מאמר שיטה

שיטות In Vitro ו-In Vivo לחקר Megakaryopoiesis

704 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63286

⸱

17 בנובמבר 2021

 ,  , 
1Université de Strasbourg, INSERM, EFS Grand Est, BPPS UMR-S 1255, FMTS, F-67065 Strasbourg, France

במאמר זה

תקציר

מאמרים שנדונו:

1. Pongerard, A., Mallo, L., Gachet, C., Lanza, F., Strassel, C. תאי CD34+ שמקורם במסנני Leukodepletion כמקור תאים לחקר התמיינות מגקריוציטים והיווצרות טסיות דם. כתב העת לניסויים חזותיים: JoVE. (171), e62499 (2021).

2. Kimmerlin, Q., Tavian, M., Gachet, C., Lanza, F., Brouard, N. בידוד של אבות מגקריוציטים של עכברים. כתב העת לניסויים חזותיים: JoVE. (171), e62498 (2021).

3. בושר, ג'יי, גאצ'ט, ק., לנזה, פ., לאון, ג. תרבית מגקריוציטים בהידרוג'ל מבוסס מתיל צלולוז תלת מימדי לשיפור הבשלת התאים ולחקר השפעת הנוקשות והכליאה. כתב העת לניסויים חזותיים: JoVE. (171), e62511 (2021).

4. סקנדולה, סי., לנזה, פ., גאצ'ט, סי., אקלי, א. חקר באתרו של מגה-קריופואזיס של עכברים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. כתב העת לניסויים חזותיים: JoVE. (171) e62494 (2021).

5. Guinard, I., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C., Eckly, A. דינמיקת היווצרות Proplatelet של צמחי מח עצם טריים של עכברים. כתב העת לניסויים חזותיים: JoVE. (171), e62501 (2021).

6. Bornert, A., Pertuy, F., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C. הדמיה דו-פוטונית in vivo של מגקריוציטים ופרוטסטלטים במח עצם הגולגולת של העכבר. כתב העת לניסויים חזותיים: JoVE. (171), e62515 (2021)

מאמר מערכת

טסיות דם הן תאי דם קטנים וחסרי גרעין, החיוניים להמוסטזיס, הנובעים ממגקריוציטים (MKs) במח העצם (BM). במהלך התמיינותם מתאי גזע המטופויאטיים, MKs מתפתחים לתאי ענק בתהליך מורכב של התמיינות והתבגרות הכולל פוליפלואידיזציה והתבגרות ציטופלזמית. בשלב הסופי של ההתפתחות, כאשר חברי הכנסת נמצאים במגע עם תאי אנדותל, הם משיגים את השלב הבוגר שלהם ומרחיבים שלוחות ציטופלזמיות ארוכות, הנקראות פרוטסטלטים, לתוך כלי הדם, אשר לאחר מכן מתפרקים כדי להוליד טסיות דם בזרם הדם 1,2. המנגנונים המווסתים את התבגרות MK והיווצרות פרוטסטלט טרנסאנדותל עדיין אינם מובנים לחלוטין. מטרת האוסף היא להפגיש שיטות משלימות שיתרמו להבנה טובה יותר של הביולוגיה של חברי הכנסת במבחנה וב-vivo.

הרחבה והתמיינות במבחנה של MKs נמצאת בשימוש נרחב לחקר המנגנונים העומדים בבסיס ביוגנזה של טסיות דם. בפרוטוקול של Pongerard et al., המחברים מתארים פרוטוקול תרבית סטנדרטי להבחנה של MKs מאבות המטופויאטיים של CD34+ אנושיים. הם מדגישים במיוחד כי מסנני לויקוציטים הזמינים במרכזי הדם הם מקור יוצא דופן לאיסוף תאי CD34+. המאמר שלהם מכיל מספר הנחיות חיוניות כיצד לחלץ תאי CD34+, כיצד להעריך את טוהרם ואת חשיבות צפיפות הזריעה שלהם. המחברים מציעים גם שיטת פיפטינג מכוילת, חמש פעמים ברציפות, כדי לשחרר ביעילות טסיות פונקציונליות. יישומים מעניינים של שיטה זו הם האפשרות להעריך תרכובות פרמקולוגיות או לבצע מניפולציה גנטית של תאי CD34+ באמצעות שיטת עריכת גנום CRISPR-Cas9 3,4. עבור מחקרי עכברים, Kimmerlin et al. מציגים אסטרטגיית מיון תאים לטיהור אבות MK במספרים מספיקים התואמים לבדיקות מולקולריות ותאיות. המחברים דנים ביתרונות של שימוש בסמל הכסל כמקור למח עצם המכיל מספר רב של אבות המטופויאטיים וביצוע דלדול מגנטי דו-שלבי של תאים לא רצויים לפני מיון התאים באמצעות שילוב של סמני פני התא. יתרון מרכזי של שיטה זו הוא הפחתת מספר בעלי החיים הנדרשים להשגת אבות MK מטוהרים מאוד, אשר, למשל, עשויים לעניין חוקרים החוקרים את ההיררכיה של אבות המטופויאטיים ואת הבידול שלהם. בהקשר זה, בושר ועמיתיו מתארים שיטה לגידול אבות במדיום תלת מימדי המורכב מ-2% מתיל צלולוז כדי לחקות טוב יותר את הסביבה in vivo. למעשה, מחברים אלה הראו בעבר כי MKs הגדלים בהידרוג'ל תלת מימדי משיגים מצב התבגרות טוב יותר ויכולת גדולה יותר ליצור אבות בהשוואה לאלו הגדלים במדיום נוזלי5. שלבים קריטיים מודגשים בפרוטוקול זה כגון הנפח המתאים של מתיל צלולוז להשגת קשיחות בינונית אופטימלית, מספר התאים שצריך להיות שווה ערך בכל תנאי ניסוי והסיכון לזיהום. לצורך אימות תפקודי של רמת ההתבגרות, המחברים מסבירים כיצד להשעות את התאים בתרבית ג'ל במדיום נוזלי ביום השלישי לתרבית וכיצד לתקן את התאים לניתוח עתידי על ידי צביעה חיסונית, ציטומטריית זרימה או מיקרוסקופ אלקטרונים. מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM) היא גישת ההדמיה הנבחרת כדי לספק אולטרה-מבנה ברזולוציה גבוהה של חברי כנסת. כאן, סקנדולה ועמיתיו חולקים פרוטוקול לניתוח המבנה האולטרה-מבני של חברי כנסת בסביבת ה-BM הטבעית שלהם, ולכמת את צפיפות התאים שלהם ולדרג את שלבי ההתבגרות השונים. המחברים משתמשים ב-TEM כדי לנתח את האירועים התאיים המתרחשים כאשר MKs מקיימים אינטראקציה עם הדופן הסינוסואידית, כגון הבליטות הפולשניות הקצרות דמויות הפודוזום שלהם החודרות לאנדותל6. מגבלה של השיטה היא שלא ניתן לנתח את השלב הראשוני של מעורבות MK בגלל היעדר תכונות אולטרה-מבניות ספציפיות של תאים לא בשלים אלה. כאמור, לגישת הדמיה זו יש יתרון בשימוש בדגימות BM קטנות המאפשרות לבצע מספר מחקרים עם עכבר יחיד. כדוגמה, ניתן להשתמש בדגימות מח העצם האחרות לטכניקת הוצאת מח העצם המוצגת באוסף זה על ידי Guinard et al. כדי לחקור את ההרחבה הדינמית של פרוטסטלטים מ-MKs. כוחה של שיטה זו טמון בשימוש בחברי כנסת שהתפתחו ב-BM, ובכך נמנע כל פרשנות שגויה פוטנציאלית הנובעת מממצאים של התמיינות תאים בתרבית. ואכן, זה תועד בעבר בעכברים עם השבתת MYH9 מוגבלת MK, שם נמצאו תוצאות שונות במבחנה וב-ex vivo7. המחברים גם מדגישים את האופי הפשוט, הניתן לשחזור והמהיר של גישה זו. הערה מעניינת של הפרוטוקול שלהם היא היכולת להשתמש במיקרוסקופים המצוידים בתוכנת ניווט כדי להקל על מעקב/כימות של MKs המרחיבים את הפרופלטלטים. שיטה משלימה של מודל האקספלנט היא הדמיה דו-פוטונית של MKs בגולגולת העכבר. הייחודיות של טכניקה זו היא היכולת לחקור in vivo את ההתנהגות הדינמית של MKs המסומנים פלואורסצנטית במח העצם ולדמיין את הארכת הטסיות. לפרוטוקול זה יש יתרון בכך שהוא זעיר פולשני, עם התערבויות כירורגיות מוגבלות, ובכך נמנע מתגובות דלקתיות שדווחו כמשפיעות על היווצרות פרוטסטלטים. כפי שמציינים בורנרט ועמיתיו, מגבלה אחת של שיטה זו היא העומק הצר שניתן לצלם בשל צפיפות העצם, מה שכופה גם שימוש בעכברים צעירים יותר. ניתן ליישם טכניקה זו על עכברים מהונדסים גנטית כדי לחקור את תפקידם של גנים מעניינים ביצירת טסיות דם in vivo. לדוגמה, המחברים השתמשו בטכניקה זו כדי להדגים שתפקיד המיקרו-צינורות בהתארכות הפרוטסליות שונה בין תנאי מבחנה ו-in vivo 8.

התפתחות לא תקינה של MK וייצור טסיות דם עלולים להוביל לטרומבוציטופניה או טרומבוציטמיה, מה שמגביר את הסיכון לדימום או פקקת, בהתאמה. המשך המאמצים לנתח את המנגנונים המולקולריים השולטים בביוגנזה של טסיות הדם יגדיל את יכולתנו לפתח אסטרטגיות חדשות לטיפול בטרומבוציטופניה וטרומבוציטמיה. בתחום מחקר העירוי, מאמצים אלה יניחו את היסודות לייצור טסיות דם מתורבתות כחלופה לעירוי במצבים נבחרים9.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), האיחוד האירופי באמצעות הקרן האירופית לפיתוח אזורי (ERDF) ועל ידי מענק ANR-17-CE14-Megaplatprod ל-H.d.S ו-ANR-18-CE14-PlatForMechanics ל-C.L.

מקורות

  1. Boscher, J., et al. Blood platelet formation at a glance. Journal of Cell Science. 133 (20), 244731(2020).
  2. Machlus, K. R., Italiano, J. E. The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation. The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
  3. Strassel, C., et al. Aryl hydrocarbon receptor-dependent enrichment of a megakaryocytic precursor with a high potential to produce proplatelets. Blood. 127 (18), 2231-2240 (2016).
  4. Montenont, E., et al. CRISPR-edited megakaryocytes for rapid screening of platelet gene functions. Blood Advances. 5 (9), 2362-2374 (2021).
  5. Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128 (16), 2022-2032 (2016).
  6. Eckly, A., et al. Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (11), 2987-3001 (2020).
  7. Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
  8. Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. 106 (5), 1368-1380 (2021).
  9. Strassel, C., Gachet, C., Lanza, F. On the way to in vitro platelet production. Transfusion Clinique et Biologique. 25 (3), 220-227 (2018).

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

Megakaryocyte DifferentiationPlatelet FormationCD34+ CellsMouse Megakaryocyte Progenitors3D Methylcellulose-based HydrogelCell MaturationMurine MegakaryopoiesisTransmission Electron MicroscopyProplatelet Formation DynamicsTwo-photon ImagingBone Marrow Explants
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.