Method Article

בידוד ואפיון של פיקוביליזום שלם בציאנובקטריה

DOI:

10.3791/63272

⸱

November 10th, 2021

 , 
1Department of Life Science, National Taiwan University, 2Institute of Plant Biology, National Taiwan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול הנוכחי מפרט את הבידוד של phycobililisomes מציאנובקטריה על ידי צנטריפוגציה באמצעות שיפוע צפיפות סוכרוז בלתי פוסק. השברים של phycobilisomes שלמים מאושרים על ידי ספקטרום פליטה פלואורסצנטי 77K וניתוח SDS-PAGE. שברי הפיזיקוביליוזום המתקבלים מתאימים להכתמה שלילית של TEM וניתוח ספקטרומטריית מסה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ב ציאנובקטריה, phycobilisome הוא קומפלקס חלבון אנטנה חיוני אשר קוצר אור ומעביר אנרגיה למערכות פוטו-מערכת I ו- II עבור פוטוכימיה. לימוד המבנה וההרכב של phycobilisome הוא עניין רב למדענים כי זה חושף את האבולוציה ואת הסטייה של פוטוסינתזה ציאנובקטריה. פרוטוקול זה מספק שיטה מפורטת וממוטבת לשבירת תאים ציאנובקטריאליים בעלות נמוכה על ידי מקצף חרוזים ביעילות. לאחר מכן ניתן לבודד את הפיזיקוביליוזום השלם מתמצית התא על ידי אולטרה-צנטריפוגציה הדרגתית של סוכרוז. שיטה זו הוכיחה שהיא מתאימה הן לדגם והן לציאנובקטריה שאינה מודל עם סוגי תאים שונים. הליך שלב אחר שלב מסופק גם כדי לאשר את השלמות והרכוש של phycobiliproteins על ידי ספקטרוסקופיית פלואורסצנטיות 77K ו- SDS-PAGE מוכתם על ידי אבץ גופרתי וכחול קומאסי. phycobilisome מבודד יכול גם להיות נתון ניתוחים מבניים נוספים קומפוזיציה. בסך הכל, פרוטוקול זה מספק מדריך התחלה מועיל המאפשר לחוקרים שאינם מכירים ציאנובקטריה לבודד ולאפיין במהירות פיקוביליזום שלם.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Phycobilisome (PBS) הוא קומפלקס ענק של חלבון פיגמנט מסיס במים המתחבר לצד הציטופלסמי של מערכות הפוטו-מערכות בממברנות התילקואידיות של ציאנובקטריה1. PBS מורכב בעיקר מפיקוביליפרוטאינים צבעוניים וחלבוני מקשר חסרי צבע1,2. את phycobiliproteins ניתן לחלק לארבע קבוצות עיקריות: phycoeryththrin, phycoerythrocyanin, phycocyanin, ו allophycocyanin3. ארבע הקבוצות העיקריות סופגות אורכי גל שונים של אנרגיית אור בטווח של 490-650 ננומטר, אשר כלורופילים ספגו בצורה לא יעילה3. ה-PBS יכול לשמש כאנטנה לקצירת אור לאיסוף אנרגיית אור ולהעברתה ל-Photosystem

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Synechocystis sp. PCC 6803, זן עמיד לגלוקוז מודל, הושג מד"ר צ'ו, סיו-אן באקדמיה סיניקה, טייוואן. Leptolyngbya sp. JSC-1, חוט שאינו מודל, הושג מד"ר דונלד א בראיינט באוניברסיטת פנסילבניה סטייט, ארה"ב.

1. תרבית תאים וקציר

  1. לחסן תאי Syn6803 או JSC-1 באמצעות לולאת חיסון מתכתית לתוך בקבוק חרוט 100 מ"ל המכיל 50 מ"ל של B-HEPES medium28. תרבית את התאים ב 30 °C תחת 50 μmol פוטונים m-2 s-1 (LED אור לבן) ב 1% (v /v) CO2 עם ערבוב מתמיד על ידי מערבל מגנטי (120 סל"ד) עד התרבות מגיעה לשלב צמיחה באמצע מעריכי (OD750 = 0.6-0.8).
    הערה: לקצור את תר....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי Syn6803 ו- JSC-1 טופחו בבקבוקונים חרוטיים עם ערבוב מתמיד במדיום B-HEPES בטמפרטורה של 30 °C (תחת אור לבן LED (50 מיקרומול פוטונים m-2s-1) בתא צמיחה מלא 1% (v / v) CO2. בשלב הצמיחה המעריכית (OD750 = ~ 0.5), התאים היו תת-תרבותיים למדיום טרי עם OD750 צפיפות אופטית סופית = ~ 0.2. לאחר שהגיעו לשלב הצמיחה המעריכית המאוחרת (OD750 = 0.6-0.8), התרבויות נאספו וצנטריפוגות (10,000 x גרם בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות). הסופר-ננט הושלך, וכדורי התא אוחסנו בטמפר.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה וסטנדרטית לבידוד PBS שלם בשני סוגים של ציאנובקטריה, דגם חד-תאי Syn6803, ו- JSC-1 שאינו דגם סיב. השלבים הקריטיים של הפרוטוקול הם הומוגניזציה של תאים ו ultracentrifugation על שיפוע צפיפות רציפה של סוכרוז. בדרך כלל, ההפרעה של תאים נימיים היא מסובכת יותר מאשר אלה חד תאיים. הגדלת כמות החומר ההתחלתי (המשקל הרטוב של גלולה התא) ואת החזרה של מכות חרוזים היו מועילים כדי להגדיל את התשואה של PBS מתאי ציאנובקטריאליים נימים. עבור ציאנובקטריום נימי, JSC-1, שלוש פעמים יותר תאים שימשו מאשר אחד חד תאי, Syn6803........

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין עניין מתחרה.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לטכנולוגיה קומונס, המכללה למדעי החיים, אוניברסיטת טייוואן הלאומית על השימוש הנוח של ultracentrifuge. הזנים הציאנובקטריאליים Synechocystis sp. PCC 6803 ו Leptolyngbya sp. JSC-1 היה מחונן ד"ר צ'ו, סיו-אן באקדמיה סיניקה, טייוואן, וד"ר דונלד א בראיינט באוניברסיטת מדינת פנסילבניה, ארה"ב, בהתאמה. עבודה זו מומנה על ידי משרד המדע והטכנולוגיה (טייוואן) (109-2636-B-002-013- ו-110-2628-B-002-065-) ומשרד החינוך (טייוואן) תוכנית המחקר הצעיר של יושן (109V1102 ו-110V1102).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 מ"מ חרוזי זכוכיתBioSpec11079101למיצוי PBS
13 מ"ל צינור צנטריפוגההיטאצ'י13PAאולטרה צנטריפוגה
40 מ"ל צינור צנטריפוגההיטאצ'י40PAאולטרה צנטריפוגה
חומצה אצטיתMerck8.1875.2500עבור Coomassie כחול מכתים
B-HEPES בינונימדיום ציאנובקטריאלי שונה ממדיום BG-11
כחול מבריק R-250SigmaB-0149לצביעה כחולה של Coomassie
כחול ברומופנולWako תעשיות כימיות טהורות2-291מאגר טעינת חלבון
איזון אלקטרוניRadwagWLC 2/A2/C/2למדידת משקל רטוב של כדורי תאים
ספקטרופוטומטר פלואורסצנטיהיטאצ'יF-7000ספקטרופוטומטר
גליצרולBioShopGly001.500מאגר העמסת חלבון
צנטריפוגה מקוררת במהירות גבוההHitachiCR22Nלהחלפת חיץ
Leptolyngbya sp. JSC-1מד"ר דונלד א. בראיינט מאוניברסיטת פנסילבניה, ארה"ב.
אביזר למדידת טמפרטורה נמוכההיטאצ'י5J0-0112האביזר כולל מיכל Dewar שקוף לספקטרוסקופיה פלואורסצנטית של 77K.
מתנולMerck1.07018,2511עבור Coomassie כחול מכתים
מיקרוצנטריפוגהתרמו פישרפיקו 21עבור PBS מיצוי
Mini-Beadbeater-16BioSpecדגם 607עבור PBS מיצוי
אשלגן פוספט dibasicPanReac AppliChem121512.121עבור מיצוי PBS
אשלגן פוספט מונו-בסיסיPanReac AppliChem141509.121למיצוי PBS
בקבוקון מכסה בורגBioSpec10832למיצוי PBS
SmartView Pro Imagerמדע עיקריUVCI-2300לזיהוי אותות צביעת Znic
נתרן דודציל סולפטZymesetBSD101מאגר טעינת חלבון
סוכרוזZymesetBSU101לבידוד
PBSSynechocystis sp. זן עמיד לגלוקוז PCC 6803מאת ד"ר צ'ו, Hsiu-An באקדמיה סיניקה, טייוואן
TrisBioShopTRS 011.1מאגר טעינת חלבון
Triton X-100BioShopTRX 506.500למיצוי PBS
מסנן צנטריפוגלי ממברנה אולטרה 10 KMilliporeUFC901024להחלפת
חיץמסנן צנטריפוגלי ממברנה אולטרה 3 KMilliporeUFC500324להחלפת חיץ
אולטרה-צנטריפוגההיטאצ'יCP80WXאולטרה-צנטריפוגה
ספקטרופוטומטר UV / VisAgilentCary 60ספקטרופוטומטר
אבץ גופרתיPanReac AppliChem131787.121לצביעה Znic
ובטא;-MercaptoethanolBioBasicמאגר טעינת חלבוןMB0338

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bryant, D. A., Guglielmi, G., de Marsac, N. T., Castets, A. M., Cohen-Bazire, G. The structure of cyanobacterial phycobilisomes: A model. Archives of Microbiology. 123 (2), 113-127 (1979).
  2. Glazer, A. N. Phycobilisomes: Structure and dynamics. Annual Review of Microbiology.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Phycobilisome IsolationCyanobacteriaSucrose GradientUltracentrifugationBead BeaterPhycobiliproteinsSDS PAGE77K FluorescenceCell LysisProtein Composition

Related Articles