ההערכה הקלינית של ספסטיות המבוססת על רפלקס הופמן (H-reflex) ושימוש בגירוי חשמלי של עצבים היקפיים היא שיטה מבוססת. כאן, אנו מספקים פרוטוקול לגירוי עצבי טרמינלי וישיר לכימות H-רפלקס בכף הקדמית של העכבר.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מדידות רפלקס H טרמינלי בעכברים
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
רפלקס הופמן (H-reflex), כאנלוגיה חשמלית לרפלקס המתיחה, מאפשר אימות אלקטרופיזיולוגי של שלמות המעגלים העצביים לאחר פציעות כגון נזק לחוט השדרה או שבץ. עלייה בתגובת H-reflex, יחד עם תסמינים כמו התכווצויות שרירים לא רצוניות, רפלקס מתיחה מוגבר פתולוגית והיפרטוניה בשריר המתאים, היא אינדיקטור לספסטיות שלאחר שבץ (PSS).
בניגוד למדידות טרנסעוריות לא ספציפיות לעצבים, כאן אנו מציגים פרוטוקול לכימות רפלקס H ישירות בעצבים האולנרים והמדיאניים של הכף הקדמית, אשר ישים, בשינויים קלים, לעצב הטיביאלי והסכיאטי של הכף האחורית. בהתבסס על גירוי ישיר והסתגלות לעצבים שונים, השיטה מהווה כלי אמין ורב-תכליתי לאימות שינויים אלקטרופיזיולוגיים במודלים של מחלות הקשורות לספסטיות.
מבוא
רפלקס הופמן (H-reflex), הקרוי על שם הפיזיולוג פול הופמן, יכול להיות מעורר על ידי גירוי חשמלי של עצבים היקפיים, הנושאים אקסונים של נוירונים סנסוריים ומוטוריים הנובעים מאותם שרירים ומובילים אליהם. זהו האנלוגי המושרה חשמלית של רפלקס המתיחה המונוסינפטי, וחולק את אותו מסלול1. בניגוד למתיחה של שריר, רפלקס H נובע מגירוי חשמלי. כאשר עצבים היקפיים מגורים חשמלית בעוצמת זרם נמוכה, סיבי Ia afferent הם בדרך כלל depolarized הראשון בשל קוטר האקסון הגדול שלהם2. פוטנציאלי הפעולה שלהם מעוררים נוירוני אלפא מוטוריים (αMNs) בחוט השדרה, אשר בתורם מעוררים פוטנציאלי פעולה שנעים במורד אקסוני αMN לכיוון השריר (איור 1). מפל זה יוצר תגובה שרירית עם משרעת קטנה, המשתקפת במה שמכונה גל H. על ידי הגדלה הדרגתית של עוצמת הגירוי, המשרעת של גל H עולה עקב גיוס של יחידות מוטוריות נוספות. מעוצמת גירוי מסוימת, פוטנציאלי פעולה באקסונים הדקים יותר של αMN מופקים ישירות, אשר נרשם כגל M. גל M זה מופיע עם השהיה קצרה יותר מגל H (איור 2). אם עוצמת הגירוי מוגברת עוד יותר, המשרעת של גל M הופכת גדולה יותר עקב גיוס אקסונים נוספים של αMN, בעוד שגל H הופך בהדרגה קטן יותר. גל H יכול להיות מדוכא בעוצמות גירוי גבוהות עקב התפשטות לאחור אנטידרומית של פוטנציאלי פעולה באקסונים αMN. פוטנציאלי פעולה מופעלים אלה מתנגשים עם אלה של גירוי Ia ולכן יכולים לבטל זה את זה. בעוצמות גירוי על-מקסימליות, פוטנציאלי פעולה אורתודרומיים (לכיוון השריר) ואנטי-דרומיים (לכיוון חוט השדרה) מתרחשים בכל אקסוני MN; הראשון מוליד את המשרעת המקסימלית של גל M (Mmax), ואילו האחרון מביא לביטול מוחלט של רפלקס H3.
לצורך הערכה של ספסטיות לאחר שבץ מוחי (PSS) או פגיעה בחוט השדרה (SCI), נעשה שימוש ברפלקס H כדי להעריך את הבסיס העצבי של תנועה וספסטיות בבני אדם1. כימות משופר של השינוי ברפלקס H בין מדידות ובין נבדקים מושג על ידי שימוש ביחס בין גל H וגל M (יחס H/M). לחלופין, דיכאון תלוי קצב (RDD) נמדד, באמצעות קבוצה של תדרים עולים (למשל, 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 ו 5.0 הרץ). RDD משקף את שלמותם של מעגלים מעכבים שעלולים להיות מופרעים על ידי שבץ או SCI. כאשר כל המעגלים העצביים שלמים, קיים דיכוי אחיד ובלתי תלוי בתדר של רפלקס H. עם זאת, אם יש עיכוב עצבי מופחת כתוצאה משבץ או SCI, דיכוי רפלקס H פוחת עם הגדלת תדירות הגירוי4.
ההקלטה האלקטרופיזיולוגית הנכונה באמצעות אלקטרודות פני השטח יכולה להיות מאתגרת ועשויה להיות מושפעת ממשימות מוטוריות, מנגנוני עיכוב ורגישות αMN5. ברישום הטרנסעורי במכרסמים, אלקטרודת גירוי ממוקמת ליד העצב הטיביאלי, ואלקטרודת הקלטה ממוקמת ליד השרירים הקשורים בכפה הקדמית. אולם לפי הניסיון שלנו, המיקום הנכון של האלקטרודות הטרנסעוריות (איור 1A) הוא אפילו מורכב ומשתנה יותר במכרסמים מאשר מיקום אלקטרודות פני השטח בבני אדם. זה יכול להוביל להבדלים באורך, בתדירות ובעוצמת הגירוי הדרושים כדי לעורר את רפלקס H. אתגרים מתודולוגיים אלה יכולים להסביר מדוע יש רק מספר מוגבל מאוד של מחקרי מדידת רפלקס H (למשל, במודלים ניסיונייםשל שבץ 3,4, ומודלים אחרים של ספסטיות6. גירוי והקלטה מדויקים (ארוכי טווח) של רפלקס H על עצבים בודדים יכולים, באופן עקרוני, להיות מושגת באמצעות אלקטרודות מושתלות המקיפות את עצב המטרה 7,8. בשל הניתוח המאתגר עם תופעות לוואי אפשריות עבור בעל החיים וחוסר יציבות פוטנציאלי של הבדיקה, גישה זו לא הפכה לסטנדרט בתחום. השיטה המוצגת כאן דורשת גם מומחיות כירורגית מסוימת. עם זאת, הוא מאפשר גירוי והקלטה חדשניים ומדויקים של עצבים מבודדים in vivo באמצעות עוצמות גירוי נמוכות, הנמנעות מגירוי סימולטני של עצבים שכנים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים נערכו בהתאם לחוקי הטיפול בבעלי חיים האירופיים והלאומיים ולהנחיות המוסדיות, ואושרו על ידי Landesamt für Natur-, Umwelt-, und Verbraucherschutz נורדריין-וסטפליה (Az: 81-02.04.2019.A309). הפרוטוקול מותאם לעכברים בוגרים (עכברי C57Bl/6J בני 8-16 שבועות בקירוב) ולרישום הגפיים הקדמיות. ניתן להתאים אותו בקלות על-ידי גירוי העצבים המתאימים של הגפה האחורית ורישום שרירי הכפות האחוריות (איור 1B). תיאור של אלקטרודות ההקלטה והגירוי מתווסף בטבלת החומרים. שים לב שהפרוטוקול משמש למדידת מסוף בלבד.
1. הכנה
- לשקול את בעל החיים ולהתחיל הרדמה על ידי הזרקה דרך i.P. תערובת של קטמין (100 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג / ק"ג).
- שמור את העכבר בקופסת החימום עד שתגיע לסבילות כירורגית. המתן מספר דקות עד שהעכבר רגוע, הנשימה יציבה ורפלקסים נעדרים. בדוק את עומק ההרדמה על ידי מדידת חוסר התגובה לצביטת הבוהן.
- סובבו את העכבר על גבו והניחו אותו על כרית חימום (אופטימלי יהיה חימום מבוקר משוב באמצעות בדיקת טמפרטורה רקטלית). תקן את הכפות הקדמיות עם קלטת. כאן, ודא כי הקלטת ממוקמת באופן כזה אלקטרודות מדידה מוכנסים בקלות לתוך הכפות הקדמיות.
- הכנס בדיקה רקטלית כדי למדוד את הטמפרטורה של החיה ולתקן אותו עם קלטת. יש למרוח משחת עיניים כדי למנוע התייבשות של העיניים.
2. ניתוח
הערה: יש לעקוב באופן קבוע אחר מצבו היציב של בעל החיים המורדם, כלומר נשימה, טמפרטורה ואובדן רפלקסים. הליך מדידת גל H של עצב ישיר מוצג עבור העצב הרדיאלי/אולנר/מדיאני של הכף הקדמית (איור 3A). ניתן להתאים את המדידה גם לכף האחורית (עצב סיאטי/טיביאלי) עם שינויים.
- לקבלת סקירה טובה יותר של אזור הניתוח, להסיר את השיער עם סכין גילוח חשמלי או זוג מספריים במקום נפרד מראש. עבור מנתחים מנוסים יותר זה רק אופציונלי.
הערה: אין צורך בחיטוי כאן, מכיוון שמדובר בניסוי סופי. החיה תורד מאוחר יותר. - הרימו את העור בפינצטה ובצעו חתך של כ-1 ס"מ בעור לאורך הציר הוונטרו-אחורי של הכף הקדמית (אזור מעל בית השחי ובית החזה) בעזרת זוג מספריים מעוגלים עדינים.
- הסירו בזהירות את רקמת החיבור וחשפו את השריר והעצב שמתחתיה. הסירו את שריר החזה החשוף באמצעות מלקחיים, כדי לגשת לעצב המדיאני (איור 3E,F). הסר כמויות קטנות של דם ונוזל רקמות עם רקמות רכות.
- בשלב הבא, חתכו בזהירות את השד או שריר בית השחי מלמעלה למטה כדי לחשוף את צרור העצבים שמתחת. שחררו את צרור העצבים מרקמת החיבור והשריר לאורך של כ-1.5 ס"מ.
הערה: כאן, יש להקפיד במיוחד לא לפגוע בכלי הדם הפועלים במקביל לעצב המדיאני. בעת חיתוך הרקמה, תמיד לחתוך לאורך העצב כדי למנוע פגיעה בו. אם זה קורה, להסיר נוזל דולף ודם עם מטוש. מיקרוסקופ סטריאו אינו הכרחי עבור הניסוי כולו, אולם הוא יכול להיות שימושי להכנת העצבים. - הפרידו בזהירות את העצב האולנרי והמדיאני של הכף הקדמית באמצעות פיפטת זכוכית כפופה (איור 3E). העליון מבין שני העצבים הוא העצב האולנרי, והתחתון הוא העצב המדיאני.
הערה: בעת הפרדת העצבים זה מזה, ודא כי כלי הדם שמתחתיו אינו נפגע.
3. מיקום אלקטרודות
- סדרו את אלקטרודות וו הגירוי במקביל במרחק של 0.5-1.0 מ"מ, והשתמשו במיקרומניפולטור כדי למקם את הוו הכפול בסמיכות לעצב.
- השתמש בוו הזכוכית ככלי להרמת העצב האולנרי אל אלקטרודות וו הגירוי. משכו את האלקטרודה לאחור עם העצב והפרידו אותה מעצבים אחרים בכ-1-2 מ"מ באמצעות המיקרומניפולטור (איור 3D,F).
- הניחו את האלקטרודות לאורך הציר הארוך של הכף כדי להפחית את הדיבור בין השרירים.
הערה: מיקום האלקטרודות חשוב מאוד אך קשה לתקנן אותו בגלל האנטומיה האישית. זה דורש מנתח מנוסה כדי למקם את האלקטרודות כראוי. ניתן גם למקם מחדש את החוטים אם משרעת האות אינה מספקת. - יבשו באופן שטחי את ווי האלקטרודות המחוברים לעצב ומרחו וזלין באמצעות מזרק כדי לספק בידוד חשמלי מהרקמה הסמוכה.
הערה: יש להקפיד למרוח מספיק וזלין על האלקטרודה וגם בין שני הווים כדי להבטיח בידוד חשמלי ולמנוע מהעצבים להתייבש.
4. מיקום אלקטרודות ההקלטה והייחוס
- כדי למדוד את רפלקס H, מקם את אלקטרודות ה- EMG תוך שרירית בכפה הקדמית. בנוסף, מקמו את אלקטרודת הייחוס באופן תת-עורי בגפה האחורית (למשל, באמצעות סיכה דקה), המוחזקת על-ידי תפס תנין מיניאטורי (איור 3B).
- כאשר הממריץ מופעל, שימו לב לגירוי מוצלח כמו עוויתות זעירות של הכף הקדמית. זרם הגירוי המינימלי כדי לעורר את גל M ועוויתות זעירות גלויות בכפה הקדמית צריך להיות בטווח של 10-50 μA.
הערה: אם לא נראים עוויתות ב-50 μA, התאם את אלקטרודות הגירוי ומרח מחדש וזלין. כמו כן, בעכברים, אין זה נדיר שגל M מופיע בעוצמות גירוי נמוכות יותר מאשר גל H5.
5. מדידה
- חזור על גירוי העצב 15 פעמים עם פולסים ארוכים של 0.2 אלפיות השנייה כל אחד. עם הפסקות של 2 דקות בין קבוצות של גירויים, התדר גדל מ 0.1, 0.5, 1.0, 2.0, ל 5 הרץ.
הערה: תדרים אלה נחוצים אם מחשבים את RDD לאחר מכן. כל נתוני EMG נרשמים, עוברים דיגיטציה ומנותחים באמצעות תוכנה כגון תוכנת Spike2 (CED, גרסה 7.19). המשרעת הגדולה ביותר של גל H צפויה להיות 0.1 הרץ. ככל שהתדר גבוה יותר, כך המשרעת של גל H קטנה יותר בגלל RDD. - לאחר הניסוי, להקריב את החיה על פי פרוטוקול IACUC של המכון. בניסוי זה בוצע זילוח עכבר באמצעות PBS ו-4% PFA בהרדמה עמוקה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מתוך n = 15 ניסויי גירוי לכל תדירות גירוי וכפה, בחר לפחות n = 10 הקלטות מוצלחות לניתוח. ניסויים עם שגיאות מדידה (למשל, גל M חסר) אינם נכללים בניתוח. נתח כל ניסוי בנפרד וצור ממוצע להשוואות קבוצתיות/זמן מאוחר יותר. ההשהיה בין הגירוי להופעה של גל M וגל H נרשמת עבור כל ניסוי. מניסיוננו, גל M מתרחש בערך 2 מילישניות לאחר הגירוי, וגל H לאחר 6-8 מילישניות, בשל זמן המעבר הארוך יותר דרך חוט השדרה (איור 1A ואיור 2B). מדוד את המשרעת של גלי M ו- H כשיא לשיא.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בניגוד למדידות H-רפלקס טרנסעוריות שתוארו קודם לכן בעכבר6, אנו מספקים מדידה ישירה יותר וספציפית לעצב. גישה חדשה זו יכולה להיות מיושמת על העצבים של הגפה הקדמית והאחורית (למשל, העצבים המדיאניים, האולנרים והרדיאליים, והעצבים הטיביאליים והסכיאטיים, בהתאמה), מה שהופך שיטה זו לניתנת להתאמה ככלי אבחון למודלים רבים של מחלות (למשל, שבץ, טרשת נפוצה, טרשת אמיוטרופית צידית, פגיעה מוחית טראומטית ופגיעה בעמוד השדרה). בהתאם לעצב שנבחר, מומלץ לאמת את המשרעת של גל H כפונקציה של עוצמת הגירוי. המשרעת יכולה להשתנות עק...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
המחברים מודים בהכרת תודה על תמיכתו של T. Akay, אוניברסיטת דלהאוזי, במהלך ביקור של MG במעבדה שלו. עבודה זו נתמכה על ידי מימון מקרן Friebe (T0498/28960/16) ומ- Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, קרן המחקר הגרמנית) - Project-ID 431549029 - SFB 1451.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| כרית תחתונה סופגת | VWR | 115-0684 | |
| AD ממיר | קיימברידג' עיצוב אלקטרוני, בריטניה | CED 1401 | |
| המכון הזואולוגי, | |||
| המכון הזואולוגי, UoC | MS 501 | ||
| סדנת אלקטרודות EMG | המכון הזואולוגי, UoC | שני חוטי נחושת מבודדים מפותלים (50 ומיקרו; m קוטר חיצוני) הולחמו לתקע זכר וחוברו למגבר דיפרנציאלי. | |
| משחת עיניים | Bayer | Bepanthen | |
| סדנת פיפטות זכוכית | המכון הזואולוגי, UoC-הכן | פיפטה מזכוכית מכופפת לוו זכוכית פשוט בלהבה של מבער בונסן . | |
| קופסת חימום | MediHeat | MediHeat V1200 | |
| כרית חימום | WPI | 61840 כרית | |
| אלקטרודות וו | סדנה המכון הזואולוגי, UoC-כדי | לייצר את האלקטרודות, כופפו סיכות מיניאטוריות מנירוסטה לווים בקצה אחד והכנסו לקנולות קהות ליצירת מגע מכני ישיר. הלחמו את קצה הצינורית לחוטי נחושת (אורך של כ-50 ס"מ), המחוברים למכשיר גירוי או הקלטה. | |
| קטמין | פייזר | Ketavet | |
| Rectal בדיקה | WPI | RET-3 | |
| בידוד ממריץ | סדנה המכון הזואולוגי, UoC | MI 401 | |
| Sterilizer | CellPoint Scientific | Germinator 500 | חיטוי שגרתי לפני ואחרי הניתוח של הציוד הכירורגי צריך להיעשות על ידי עיקור בחום. טיהור מכשירים למשך 15 שניות באמבט חרוזי הזכוכית המחומם (260° ג). |
| בקר טמפרטורה | WPI | ATC200 | |
| וזלין | |||
| באייר | רומפון |
מקורות
- Palmieri, R. M., Ingersoll, C. D., Hoffman, M. A. The Hoffmann reflex: methodologic considerations and applications for use in sports medicine and athletic training research. Journal of Athletic Training. 39 (3), 268-277 (2004).
- Henneman, E., Somjen, G., Carpenter, D. O. Excitability and inhibitibility of motoneurons of different sizes. Journal of Neurophysiology. 28 (3), 599-620 (1965).
- Toda, T., Ishida, K., Kiyama, H., Yamashita, T., Lee, S. Down-regulation of KCC2 expression and phosphorylation in motoneurons, and increases the number of in primary afferent projections to motoneurons in mice with post-stroke spasticity. PLoS ONE. 9 (12), 114328(2014).
- Lee, S., Toda, T., Kiyama, H., Yamashita, T. Weakened rate-dependent depression of Hoffmann’s reflex and increased motoneuron hyperactivity after motor cortical infarction in mice. Cell Death & Disease. 5 (1), 1007(2014).
- Knikou, M. The H-reflex as a probe: Pathways and pitfalls. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 1-12 (2008).
- Wieters, F., et al. Introduction to spasticity and related mouse models. Experimental Neurology. 335, 113491(2020).
- Pearson, K. G., Acharya, H., Fouad, K. A new electrode configuration for recording electromyographic activity in behaving mice. Journal of Neuroscience Methods. 148 (1), 36-42 (2005).
- Akay, T. Long-term measurement of muscle denervation and locomotor behavior in individual wild-type and ALS model mice. Journal of Neurophysiology. 111 (3), 694-703 (2014).
- Haghighi, S. S., Green, D. K., Oro, J. J., Drake, R. K., Kracke, G. R. Depressive effect of isoflurane anesthesia on motor evoked potentials. Neurosurgery. 26 (6), 993(1990).
- Chang, H. -Y., Havton, L. A. Differential effects of urethane and isoflurane on external urethral sphincter electromyography and cystometry in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 295 (4), 1248-1253 (2008).
- Nolan, J. P. Section 4: Nervous system (Br. J. Pharmacol). Clinical pharmacology. , 295-310 (2012).
- Struck, M. B., Andrutis, K. A., Ramirez, H. E., Battles, A. H. Effect of a short-term fast on ketamine-xylazine anesthesia in rats. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 50 (3), 344-348 (2011).
- Zandieh, S., Hopf, R., Redl, H., Schlag, M. G. The effect of ketamine/xylazine anesthesia on sensory and motor evoked potentials in the rat. Spinal Cord. 41 (1), 16-22 (2003).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
