ"ל של חרוזי Ni לתוך עמוד זרימת כבידה ושטף שלוש פעמים עם 50 מ"ל של חיץ מחייב.
    5. צנטריפוגה התא ליזט מההומוגנייזר בלחץ גבוה ב 48,384 x g. הוסף את הסופרנאטנט של התא הצנטריפוגי lysate לחרוזי Ni שיווי המשקל בעמוד זרימת הכבידה ודגירה במשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. בצעו החייאה של חרוזי ה-Ni כל 10 דקות.
    6. לאחר 30 דקות של דגירה, פתחו את ברז היציאה של העמודה כדי להפריד בין החרוזים לשבר הזרימה. יש להשליך את השבר העובר בזרימה ולשטוף את חרוזי ה-Ni הנותרים פעמיים עם 50 מ"ל של חיץ שטיפה.
    7. הוסיפו 15 מ"ל של חיץ אלוטיון לחרוזי ה-Ni ודגרו במשך 30 דקות. בצעו החייאה של חרוזי ה-Ni כל 10 דקות.
    8. לאחר 30 דקות של דגירה, אספו את קטע ה-NORPA 863-1095 המתויג שלו בצינור חרוטי של 50 מ"ל וטענו לעמודת הרחקת גודל (דרגת הכנה), המשווקת באמצעות 50 mM Tris (pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT).
    9. שמור על קצב זרימת האלוטציה של עמודת אי-הכללת הגודל ל- 3 מ"ל לדקה. אספו את החלבון הבוקע בקצב של 5 מ"ל/צינור.
    10. זהה את השיא של חלבון המטרה בעמודת אי-הכללת הגודל על-ידי ניתוח אותות ספיגת ה-UV ב-280 ננומטר ואמת על-ידי ניתוח ג'ל SDS-PAGE (פרמטרים של אלקטרופורזה: 150 וולט עבור ג'ל הערימה; 200 וולט לג'ל הפירוק). הכתימו את הג'ל באמצעות כחול Coomassie R250.
    11. מרכז את שבר NORPA 863-1095 המטוהר שלו מתויג שלו מעמודת אי-הכללת הגודל ל-1 מ"ל באמצעות עמודת ספין אולטרה-סינון של 15 מ"ל עם צנטריפוגה של 3,000 x g ב-4 °C בצנטריפוגה בקירור שולחנית.
    12. קבעו את ריכוז החלבון המרוכז באמצעות חוק באר-למברט. מדוד את קליטת ה- UV של שבר NORPA 863-1095 המתויג שלו ב- 280 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר.
    13. קבל את מקדם ההכחדה ב-280 ננומטר על ידי ייבוא רצפי החלבונים לתוכנית Protparam (https://web.expasy.org/protparam/). בדרך כלל, תרבית L אחת של שבר NORPA 863-1095 המתויג שלו מניבה 1 מ"ל של 600 מיקרומטר של חלבון (6 x 10-7 מול). ראה טבלה 2 לחומרים הדרושים.

2. הכנת ראשי דרוזופילה

  1. לאסוף זבובים בוגרים בצינורות צנטריפוגה חרוטית של 50 מ"ל באמצעות שיטת ההרדמה CO 22,23; מיד לקפוא חנקן נוזלי למשך 10 דקות ולאחסן במקפיא -80 מעלות צלזיוס.
  2. לאחר איסוף מספר מספיק של זבובים, לנער במרץ את הצינורות החרוטיים הקפואים של 50 מ"ל ביד כדי להפריד את הרגליים, הראש, הכנפיים והגוף של הזבובים. מעבירים את התערובת לשלוש מסננות נירוסטה מקוררות מראש בערימה רציפה (גודל רשת 20/30/40, בהתאמה) ומנערים את המסננות.
  3. לאחר מכן, מכיוון שהראשים אינם יכולים לעבור דרך מסננת 40 הרשתות, השתמש במברשת כדי לטאטא את ראשי הזבובים מהמסננת בת 40 הרשת, להעביר אותם לצינורות חרוטיים של 50 מ"ל ולאחסן אותם בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס.
  4. אספו ברציפות את הזבובים ואת ראשיהם ואחסנו אותם במקפיא של -80 מעלות צלזיוס עד שיגיעו לכמות הנדרשת לניסויים (0.5 גרם). בדרך כלל, כדי לאסוף 0.5 גרם של ראשים, 35 מ"ל של זבובים בצינור חרוטי 50 מ"ל נדרשים. ראה טבלה 3 לחומרים הדרושים.

3. דרוזופילה TRP טיהור ערוצי TRP

  1. שוקלים בסך הכל 0.5 גרם של ראשים ומומוגניים לחלוטין בחנקן נוזלי באמצעות הדברת טיט מקוררת מראש. ממיסים את הראשים ההומוגניים ב-10x v/w lysis buffer (5 מ"ל), דגירה בשייקר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-20,817 x g למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  2. אספו את הסופרנט בעל הספין-מטה ("20817 גרם S", איור 4) והוסיפו לו צנטריפוגה ב-100,000 x גרם למשך 60 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השתמשו בסופר-נאטאנט בעל הספין-מטה ("100,000 גרם S", איור 4) לצורך הבדיקה הבאה.
  3. הוסיפו 1 מ"ל של חרוזי Ni לעמוד זרימת הכבידה ושטפו את החרוזים ב-10 מ"ל של H2O מזוקק כפול (ddH2O) ב-4 מעלות צלזיוס בסך הכל שלוש פעמים. שיווי משקל את החרוזים עם 10 נפחי עמודים של מאגר ליזיס שלוש פעמים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  4. הוסף 500 μL של 600 μM מטוהר חלבון NORPA 863-1095 המתויג שלו (3 x 10-7 מול) לתוך עמוד ה- Ni ודגירה במשך 30 דקות ב 4 °C (4 °C). החייאת החרוזים כל 10 דקות.
  5. פתח את הקשת יציאת העמודה כדי להפריד בין החרוזים לשבר הזרימה. קח את השבר הזורם-דרך עבור ניתוח SDS-PAGE (NORPA F, איור 4). בחלק זה, חלבוני הפיתיון משותקים על חרוזי ה- Ni.
  6. שטפו את חרוזי ה-Ni ב-10 נפחי עמודים של מאגר ליזיס (10 מ"ל) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ושמרו על חלק הכביסה לניתוח SDS-PAGE (שטיפה 1, איור 4A). חזור על השלבים שלעיל ושמור את הדגימה לניתוח SDS-PAGE (Wash 2, איור 4A). בחלק זה, חלבוני הפיתיון המופרזים על חרוזי ה- Ni מוסרים.
  7. הוסף את ה-supernatant של ראש Drosophila homogenate לאחר צנטריפוגה של 100,000 x g לתוך עמודת ה-Ni ב-4 °C, שם השתתק קטע ה-NORPA 863-1095 המתויג שלו.
  8. דגירה של הסופרנאטנט עם חרוזי ה- Ni בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. החייאת החרוזים כל 10 דקות. לאחר מכן, פתח את ההקשה על שקע העמודה כדי להפריד בין החרוזים לשבר הזרימה.
  9. אסוף את ה-supernatant לניתוח SDS-PAGE (Dro head lysis F, איור 4A). בחלק זה, קומפלקסי החלבון INAD (INAD/TRP/ePKC) בהומוגנטים הראשיים נלכדים על ידי שברי NORPA 863-1095 המשותקים על חרוזי Ni.
  10. שטפו את חרוזי ה-Ni ב-10 נפחי עמודים של מאגר ליזיס (10 מ"ל) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ושמרו על ה-supernatant מפני משקעי כוח הכבידה לצורך ניתוח SDS-PAGE (Wash 3, איור 4A). חזור על השלבים שלעיל ואסוף את חומר העל לניתוח SDS-PAGE (שטיפה 4, איור 4A). בחלק זה, החלבונים הלא מאוגדים על חרוזי Ni מוסרים.
  11. הוסף 500 μL של 600 μM של חלבון TRP 1261-1275 המתויג ב- GST (3 x 10-7 מול) לתוך חרוזי Ni ואינקובציה למשך 20 דקות ב- 4 °C (4 °C ). החייאת החרוזים כל 10 דקות.
  12. אספו את השבר הסמוי מעמודת הכבידה (TRP E1, איור 4B), המכילה את תעלת ה-TRP האנדוגנית Drosophila . חזור על השלבים שלעיל ואסוף את שבר האלוהות (TRP E2, איור 4B). בשלב זה, על ידי שימוש בשברי TRP 1261-1275 המתויגים ב-GST כמתחרה, ערוצי ה-TRP מתרחקים מקומפלקסי החלבון INAD שנלכדו (INAD/TRP/ePKC) על חרוזי ה-Ni.
  13. לשטוף את חרוזי Ni עם 10 נפחי עמודים של מאגר כריכה (10 מ"ל; טבלה 1) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ואסוף את שבר הכביסה לניתוח SDS-PAGE (שטיפה 5, איור 4B).
  14. הוסף 500 μL של מאגר elution (טבלה 1) לתוך חרוזי Ni ודגירה במשך 20 דקות ב 4 °C (74 °F). אסוף את שבר ההתרוממות מעמודת זרימת הכבידה (NORPA E1, איור 4B). חזור על השלבים שלעיל, ואסוף את שבר ההתרוממות (NORPA E2, איור 4B).
  15. באמצעות חיץ האלוהות, התרחקו מקטע NORPA 863-1095 המתויג שלו, המלווה בקומפלקסים של חלבוני INAD/ePKC. לאחר מכן, החיזרו את חרוזי ה-Ni ב-500 μL של מאגר קשירה.
  16. קחו לדוגמה את חרוזי ה-Ni המחודשים כדי להריץ את ה-SDS-PAGE (המוכתמים על-ידי Coomassie Blue R250) כדי לנתח את היעילות של ה-elution ולהעריך אם המאגר הגנוז עובד (חרוזים, איור 4B). ראה טבלה 4 לחומרים הדרושים.

4. טיהור עמודת אי-הכללת גודל של ערוץ TRP Drosophila

  1. התקן עמודת אי-הכללת גודל (כיתה אנליטית) במערכת טיהור החלבונים. אזן את העמודה עם מאגר העמודות (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, 0.75 mM DDM), המסונן על ידי מסנן 0.45 מיקרומטר.
  2. מרכז את שבר ה-TRP E1 וה-E2 משלב 3.14 באמצעות עמודת ספין אולטרה-סינון של 4 מ"ל, עם צנטריפוגה של 3,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס בצנטריפוגה מקוררת.
  3. שטפו את לולאת הדגימה עם מאגר העמודות וטענו את הדגימה ללולאת הדגימה. הזריקו את הדגימה לעמודת אי-הכללת הגודל והוסיפו לחלבונים קצב זרימה תקין (0.5 מ"ל/דקה).
  4. זהה את שיא חלבון המטרה על ידי ספיגה של 280 ננומטר והפעל ג'ל SDS-PAGE כדי לזהות את תעלת ה-TRP האנדוגנית המטוהרת Drosophila TRP (איור 5). ראה טבלה 5 לחומרים הדרושים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

במאמר זה, שיטת טיהור חלבונים מוכחת כדי לטהר את ערוץ ה-TRP האנדוגני Drosophila (איור 1).

ראשית, ביטוי וטיהור חלבונים רקומביננטיים מיושמים כדי להשיג את הפיתיון ואת החלבונים המתחרים. לאחר מכן, מקטע TRP 1261-1275 המתויג ב-GST מבוטא בתאי E. coli BL21 (DE3) במדיום LB ומטוהר באמצעות חרוזי גלוטתיון ועמודת אי-הכללת גודל (איור 2). הדגימות אומתו באמצעות ניתוח SDS-PAGE עם צביעת R250 כחולה של Coomassie. בתהליך הכנת הדגימה של SDS-...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

INAD, המכיל חמישה תחומי PDZ, הוא מארגן הליבה של מכונות פוטו-טרנסדוקציה של דרוזופילה. מחקרים קודמים הראו כי INAD PDZ3 נקשר לזנב מסוף C של ערוץ TRP עם ספציפיות מעודנת (KD = 0.3 μM)18. INAD PDZ45 טנדם מקיים אינטראקציה עם שבר NORPA 863-1095 עם זיקת קשירה גבוהה במיוחד (KD = 30 ננומטר). ממצאים אלה מספקים בסיס ביוכימי מוצק לתכנון טיהור הזיקה בתוספת אסטרטגיית התחרות, המאפשרת למקטע NORPA CC-PBM לשמש כפיתיון הנשלף, בעוד שזנב מסוף TRP C (שבר 1261-1275) מתפקד כריאגנט תחרותי. לכן...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '31870746), מענקי מחקר בסיסיים של שנזן (JCYJ20200109140414636), והקרן למדעי הטבע של מחוז גואנגדונג, סין (מס '2021A1515010796) ל- W. L. אנו מודים ל-LetPub (www.letpub.com) על עזרתה הלשונית במהלך הכנת כתב יד זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<זנים חזקים>חיידקים
BL21(DE3) תאים מוסמכיםNovagen69450ביטוי יתר של חלבון
<חזק>מודלים של ניסוי
D.melanogaster: זן W1118 מרכזמניות בלומינגטון דרוזופילהBDSC:3605Drosophila ראש הכנה
<חזק>חומר
20/30/40 רשת נירוסטה מסננותג'יופנג רשת מתכת ג'יופנג GB/T6003.1Drosophila ראש הכנת
30% אקרילאמיד-N,N′-Methylenebisacrylamide(29:1)LableadA3291SDS-PAGE הכנת ג'ל
אמוניום פרסולפטInvitrogenHC2005SDS-PAGE הכנת ג'ל
מעכב פרוטאז קוקטייל מעכבפרוטאז Roche05892953001מעכב פרוטאז
Coomassie כחול מבריק R-250Sangon BiotechA100472-0025SDS-PAGE מכתים ג'ל
DL-Dithiothreitol (DTT)Sangon BiotechA620058-0100הכנת
מאגר עמודות אי הכללה בגודל-אי הכללהEthylenediaminetetraacetic חומצה מלח דיסודיום (EDTA)Sangon BiotechA500838-0500הכנת מאגר עמודות אי הכללה בגודל
גליציןסנגון ביוטקA610235-0005SDS-PAGE הכנת מאגר
גלוטתיון ספרוז 4 חרוזי זרימה מהירהCytiva17513202כרומטוגרפיה זיקה
ImidazoleSangon BiotechA500529-0001מאגר אלוטיון הכנה ל-Ni-column
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)Sangon BiotechA600168-0025אינדוקציה של ביטוי יתר של חלבון
אבקת מרק LBSangon BiotechA507002-0250E.coli. תרבית תאים
L-גלוטתיון מופחת (GSH)Sigma-aldrichG4251-100Gהכנת מאגר אלוטיון לחרוזי
גלוטתיוןחרוזי אקסל Ni-SepharoseCytiva17371202כרומטוגרפיה זיקה
N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM)Sangon BiotechA610424-001חומר ניקוי לטיהור חלבונים
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)Sigma-aldrichT9281-100MLSDS-PAGE הכנת ג'ל
PBSSangon BiotechE607008-0500מאגר הומוגניזציה לתאי E.coli.
PMSFLableadP0754-25Gמעכב פרוטאז
סמן חלבון צבוע מראשThermo Scientific26619/26616סולם חלבון צבוע
מראש עמודת אי הכללה בגודל (דרגת הכנה)Cytiva28989336HiLoad 26/60 Superdex 200 עמודת PG
עמודת אי הכללה בגודל (דרגה אנליטית)Cytiva29091596Superose 6 הגדלת עמודה 10/300 GL
נתרן כלוריסנגון ביוטקA501218-0001הכנת חוצץ לטיהור חלבון
נתרן דודציל סולפט (SDS)סנגון ביוטקA500228-0001SDS-PAGE הכנת ג'ל/בופר
טריס בסיססיגמא-אלדריךT1503-10KGהכנת מאגר לטיהור חלבון
ספין אולטרה-סינון עמודהMilliporeUFC901096/801096ריכוז חלבון
<חזק>ציוד
מאזן אנליטיDENVERAPX-60Metage של Drosophila head
צנטריפוגה בקירור במהירות גבוהה לצינורות צנטריפוגה חרוטית של 15 מ"ל ו50 מ"לEppendorf5810Rריכוז חלבון
צנטריפוגה בקירור במהירות גבוהה 1.5 מ"ל צינורות צנטריפוגהEppendorf5417Rשל Drosophila ראש ליזאט לאחר הומוגניזציה
עמוד זרימת כבידה ריק (קוטר פנימי = 1.0 ס"מ)Bio-Rad738-0015טיהור חלבון TRP
עמוד זרימת כבידה ריק (קוטר פנימי = 2.5 ס"מ)Bio-Rad738-0017טיהור פיתיון וחלבון מתחרה ממערכת תיעוד E.coli.
GelBio-RadUniversal Hood II Gel Doc XR SystemSDS-PAGE הדמיה
צנטריפוגה מקוררת במהירות גבוההבקמן קולטרAvanti J-26 XPצנטריפוגה של E.coli. תאים/ליזאט תאים
הומוגנייזר בלחץ גבוהUNION-BIOTECHUH-05הומוגניזציה של תאי E.coli.
מיכל חנקן נוזליTaylor-WhartonCX-100Drosophila head הכנת
מערכת טיהור חלבוניםCytivaAKTA מקררלטיהור חלבון
(-80° ג)תרמו900GPem>הכנת ראש דרוזופילה ראש
ספקטרופוטומטרMAPADAUV-1200OD600 מדידת תאים E.coli.
ספקטרופוטומטרThermo ScientificNanoDrop 2000cקביעת ריכוז החלבון
אולטרה-צנטריפוגהבקמן קולטראופטימה XPN-100 אולטרה-צנטריפוגהאולטרה-צנטריפוגה
מטהר <

מקורות

  1. Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
  2. Huang, J., et al. Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors. Current Biology: CB. 20 (3), 189-197 (2010).
  3. Chyb, S., Raghu, P., Hardie, R. C. Polyunsaturated fatty acids activate the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL. Nature. 397 (6716), 255-259 (1999).
  4. Hardie, R. C., Franze, K. Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors. Science. 338 (6104), 260-263 (2012).
  5. Chen, W., et al. Calmodulin binds to Drosophila TRP with an unexpected mode. Structure. 29 (4), 330-344 (2021).
  6. Hardie, R. C. Effects of intracellular Ca2+ chelation on the light response in Drosophila photoreceptors. Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 177 (6), 707-721 (1995).
  7. Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo. Cell. 91 (3), 375-383 (1997).
  8. Hardie, R. C., Minke, B. Phosphoinositide-mediated phototransduction in Drosophila photoreceptors: the role of Ca2+ and trp. Cell Calcium. 18 (4), 256-274 (1995).
  9. Delgado, R., et al. Light-induced opening of the TRP channel in isolated membrane patches excised from photosensitive microvilli from Drosophila photoreceptors. Neuroscience. 396, 66-72 (2019).
  10. Lev, S., Katz, B., Minke, B. The activity of the TRP-like channel depends on its expression system. Channels (Austin). 6 (2), 86-93 (2012).
  11. Hardie, R. C., Raghu, P. Activation of heterologously expressed Drosophila TRPL channels: Ca2+ is not required and InsP3 is not sufficient. Cell Calcium. 24 (3), 153-163 (1998).
  12. Gutorov, R., et al. Modulation of transient receptor potential C channel activity by cholesterol. Frontiers in Pharmacology. 10, 1487(2019).
  13. Yagodin, S., et al. Thapsigargin and receptor-mediated activation of Drosophila TRPL channels stably expressed in a Drosophila S2 cell line. Cell Calcium. 23 (4), 219-228 (1998).
  14. Guo, W., Chen, L. Recent progress in structural studies on canonical TRP ion channels. Cell Calcium. 83, 102075(2019).
  15. Li, X., Fine, M. TRP channel: The structural era. Cell Calcium. 87, 102191(2020).
  16. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
  17. Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms. Nature. 504 (7478), 113-118 (2013).
  18. Liu, W., et al. The INAD scaffold is a dynamic, redox-regulated modulator of signaling in the Drosophila eye. Cell. 145 (7), 1088-1101 (2011).
  19. Ye, F., Liu, W., Shang, Y., Zhang, M. An exquisitely specific PDZ/target recognition revealed by the structure of INAD PDZ3 in complex with TRP channel. Structure. 24 (3), 383-391 (2016).
  20. Ye, F., et al. An unexpected INAD PDZ tandem-mediated plcβ binding in Drosophila photo receptors. eLife. 7, (2018).
  21. Rahimzadeh, M., Sadeghizadeh, M., Najafi, F., Arab, S., Mobasheri, H. Impact of heat shock step on bacterial transformation efficiency. Molecular Biology Research Communications. 5 (4), 257-261 (2016).
  22. Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, S. Drosophila: A laboratory handbook. Second Edition. 80 (2), The Quarterly Review of Biology. (2005).
  23. Nicolas, G., Sillans, D. Immediate and latent effects of carbon dioxide on insects. Annual Review of Entomology. 34 (1), 97-116 (1989).
  24. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
  25. Hellmich, U. A., Gaudet, R. Structural biology of TRP channels. Handbook of Experimental Pharmacology. 223, 963-990 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

TRPINADCryo EM

מאמרים קשורים