הפרוטוקול מתאר את השיטה של העמסת צבע סידן פלואורסצנטי דרך העצב החתוך לתוך מסופי העצבים המוטוריים של העכבר. בנוסף, מוצגת שיטה ייחודית לרישום ארעי סידן מהירים בקצות העצבים ההיקפיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
רישום של סידן חולף בצומת נוירומוסקולרי עכבר עם רזולוציה טמפורלית גבוהה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית
במאמר זה
סיכום
תקציר
הערכה של רמת הסידן הקדם-סינפטי היא משימה מרכזית בחקר ההולכה הסינפטית, שכן כניסת סידן לתא הקדם-סינפטי מעוררת מפל של אירועים המובילים לשחרור מוליכים עצביים. יתר על כן, שינויים ברמות הסידן הקדם-סינפטי מתווכים את פעילותם של חלבונים תוך-תאיים רבים וממלאים תפקיד חשוב בגמישות הסינפטית. חקר איתות הסידן חשוב גם למציאת דרכים לטיפול במחלות נוירודגנרטיביות. הצומת העצבי-שרירי הוא מודל מתאים לחקר הפלסטיות הסינפטית, שכן יש לו רק סוג אחד של נוירוטרנסמיטר. מאמר זה מתאר את השיטה להעמסת צבע רגיש לסידן דרך צרור העצבים החתוך לתוך קצות העצבים המוטוריים של העכברים. שיטה זו מאפשרת להעריך את כל הפרמטרים הקשורים לשינויים בסידן תוך תאי, כגון רמת הסידן הבסיסית וסידן חולף. מאחר שזרימת הסידן מהחלק החיצוני של התא אל קצות העצבים וקשירתו/אי-כריכתו לצבע הרגיש לסידן מתרחשות בטווח של אלפיות השנייה הבודדות, נדרשת מערכת הדמיה מהירה לתיעוד אירועים אלה. ואכן, מצלמות במהירות גבוהה משמשות בדרך כלל לרישום של שינויי סידן מהירים, אך יש להם פרמטרים ברזולוציית תמונה נמוכה. הפרוטוקול המוצג כאן לרישום סידן חולף מאפשר רזולוציה מרחבית-טמפורלית טובה ביותר המסופקת על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית.
מבוא
הבעיה של מדידת גלי סידן מהירים בתאים מעוררים היא אחד ההיבטים החשובים והמאתגרים ביותר בחקר העברת אותות במערכת העצבים המרכזית וההיקפית. יוני סידן ממלאים תפקיד חשוב בהפעלת שחרור מוליכים עצביים, פלסטיות סינפטית וויסות הפעילות של חלבונים תוך-תאיים שונים 1,2,3,4,5. חקר איתות סידן חשוב גם למציאת דרכים לטיפול במחלות נוירודגנרטיביות6. כדי למדוד שינויים ברמות הסידן, צבעים פלואורסצנטיים רגישים לסידן נמצאים בשימוש נפוץ, ושינויים ברמת הפלואורסצנטיות שלהם מנותחים
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
ניסויים בוצעו על תכשירים מבודדים של שריר עצב של levator auris longus (m. LAL) מהעכברים BALB/C (20-23 גרם, 2-3 חודשים)41. הליכי הניסוי בוצעו בהתאם להנחיות לשימוש בחיות מעבדה של האוניברסיטה הפדרלית של קאזאן והאוניברסיטה הרפואית של קאזאן, בהתאם למדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. פרוטוקול הניסוי עמד בדרישות דירקטיבה 86/609/EEC של מועצת הקהילות האירופית ואושר על ידי הוועדה האתית של האוניברסיטה הרפואית של קאזאן.
1. הכנת פתרונות הצלצול והתיוק
- הכינו את התמיסה של הצלצול לשריר היונקים על ידי ערבוב המרכיבים הבאים: NaCl (137 mM), KCl (5 mM), CaCl 2 (2 mM), MgCl 2 (1 mM), NaH....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
לאחר טעינת התכשיר בצבע על פי הטכניקה המוצגת, לרוב הסינפסות הממוקמות קרוב לגדם העצב הייתה רמה מספקת של פלואורסצנטיות (ראו איור 2). לאחר טעינת ההכנה עם הצבע ויישום השיטה המתוארת של רישום ועיבוד תמונה, התקבלו ארעי סידן ברזולוציה המרחבית והזמנית הרצויה (ראו איור 4). מעבר הסידן שוחזר בשיטה המוצעת (ראו איור 3).
כמו כן נותחו פרמטרים של משרעת וזמן של האותות המשוחזרים. הנתונים הממוצעים מוצגים בלוח 1
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השיטה להעמסת צבע רגיש Ca2+ לתוך קצות העצבים של העכבר דרך גדם העצב ולרישום מעבר סידן מהיר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי מוצגת במאמר זה. כתוצאה מיישום שיטת העמסה זו, לרוב הסינפסות הממוקמות קרוב לגדם העצב הייתה רמה מספקת של פלואורסצנטיות כדי לאפשר רישום של כניסת סידן לקצות העצבים בתגובה לגירוי בתדר נמוך של העצב המוטורי.
שלא כמו הפרוטוקולים שהוצגו בעבר לטעינת צבעי סידן דרך הגדם, פרוטוקול זה מיועד לשימוש על סינפסות יונקים. פרוטוקולים קודמים ששימשו בתכשירים של בעלי חיים בדם קר דרשו דגירה של .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
מחקרים פלואורסצנטיים של עבודה זו בוצעו בתמיכה כספית של מענק קרן המדע הרוסית (פרויקט מס '19-15-00329). השיטה פותחה במימון המשימה הממשלתית עבור המרכז המדעי FRC קאזאן של RAS ААААА-А18-118022790083-9. המחקר פותח תוך שימוש בציוד של מרכז המחקר הפדרלי "מרכז מדעי קאזאן של RAS". המחברים מבקשים להודות לד"ר ויקטור א. איליין על הקריאה הביקורתית של כתב יד זה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מכשירים אלקטרו-רפואיים | מזכוכית נימית | GC150-10 | |
| מערכת מיקרוסקופ קונפוקלי ורב-פוטוני Leica TCS SP5 MP | Leica Microsystems, היידלברג, גרמניה | ||
| חולץ מיקרופיפטה בוער/חום P 97 | Sutter Instrument, ארה"ב | P-97 | |
| ווסת זרימה | KD Medical GmbH מוצרי בית חולים, גרמניה | KD REG | סט עירוי חד פעמי עם ווסת זרימה |
| HEPES | Sigma-Aldrich, ארה"ב | H0887 | 100 מ"ל |
| מערכת תאורה Leica CLS 150X | Leica Microsystems, גרמניה | ||
| ImageJ | המכונים הלאומיים לבריאות, ארה"ב | http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html | |
| תוכנת Las AF | Leica Microsystems, היידלברג, גרמניה | ||
| Las X software | Leica Microsystems, היידלברג, גרמניה | ||
| https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/ מחזיק מגנטי עם צינורות יניקה | BIOSCIENCE TOOLS, USA | MTH-S | |
| Microspin FV 2400 | Biosan, לטביה | BS-010201-AAA | |
| Minutien Pins | כלים מדעיים משובחים, קנדה | 26002-20 | |
| Multi-spin MSC 3000 | Biosan, לטביה | BS-010205-AAN | |
| אורגון ירוק 488 BAPTA-1 פנטפוטלסיום | מלח בדיקות מולקולריות, ארה"ב | O6806 | 500 μ g |
| Pipette | Biohit, רוסיה | 720210 | 0.5-10 ומיקרו; |
| L קצה פיפטה | Biohit, רוסיה | 781349 | 10 ומיקרו; L |
| פלסטלינה | יצרן | ||
| מחטים היפודרמיות חד פעמיות | Bbraun | 100 Sterican | 0.4 & |
| תוכנית גיליון אלקטרוני | מיקרוסופט, ארה"ב | מיקרוסופט אופיס אקסל | |
| סטריאומיקרוסקופ, Leica M80 | Leica Microsystems, גרמניה | ||
| אלקטרודת יניקה | קזאקוב א. אלקטרודת יניקה פשוטה לגירוי חשמלי של עצמים ביולוגיים / א. קזקוב, מ. אלכסנדרוב, נ. ו. ז'יליאקוב ואחרים // כתב עת מחקר בינלאומי. - 2015. - מס '9 (40) חלק 3. - עמ '13-16. | http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/ | |
| סילגארד 184 אלסטומר | דאו קורנינג, ארה"ב | ||
| מזרק | מקומי יצרן | 0.5 מ"ל | |
| מזרק | מקומי 60 | מ"ל |
מקורות
- Llinas, R., Steinberg, I. Z., Walton, K. Presynaptic calcium currents and their relation to synaptic transmission: voltage clamp study in squid giant synapse and theoretical model for the calcium gate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (8), 2918-2922 (1976).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
