מאמר שיטה

ניתוח מיקרוסקופיית וידאו במהירות גבוהה לאבחון קו ראשון של דיסקינזיה סילארית ראשונית

DOI:

10.3791/63292

⸱

19 בינואר 2022

 ,  ,  , 
1Allergy Centre, Tampere University Hospital, 2Department of Pediatrics, Turku University Hospital, 3Turku Bioscience Center, University of Turku and Åbo Akademi University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח מיקרוסקופיית וידאו במהירות גבוהה הוא קל יחסית לביצוע, מהיר, חסכוני, ובידיים מנוסות, כלי אמין במידה ניכרת לאבחון קו ראשון של דיסקינזיה סילארית ראשונית, שאמורה להיות זמינה בכל מרכז המעורב באבחון ובטיפול במחלות ריאה קשות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דיסקינזיה סילארית ראשונית (PCD) היא הפרעה מולדת התורשתית בעיקר בתכונה אוטוזומלית רצסיבית. ההפרעה גורמת להפרעה בתנועת הריסונים, מה שמוביל לפגיעה חמורה בפינוי רירית (MCC). אם לא מאובחנים או מאובחנים מאוחר מדי, המצב מוביל להתפתחות ברונכיאקטזיס ונזק חמור לריאות בהמשך החיים. רוב השיטות לאבחון PCD גוזלות זמן רב ודורשות משאבים כלכליים נרחבים כדי לבסס אותן. ניתוח מיקרוסקופיית וידאו במהירות גבוהה (HSVMA) הוא כלי האבחון היחיד להמחשה וניתוח של תאי נשימה חיים עם ריסונים פועמים במבחנה. זה מהיר, חסכוני, ובידיים מנוסות, אמין מאוד ככלי אבחון עבור PCD. בנוסף, אמצעי אבחון קלאסיים כגון מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה (TEM) אינם ישימים עבור מוטציות מסוימות מכיוון ששינויים מורפולוגיים נעדרים.

מאמר זה מתאר את תהליך איסוף תאי אפיתל נשימתיים, את ההכנה הנוספת של הדגימה ואת התהליך של HSVMA. כמו כן, אנו מתארים כיצד ניתן לשמור בהצלחה על תאים מוברשים ללא פגע ולהכות על ידי השארתם במדיום מזין לאחסון והובלה לאתר החקירה במקרים בהם למרפאה אין את הציוד לביצוע HSVMA. כמו כן מוצגים סרטונים עם דפוסי הכאה פתולוגיים מחולים עם מוטציה בגן שרשרת כבדה 11 של זרוע הדיינין (DNAH11), שלא ניתן לאבחן עם TEM; התוצאה של HSVMA לא חד משמעי עקב זיהום של דרכי הנשימה העליונות, כמו גם צחצוח לא מוצלח עם superimposition של תאי דם אדומים. במאמר זה, ברצוננו לעודד כל יחידה העוסקת בחולי ריאות ומחלות ריאה נדירות לבצע HSVMA כחלק מהאבחנה השגרתית היומית שלהם עבור PCD או לשלוח את הדגימות למרכז המתמחה בביצוע HSVMA.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דיסקינזיה סילארית ראשונית (PCD) היא הפרעה גנטית תורשתית נדירה, הגורמת להפרעות בתנועת הריסונים המכים. אם לא מאובחנים, זה מוביל לנזק חמור לריאות בהמשך החיים עקב פגיעה חמורה של MCC. בעבר הוערך כי שכיחותו נעה בטווח של 1:4,000 עד 50,000. בשל שיפור מתמיד באבחון ומודעות גוברת למצב, עדכונים על שכיחות ה- PCD מצביעים על כך שהוא עשוי להיות נפוץ הרבה יותר וכנראה בטווח של 1:4,000 עד 20,000 במקום 1,2. עם זאת, חולים עם PCD עדיין מאובחנים בתת-אבחון או מאובחנים מאוחר מדי 1,3. לכן, תינוקות עם סיטוס אינברסוס מולד ו/או הטרוטקסיה או רינוריאה פרינטלית, מצוקה נשימתית בילודים, אף חסום וקשיי האכלה צריכים להיות חשודים ב-PCD. בהמשך החיים, דלקת אוזניים כרונית, דלקת ריאות חוזרת ונשנית, רינוזינוסיטיס ושיעול רטוב כרוני וטיפוסי עקב פגיעה ב-MCC הם הסימפטומים המוכרים של PCD, אשר בשילוב עם ברונכיאקטזיס ותפקוד ריאות לקוי, ממשיכים לתוךהבגרות 2.

ניתן לאבחן חולים החשודים כבעלי PCD באמצעות כלי אבחון שונים. TEM נחשב בעבר לתקן הזהב לאבחון קו ראשון. עם זאת, עד 30% ממקרי ה-PCD אינם מראים מבנה-על חריגשל 1,3,4,4,5,6, מה שדורש גישה אבחנתית שונה. לכן, מספר גדל והולך של מרכזים וההנחיות של החברה האירופית לנשימה (ERS) מציעים שילוב של תחמוצת החנקן באף (nNO) ו- HSVMA כאבחון קו ראשון 1,7,9,10. HSVMA ו-nNO הן גם האפשרויות החסכוניות ביותר בזיהוי מטופל עם PCD11. עם זאת, גם אם הבדיקות הגנטיות נכללו באבחון, יש לזכור כי אין כיום בדיקה עצמאית או שילוב של בדיקות שיכולות לכלול PCD בוודאות של 100% 8,9,10.

מבין אפשרויות האבחון הזמינות, HSVMA היא הבדיקה היחידה המתמקדת בתאי נשימה חיים, מצופים ריסונים ומעריכה את תבנית הפעימה הציליארית (CBP) ואת תדירות הפעימה הציליארית (CBF). בניגוד ל-TEM, התוצאות של HSVMA זמינות במהירות, בדרך כלל ביום הבדיקה, בעוד שתוצאות ה-TEM עשויות להגיע חודשים לאחר נטילת הדגימה. ניתן ליישם HSVMA עבור כל קבוצות הגיל, בעוד ש- nNO דורש רמה גבוהה של תאימות; ניסיונות להשתמש בו מתחת לגיל 5 שנים הם בדרך כלל לא מוצלחים10. בידיים מנוסות, HSVMA יש רגישות מעולה וספציפיות לאבחון PCD ב 100% ו 96%, בהתאמה12.

מאמר זה מתאר את ההליך שלב אחר שלב לביצוע HSVMA, כולל קצירת תאי נשימה מצופים ריסונים מהטורבינט הנחות של האף, שימור תאים שנקטפו במדיום המזין את התאים להובלה לאתר החקירה, ותהליך ניתוח וידאו מיקרוסקופי לקביעת CBF ו- CBP. בנוסף, מוצגים כמה קטעי וידאו של מטופלים, המשווה בין CBPs ו- CBFs רגילים לתפקוד ריסונים לא תקין (וידאו 3, וידאו 4, וידאו 5, וידאו 6, וידאו 7 ווידאו 8).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הצהרת האתיקה:

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה המקומית (69/2017) ונערך בהתאם להצהרת הלסינקי.

1. איסוף והובלה של תאי אפיתל נשימתיים

  1. צחצוח
    1. לפני הצחצוח, תנו למטופל קורס של שבועיים של חומצה אמוקסיצילין-קלבולאנית פומית כדי למגר את הביופילמים המפריעים לתפקוד הריסונים. ודא שהאנטיביוטיקה מסתיימת יומיים לפני ההליך.
    2. כדי להפחית את שכבת העל של חומר רירי על רצועות תאי האפיתל המוברשים, בקשו מהמטופל לפוצץ את האף ביסודיות. בקשו מהורים לעזור לילדיהם הקטנים לפוצץ את האף.
    3. להברשה, השתמשו במברשת בין-דנטלית בגודל 0.6 מ"מ (ראו טבלת החומרים). שמור על ראשו של המטופל קבוע ביד אחת, וביד השנייה, לצחצח את הטורבינאט הנחות של שני הנחיריים כדי לאסוף מספיק רצועות תאי אפיתל.
      הערה: התנגדות קלה נחווית בדרך כלל בעת החדרת המברשת הבין-דנטלית עמוק מתחת לטורבינט הנחות. צחצוח האף מתבצע על ידי סיבוב מהיר וקטיף במשך כ 2 שניות. צחצוח ארוך ואינטנסיבי עלול לגרום לפגיעה חמורה באפיתל ולאפיסטקסיס רצופים.
    4. אם ברונכוסקופיה מתוכננת מסיבות שאינן חשד ל- PCD, לאסוף דגימות במהלך ברונכוסקופיה על ידי צחצוח אפיתל הקרינה או הסימפונות או על ידי ביופסיה13.
    5. שחררו את רצועות התאים שנקטפו לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל המכיל את מדיום הנשרים המהונדסים (DMEM) של דולבקו המזין את התאים.
      הערה: רצועות תאי אפיתל בדרך כלל מורידות את המברשת בקלות רבה יותר על ידי השלכה והפיכת המברשת על דופן הצינור.
    6. סגור את המכסה של צינור microcentrifuge והחזק את הצינור כנגד מקור אור. לנער את הצינור כדי לגלות רצועות תאים וקונגלומרטים שנקטפו.
  2. הובלת הדגימה
    1. מניחים את צינורות המיקרוצנטריפוגה בקופסת פוליסטירן סגורה היטב ומוודאים שמכסה הצינורות סגור כראוי והצינורות קבועים בתוך הקופסה.
    2. הוסף חבילה קרה; עם זאת, הימנע מהקפאת הדגימה.
      הערה: הטמפרטורה האופטימלית לשימור הדגימה לפני החקירה היא בערך 4-8 מעלות צלזיוס (39.2-46.4 מעלות פרנהייט).
    3. ודא שהדגימות שהשתמרו מנותחות במהלך 24 השעות הבאות.
      הערה: בניסויים אלה, הזמן הממוצע בין צחצוח ל-HSVMA היה 3 שעות.

2. ניתוח מיקרוסקופיית וידאו במהירות גבוהה (HSVMA)

  1. מיקרוסקופ וידאו של הדגימות
    1. לאחר קבלת צינורות microcentrifuge המכילים את הדגימות, לחמם אותם עד 37 °C (98.6 °F) כדי לחקות סביבה אופטימלית, דמוית vivo.
    2. אם המיקרוסקופ מצויד ביחידת חימום, הניחו את הצינורות מתחת למכסה המנוע וחממו אותם שם למעלה. לחלופין, השתמשו באינקובטור כדי לחמם את הדגימות.
    3. הפעל את המצלמה ואת התוכנה של יחידת הווידאו במחשב.
    4. באמצעות פיפטה, קחו כמות קטנה מהדגימה והניחו שתי טיפות לתוך צלחת קובט או תחתית זכוכית (ראו את טבלת החומרים). מכסים את הקובט או את המנה במכסה ומניחים אותה מתחת למיקרוסקופ.
    5. להערכת הדגימות, השתמש במיקרוסקופ עם הפרעה דיפרנציאלית המצויד במקור אור קר ובמצלמת וידאו המסוגלת להקליט במהירות גבוהה (לפחות 200 פריימים לשנייה). השתמשו בעדשת טבילת שמן עם הגדלה של פי 100 והניחו טיפה של שמן טבילה על פני השטח של האופטיקה.
      הערה: מומלץ להשתמש במיקרוסקופים עם עדשה המתקרבת מלמטה.
    6. ניגשים לתחתית המנה עם עדשת המיקרוסקופ ומחפשים צבירי תאים ללא תאי דם אדומים ועם תכולת ריר נמוכה. לאחר מציאת אזור עניין מייצג (ROI), התמקדו בקבוצה ספציפית אחת של ריסונים מכים עם תנועות הריסונים הגדולות ביותר והקליטו רצף וידאו. הקלט תאים עם ריסונים פועמים בצד וממלמעלה. לאחר מכן, חפש אשכול מייצג אחר של תאים וחזור על ההקלטה.
      הערה: יש לחקור את התאים המצופים בריסונים תחת הגדלה של פי 1,000, ויש להקליט ריסונים מכות באמצעות מצלמת וידאו דיגיטלית במהירות גבוהה (DHSV) שנקבעה בקצב פריימים של 200 לשנייה או יותר (256/s בפרוטוקול זה). מכיוון שהנתונים המתקבלים מקטעי הווידאו המוקלטים דורשים הרבה מקום בכונן הקשיח, מומלץ כונן קשיח חיצוני של SSD.
  2. ניתוח רצפי וידאו
    1. כדי לקבוע CBF ו- CBP, הפעל את קטעי הווידאו בחזרה פריים אחר פריים.
    2. כדי לקבוע CBF, הגדר את קצב הפריימים להילוך איטי עם 15 פריימים לשנייה וספור 10 פעימות רצופות.
    3. רשום את מספר המסגרות העוברות על פני מחזור יחיד של 10 פעימות והכנס את התוצאה ל- Eq (1). קבע את התדירות על-ידי חישוב הממוצע של כל מחזורי פעימות הריסונים שנרשמו והשווה את התוצאה לערכי הייחוס עבור הגיל (ראה טבלה 1)14.
      figure-protocol-1 (1)
      כאשר X הוא מספר המסגרות החולפות על פני מחזור של 10 פעימות.
    4. להערכת CBP, שימו לב אם תנועת הריסונים המכות נמצאת בטווח מלא (ראו איור 1) ומסונכרנת. בקש משני אופרטורים עצמאיים להעריך את ה- CBP כדי למנוע הטיית בחירה.
    5. דווח על התוצאות של ניתוח HSVMA כך שיהיו תואמות, לא סבירות או לא חד משמעיות עם PCD.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

וידאו 1 ווידאו 2 מראים שליטה רגילה שבה CBF ו-CBP נמצאים בטווח הנורמלי (ראו איור 1). וידאו 3, וידאו 4, וידאו 5 ווידאו 6 מייצגים שני מקרים של חולי PCD עם מוטציה הומוזיגוטית בגן DNAH11 (c.2341G > A; p. Glu781Lys)3. סרטונים מייצגים אלה נבחרו מכיוון שפנוטיפים של מוטציות בגן DNAH11 ראויים לציון מכיוון שלא ניתן לאבחן אותם על ידי TEM בשל ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, תהליך האבחון עבור PCD באמצעות HSVMA מתואר ונדון לאור אבחון קו ראשון. למרות היותו קל יחסית להקמה,חסכוני 11, ושיטה אמינה בידיים מנוסות12, HSVMA אינו אמצעי אבחון ללא מכשולים. CBF ו- CBP חריגים עשויים להיות תוצאה של זיהום משני, מה שמוביל לדלקת של אפיתליה ברונכו-נשימתית15, ומאותה סיבה, אנשים מעשנים עשויים להיות בעלי תדירות פעימה חריגה16,17. בנוסף, סיסטיק פיברוזיס יש לכלול לפני קביעת האבחנה של...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מבקשים להביע תודה מיוחדת לאחות הילדים גברת יוהנה יובנקוסקי על עזרתה המצוינת עם הצחצוחים. אנו רוצים גם להביע תודה מיוחדת לפרופסור היימוט עומרן (מרפאת האוניברסיטה מינסטר, UKM) על מתן רשות להשתמש בדמות הסכמטית של תנועה סילארית רגילה מאתר האינטרנט שלהם. לבסוף, ברצוננו להודות למר אלן בראון BA (Hons), PGCE, על הגהת כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חומצה אמוקסיצילין-קלבולניתOrion Oyj40 מ"ג/ק"ג מחולק ל-2 מנות ליום, למבוגרים 875/125 מ"ג 1 טבליה x2/יום
תוכנת מצלמהHamamatsuHCI תמונה
חבילה קרהכל לשימורוהובלה
מיקרוסקופ הפרעות דיפרנציאליותקרל זייסהפוך, מיקרוסקופ צופה תא
דיגיטלי גבוה מצלמת וידאו מהירותHamamatsuOrca Flash 4.0, מצלמה דיגיטלית מסוג C11440
Dulbecco & acute; s שונה נשר בינוניתרמו פישר10565018מדיום תרבית תאי בסיס
צינור אפנדורף30120086צינור 1.5 מ"ל
צלחת מיקרובאר תחתונהזכוכית MattekP35G-1.5-14-Cקובטה למיקרוסקופיה
חימוםקארל זייס / PeCon810-450001אלמנטים דגירה של קרל זייס עם בקרת
טמפרטורה PeCon TempModule S1מברשת בין שיניים 0.6 מ"מDoft872267מברשת בין שיניים על חוט ארוך עם ידית רב פעמית וכובע ברוכסן
ObjectiveCarl Zeiss100x/1.46, α תכנית-אפוכרומט מטרת DIC
קופסת פוליסטירן קטנה עם מכסהכללהובלה
יחידת

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Werner, C., Onnebrink, J. G., Omran, H. Diagnosis and management of primary ciliary dyskinesia. Cilia. 4 (1), 2(2015).
  2. Mirra, V., Werner, C., Santamaria, F. Primary ciliary dyskinesia: An update on clinical aspects, genetics, diagnosis and future treatment strategies. Frontiers in Pediatrics. 5, 135(2017).
  3. Schultz, R., Elenius, V., Lukkarinen, H., Saarela, T. Two novel mutations in the DNAH11 gene in primary ciliary dyskinesia (CILD7) with considerable variety in the clinical and beating cilia phenotype. BMC Medical Genetics. 21 (1), 237(2020).
  4. Knowles, M. R., et al. Mutations of DNAH11 in patients with primary ciliary dyskinesia with normal ciliary ultrastructure. Thorax. 67 (5), 433-441 (2012).
  5. Boon, M., et al. Primary ciliary dyskinesia: critical evaluation of clinical symptoms and diagnosis in patients with normal and abnormal ultrastructure. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9, 11(2014).
  6. Kouis, P., et al. Prevalence of primary ciliary dyskinesia in consecutive referrals of suspected cases and the transmission electron microscopy detection rate: a systematic review and meta-analysis. Pediatric Research. 81 (3), 398-405 (2017).
  7. Marthin, J. K., Nielsen, K. G. Choice of nasal nitric oxide technique as first-line test for primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 37 (3), 559-565 (2011).
  8. Jackson, C. L., Behan, L., Collins, S. A. Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).
  9. Lucas, J. S., et al. European Respiratory Society guidelines for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 49 (1), 1601090(2017).
  10. Shoemark, A., Dell, S., Shapiro, A., Lucas, J. S. ERS and ATS diagnostic guidelines for primary ciliary dyskinesia: similarities and differences in approach to diagnosis. European Respiratory Journal. 54 (3), 1901066(2019).
  11. Kouis, P. Cost-effectiveness analysis of three algorithms for diagnosing primary ciliary dyskinesia: a simulation study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 14 (1), 142(2019).
  12. Rubbo, B., et al. Accuracy of high-speed video analysis to diagnose primary ciliary dyskinesia. Chest. 155 (5), 1008-1017 (2019).
  13. Friedman, N. R., Pachigolla, R., Deskin, R. W., Hawkins, H. K. Optimal technique to diagnose primary ciliary dyskinesia. The Laryngoscope. 110 (9), 1548-1551 (2000).
  14. Chilvers, M. A., Rutman, A., O´Callaghan, C. Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults. Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).
  15. Lucas, J. S., Paff, T., Goggin, P., Haarman, E. Diagnostic methods in primary ciliary dyskinesia. Paediatric Respiratory Reviews. 18, 8-17 (2016).
  16. Ballenger, J. J. Experimental effect of cigarette smoke on human respiratory cilia. New England Journal of Medicine. 263, 832-835 (1960).
  17. Stanley, P. J., Wilson, R., Greenstone, M. A., Mac William, L., Cole, P. J. Effect of cigarette smoking on nasal mucociliary clearance and ciliary beat frequency. Thorax. 41 (7), 519-523 (1986).
  18. Kobbernagel, H. E., et al. Efficacy and safety of azithromycin maintenance therapy in primary cilia dyskinesia (BESTCILIA): a multicentre, double-blind, randomised, placebo-controlled phase 3 trial. Lancet Respiratory Medicine. 8 (5), 493-505 (2020).
  19. Takeyama, K., Tamaoki, J., Chiyotani, A., Tagaya, E., Konno, K. Effect of macrolide antibiotics on ciliary motility in rabbit airway epithelium in-vitro. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 45 (8), 756-758 (1993).
  20. Toskala, E., Haataja, J., Shirasaki, H., Rautliainen, M. Culture of cells harvested with nasal brushing: a method for evaluating ciliary function. Rhinology. 43 (2), 121-124 (2005).
  21. Pifferi, M., et al. Simplified cell culture method for the diagnosis of atypical primary ciliary dyskinesia. Thorax. 64 (12), 1077-1081 (2009).
  22. Hirst, R. A., et al. Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative, diagnostic aid. PLoS One. 9 (2), 89675(2014).
  23. Papon, J. F., et al. Quantitative analysis of ciliary beating in primary ciliary dyskinesia: a pilot study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 7 (10), 78(2012).
  24. Smith, C. M., et al. Cilia FA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software. Cilia. 1 (8), 14(2012).
  25. Sampaio, P., et al. Ciliar Move: new software for evaluating ciliary beat frequency helps find novel mutations by a Portuguese multidisciplinary team on primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal Open Research. 7 (1), 00792(2021).
  26. Mullowney, T., et al. Primary ciliary dyskinesia and neonatal respiratory distress. Pediatrics. 134 (6), 1160-1166 (2014).
  27. Leigh, M. W., et al. Standardizing nasal nitric oxide measurement as a test for primary ciliary dyskinesia. Annals of the American Thoracic Society. 10 (6), 574-581 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNAH11

מאמרים קשורים