הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

חקירה ספקטרומטרית מסה רבת פנים של נוירופפטידים בקלינקטס ספידוס

2.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63322

⸱

31 במאי 2022

 ,  , 
1Department of Chemistry, University of Wisconsin-Madison, 2School of Pharmacy, University of Wisconsin-Madison

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

אפיון ספקטרומטרי של מסה של נוירופפטידים מספק מידע על רצף, כמות ולוקליזציה. זרימת עבודה אופטימלית זו שימושית לא רק למחקרי נוירופפטידים, אלא גם לפפטידים אנדוגניים אחרים. הפרוטוקולים המובאים כאן מתארים הכנת דגימות, רכישת טרשת נפוצה, ניתוח טרשת נפוצה ויצירת מסדי נתונים של נוירופפטידים באמצעות LC-ESI-MS, איתור MALDI-MS והדמיית MALDI-MS.

תקציר

נוירופפטידים מאותתים על מולקולות המווסתות כמעט את כל התהליכים הפיזיולוגיים וההתנהגותיים, כגון התפתחות, רבייה, צריכת מזון ותגובה לגורמי עקה חיצוניים. עם זאת, המנגנונים הביוכימיים וההשלמה המלאה של הנוירופפטידים והתפקידים התפקודיים שלהם עדיין אינם מובנים היטב. אפיון הפפטידים האנדוגניים האלה נפגע על ידי המגוון העצום בתוך סוג זה של מולקולות איתות. בנוסף, נוירופפטידים הם ביו-אקטיביים בריכוזים נמוכים פי 100 - פי 1000 מזה של נוירוטרנסמיטורים והם נוטים להתפרקות אנזימטית לאחר שחרור סינפטי. ספקטרומטריית מסות (MS) היא כלי אנליטי רגיש ביותר שיכול לזהות, לכמת ולמקם אנליטים ללא ידע א-פריורי מקיף. הוא מתאים היטב ליצירת פרופיל גלובלי של נוירופפטידים ולסיוע בגילוי של פפטידים חדשים. בשל השפע הנמוך והמגוון הכימי הגבוה של סוג זה של פפטידים, מספר שיטות להכנת דגימות, פרמטרים לרכישת טרשת נפוצה ואסטרטגיות ניתוח נתונים הותאמו מטכניקות פרוטאומיקה כדי לאפשר אפיון נוירופפטידי אופטימלי. כאן מתוארות שיטות לבידוד נוירופפטידים מרקמות ביולוגיות מורכבות לצורך אפיון רצף, כמות ולוקליזציה באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית (LC)-MS וספיגת/יינון לייזר בסיוע מטריצה (MALDI)-MS. פרוטוקול להכנת מסד נתונים נוירופפטידי מהסרטן הכחול, Callinectes sapidus, אורגניזם ללא מידע גנומי מקיף, נכלל. ניתן להתאים זרימות עבודה אלה לחקר סוגים אחרים של פפטידים אנדוגניים במינים שונים באמצעות מגוון מכשירים.

מבוא

מערכת העצבים מורכבת ודורשת רשת של נוירונים כדי להעביר אותות ברחבי האורגניזם. מערכת העצבים מתאמת מידע חושי ותגובה ביולוגית. האינטראקציות המורכבות והמפותלות המעורבות בהעברת אותות דורשות מולקולות איתות רבות ושונות כגון נוירוטרנסמיטורים, סטרואידים ונוירופפטידים. מכיוון שנוירופפטידים הם מולקולות האיתות המגוונות והחזקות ביותר הממלאות תפקידי מפתח בהפעלת תגובות פיזיולוגיות ללחץ ולגירויים אחרים, מעניין לקבוע את תפקידם הספציפי בתהליכים פיזיולוגיים אלה. תפקוד הנוירופפטידים קשור למבנה חומצות האמינו שלהם, הקובע את הניידות, האינטראקציה עם הקולטנים וזיקה1. טכניקות כגון היסטוכימיה, שהיא חשובה משום שניתן לסנתז, לאחסן ולשחרר נוירופפטידים באזורים שונים של הרקמה, ואלקטרופיזיולוגיה שימשה כדי לחקור את המבנה והתפקוד של הנוירופפטידים 2,3,4, אך שיטות אלה מוגבלות על ידי תפוקה וספציפיות כדי לפתור את מגוון הרצף העצום של הנוירופפטידים.

ספקטרומטריית מסות (MS) מאפשרת ניתוח תפוקה גבוהה של מבנה נוירופפטידים ושפע. ניתן לבצע זאת באמצעות טכניקות שונות של טרשת נפוצה, בדרך כלל כרומטוגרפיה נוזלית-יינון אלקטרוספריי MS (LC-ESI-MS)5 ו-MS ספיגה/יינון לייזר בסיוע מטריצה (MALDI-MS)6. באמצעות מדידות מסה ברמת דיוק גבוהה ופיצול טרשת נפוצה, טרשת נפוצה מספקת את היכולת להקצות רצף חומצות אמינו ומצב של שינוי לאחר התרגום (PTM) לנוירופפטידים מתערובות מורכבות ללא ידע א-פריורי כדי לסייע באיתור תפקודם 7,8. בנוסף למידע איכותני, טרשת נפוצה מאפשרת מידע כמותי של נוירופפטידים באמצעות כמות ללא תוויות (LFQ) או שיטות מבוססות תווית כגון תיוג איזוטופי או איזוברי9. היתרונות העיקריים של LFQ כוללים את הפשטות שלו, עלות נמוכה של ניתוח, וירידה בשלבי הכנת הדגימה שיכולים למזער את אובדן הדגימה. עם זאת, החסרונות של LFQ כוללים עלויות זמן מכשיר מוגברות מכיוון שהוא דורש שכפולים טכניים מרובים כדי לטפל בשגיאות כמותיות מהשונות בריצה לריצה. זה גם מוביל לירידה ביכולת לכמת במדויק וריאציות קטנות. שיטות מבוססות תווית נתונות לשונות פחות שיטתית מכיוון שניתן לסמן דגימות מרובות באופן דיפרנציאלי באמצעות מגוון איזוטופים יציבים, לשלב אותן בדגימה אחת ולנתח אותן באמצעות ספקטרומטריית מסות בו זמנית. זה גם מגדיל את התפוקה, אם כי תוויות איזוטופיות יכולות לגזול זמן רב ויקר לסנתז או לרכוש. המורכבות הספקטרלית של ספקטרום מסת סריקה מלאה (MS1) עולה גם היא ככל שהריבוב עולה, מה שמקטין את מספר הנוירופפטידים הייחודיים המסוגלים להיות מפוצלים ולכן, מזוהים. לעומת זאת, תיוג איזוברי אינו מגביר את המורכבות הספקטרלית ברמת MS1, אם כי הוא מציב אתגרים לאנליטים בעלי שפע נמוך כגון נוירופפטידים. מכיוון שהכמות האיזוברית מתבצעת ברמת ספקטרום מסת יון השבר (MS2), ייתכן שלא ניתן יהיה לכמת נוירופפטידים בעלי שפע נמוך מכיוון שניתן לבחור רכיבי מטריצה שופעים יותר לפיצול וייתכן שלמי שנבחר אין שפע גבוה מספיק כדי לכמת אותם. עם תיוג איזוטופי, ניתן לבצע כמות על כל פפטיד מזוהה.

בנוסף לזיהוי וכימות, ניתן לקבל מידע לוקליזציה על ידי MS באמצעות הדמיית MALDI-MS (MALDI-MSI)10. על-ידי רסטר לייזר על פני משטח דגימה, ניתן לקמפל ספקטרה של MS לתמונת מפת חום עבור כל ערך m/z . מיפוי עוצמת האותות הנוירופפטידיים הארעיים באזורים שונים על פני מצבים שונים יכול לספק מידע רב ערך לקביעת תפקוד11. לוקליזציה של נוירופפטידים חשובה במיוחד מכיוון שתפקוד הנוירופפטידים עשוי להשתנות בהתאם למיקום12.

נוירופפטידים נמצאים בשפע נמוך יותר in vivo מאשר מולקולות איתות אחרות, כגון מוליכים עצביים, ולכן דורשים שיטות רגישות לגילוי13. ניתן להשיג זאת באמצעות הסרת רכיבי מטריצת שפע גבוהים יותר, כגון שומנים11,14. שיקולים נוספים לניתוח נוירופפטידים צריכים להיעשות בהשוואה לתהליכי עבודה נפוצים של פרוטאומיקה, בעיקר משום שרוב הניתוחים הנוירו-פפטידומיים משמיטים עיכול אנזימטי. זה מגביל את אפשרויות התוכנה לניתוח נתונים של נוירופפטידים מכיוון שרובם נבנו עם אלגוריתמים המבוססים על נתוני פרוטאומיקה והתאמות חלבונים המבוססות על זיהוי פפטידים. עם זאת, תוכנות רבות כגון PEAKS15 מתאימות יותר לניתוח נוירופפטידים בשל יכולות ריצוף דה נובו שלהן. יש לקחת בחשבון מספר גורמים לניתוח נוירופפטידים החל משיטת החילוץ ועד לניתוח נתוני טרשת נפוצה.

הפרוטוקולים המתוארים כאן כוללים שיטות להכנת דגימות ותיוג איזוטופי של דימתיל, איסוף נתונים וניתוח נתונים של נוירופפטידים על ידי LC-ESI-MS, MALDI-MS ו-MALDI-MSI. באמצעות תוצאות מייצגות ממספר ניסויים, מדגימים את התועלת והיכולת של שיטות אלה לזהות, לכמת ולמקם נוירופפטידים מסרטנים כחולים, Callinectes sapidus. כדי להבין טוב יותר את מערכת העצבים, מערכות מודל משמשות בדרך כלל. לאורגניזמים רבים אין גנום ברצף מלא זמין, מה שמונע גילוי נוירופפטידי מקיף ברמת הפפטיד. על מנת למתן את האתגר הזה, נכלל פרוטוקול לזיהוי נוירופפטידים חדשים וכריית תעתיקים ליצירת מסדי נתונים עבור אורגניזמים ללא מידע גנומי מלא. כל הפרוטוקולים המוצגים כאן יכולים להיות מותאמים לדגימות נוירופפטידים מכל מין, כמו גם ליישם לניתוח של כל פפטידים אנדוגניים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל דגימת הרקמות שתוארה בוצעה בהתאם להנחיות של אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון.

1. ניתוח LC-ESI-MS של נוירופפטידים

  1. מיצוי והתפלה של נוירופפטידים
    1. לפני רכישת רקמות, הכינו מתנול חומצי (acMeOH) (90:9:1 MeOH:water:acetic acid) כמתוארב-16.
    2. אספו רקמת מוח מהסרטנים17 והשתמשו במלקחיים כדי למקם מיד רקמה אחת כל אחת בצינור של 0.6 מ"ל המכיל 20 μL של acMeOH.
      הערה: פרוטוקולי כריתת רקמות משתנים מאוד עבור בעלי חיים שונים וסוגי רקמות שונים. הקורא מופנה לפרוטוקול17 לתיאור מפורט כיצד לנתח רקמת מוח וסוגי רקמות רבים אחרים מהסרטנים. ניתן לאחסן דגימות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש (באופן אידיאלי תוך 6 חודשים). הכרכים המתוארים משמשים למוח יחיד מ-Callinectes sapidus. יש לשנות את קנה המידה של הנפחים לגודל הרקמה. ניתן להקפיא את הרקמה באופן מיידי ללא ממס, אם כי הדבר אינו מומלץ מכיוון שאנזימים פרוטאוליטיים אנדוגניים לא יעוכבו ויישארו פעילים, אם כי בקצב איטי יותר כאשר הם קרים.
    3. הוסף 150 μL של acMeOH לדוגמה. קבעו את זמן הסאונדציה הכולל ל-24 שניות, את זמן הדופק ל-8 שניות, את זמן ההשהיה ל-15 שניות ואת המשרעת ל-50% על הומוגנייזר על-קולי וליצור הומוגניזציה של הדגימות על קרח.
      הערה: קיימות מערכות הומוגניזציה שונות זמינות. התאם את ההגדרות והתנאים בהתאם לסוג הדגימה ולציוד.
    4. צנטריפוגה הדגימה ב 4 °C ב 20,000 x g במשך 20 דקות. עם פיפטה, מעבירים את הסופרנטנט בצינור ומייבשים אותו ברכז ואקום (266 x גרם, 1 x 10-4 Torr) בערך 35 מעלות צלזיוס.
      הערה: ניתן לאחסן את הדגימות המיובשות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש (באופן אידיאלי תוך 6 חודשים). חימום רכז הוואקום חייב להתבצע בזהירות. בעוד החום מקצר את זמן היובש, יש להסיר את הדגימה מהרכז מיד לאחר שכל הנוזל התאדה כדי למזער את פירוק הפפטידים. כדי למנוע זאת, ניתן להשמיט את החימום מכך ומכל השלבים הבאים.
    5. לצורך התפלה, שחזרו את דגימת הרקמה המופקת ב-20 μL של 0.1% חומצה פורמית (FA), סובבו היטב את ה-sonicate ו-sonicate באמבט מים בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת.
      הערה: ישנם חומרי התפלה שונים זמינים. התאימו את הפתרונות והנפחים בהתאם לזהות השרף ולכמות הנוירופפטידים. ניתן להעריך את הכמות הכוללת של הפפטידים באמצעות בדיקת כמות פפטידים מסחרית (ראו טבלת חומרים).
    6. החל 0.5 μL של דגימה על רצועת pH כדי לאשר כי pH < 4. אם ה-pH גבוה יותר, הוסף 1 μL aliquots של 10% FA עד pH < 4.
    7. עקוב אחר פרוטוקול היצרן להתפלה18. הכינו תמיסת הרטבה המכילה 100 μL של 50% אצטוניטריל (ACN), תמיסת שיווי משקל המכילה 100 μL של 0.1% FA, תמיסת שטיפה המכילה 100 μL של 0.1% FA, ופתרונות אלוטיון המכילים 20 μL של 25% ACN/0.1% FA, 20 μL של 50% ACN/0.1% FA ו-20 μL של 75% ACN/0.1% FA.
    8. קבל קצה התפלה של 10 μL עם שרף C18 (ראה טבלת חומרים).
    9. מניחים את קצה ההתפלה על פיפטה של 20 μL המוגדרת ל-15 μL. לאחר שקצה ההתפלה רטוב, יש למנוע מעבר אוויר על ידי שמירה על הפיפטה מדוכאת כאשר היא מחוץ לתמיסה עד שהיא תושלך.
    10. שאפו את הקצה פי 3 עם תמיסת הרטבה ופי 3 עם תמיסת שיווי משקל. לשאוף במדגם 10x ואחריו לשטוף 3x בתמיסת שטיפה, להשליך כל שטיפה. Elute על ידי שאיפה פי 10 בכל אחד מתמיסות האלוטיון לפי סדר הגדלת ה-ACN.
      הערה: ניתן לשמור על שברים של Elution בנפרד או לשלב אותם לצורך ניתוחים נוספים.
    11. השליכו את קצה ההתפלה המשומש וייבשו את הנוירופפטידים המבוקסמים ברכז ואקום (266 x גרם, 1 x 10-4 Torr) בטמפרטורה של כ-35 מעלות צלזיוס.
      הערה: ניתן לאחסן זאת בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש (באופן אידיאלי תוך 6 חודשים).
  2. תיוג איזוטופי של נוירופפטידים בתמצית רקמה
    הערה: שלב זה הוא אופציונלי ומשמש רק כאשר יש צורך בכימות.
    1. הכינו את תמיסת הסימון האיזוטופית של 2-plex דימתיל במכסה אדים: 1% CH2OH2 (13.5 μL של מלאי 37 אחוזי משקל/משקל (wt. %) בתמיסת מים ב-486.5 μL של מים), 1% CH2OD2 (25 μL של מלאי 20 wt. % תמיסה ב-475 μL של מים), ו-0.03 M בוראן פירידין (3.75 μL של תמיסת 8 M במלאי ב-996.25 מיקרול של מים).
      אזהרה: פורמלדהיד הוא רעיל, ולכן כל הפתרונות צריכים להישמר במכסה מנוע מאוורר. לבשו כפפות, מעיל מעבדה, הגנה על העיניים ונעליים אטומות. אין להרכיב עדשות מגע בעת עבודה עם חומר זה.
      הערה: ישנם ריאגנטים איזוטופיים שונים; בחר את המתאימים בהתבסס על סוג לדוגמה ומספר ערוצי התוויות הרצויים.
    2. ממיסים תמצית נוירופפטידית גולמית ב-10 מיקרול' מים וסוניקטים למשך 10 דקות.
    3. הוסיפו 10 μL של תמיסת פורמלדהיד איזוטופית שונה (כלומר, CH2OH2, CH2OD2 וכו') לכל תנאי ניסוי שונה שיימדד באופן כמותי. מערבולת לערבוב טוב וצנטריפוגה קצרה של כל דגימה ב-2,000 x גרם.
    4. הוסף 10 μL של 0.03 M בוראן pyridine לכל צינור דגימה. מערבולת לערבוב טוב וצנטריפוגה קצרה של כל דגימה ב-2,000 x גרם.
    5. דגירה של הדגימות במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
    6. הסר את הדגימות מאמבטיית המים והוסף 10 μL של 100 mM אמוניום ביקרבונט. מערבולת לערבוב טוב וצנטריפוגה קצרה של כל דגימה ב-2,000 x גרם.
    7. שלב את הדגימות המסומנות עבור דגימה אחת של 2-plex וייבש את הנוירופפטידים ברכז ואקום (266 x גרם, 1 x 10-4 Torr) בערך 35 °C (35 °C).08.06.06.
    8. יש להשפיל את הנוירופפטידים המסומנים על ידי ביצוע מחדש של שלבים 1.1.5 - 1.1.10 ולאחסן אותם עד שיהיו מוכנים לאיסוף נתונים.
  3. רכישת נתונים
    1. שחזרו את הנוירופפטידים המותפלים המיובשים ב-12 μL של 3% ACN/0.1% FA, מערבולת היטב, סוניקטס באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, וצנטריפוגה קצרה ב-2,000 x גרם. העבר כל דגימה לבקבוקוני דגימה אוטומטית.
      הערה: התאם את נפח הדגימה לפי כמות הנוירופפטיד לריכוז של ~ 1 מיקרוגרם פפטיד לכל μL. ניתן להעריך את כמות הפפטיד הכוללת באמצעות בדיקת כמות פפטידים מסחרית (ראה טבלת חומרים) .
    2. השתמש בדגימה אוטומטית כדי להזריק 1 μL של דגימה למכשיר nano-LC-MS/MS ברזולוציה גבוהה (ראה טבלת חומרים).
    3. השתמש בעמודת C18 באורך של כ-15 ס"מ עם פאזה הפוכה (RP) (ראה טבלת חומרים) להפעלת הדגימה עם 0.1% FA במים כפאזה A ניידת ו-0.1% FA ב-ACN כשלב נייד B. הפעל את הדגימות עם שיפוע של 3% - 95% מ-B בקצב של 300 nL/min למשך יותר מ-11 דקות.
    4. עבור מכשיר הטרשת הנפוצה המשמש כאן, השתמש בתנאי MS נפוצים של 2.00 קילו-וולט למתח ריסוס ו-275 מעלות צלזיוס לטמפרטורה נימית.
    5. רכוש ספקטרום MS בטווח של 200 - 2,000 m/z עם רזולוציה של 60,000, יעד בקרת רווח אוטומטי (AGC) של 1 x 106, וזמן הזרקת יונים מרבי (IT) של 150 אלפיות השנייה.
    6. בחר את 15 היונים החזקים ביותר (עוצמה מינימלית של 3.2 x 104) עבור פיצול דיסוציאציה של התנגשות באנרגיה גבוהה יותר (HCD) באמצעות אנרגיית התנגשות מנורמלת של 30, חלון בידוד של 2.0 m/z, רזולוציה של 15,000, יעד AGC של 2 x 105, ו- IT מרבי של 250 אלפיות השנייה.
    7. הגדר חלון הרחקה דינמי של 30 שניות. לא לכלול יונים עם חיוב של 1 או ≥ 8 ויונים עם מצבי חיוב לא מוכרים.
  4. זיהוי וכימות נוירופפטידים
    הערה: תוכנות רבות לחיפוש מסדי נתונים וכימות פפטידים (הן בקוד פתוח והן במסחר) זמינות. כאן, PEAKS Studio (תוכנת פרוטאומיקה)15 ישמש.
    1. בצע חיפוש במסד נתונים באמצעות השלבים המתוארים ב- 1.4.2 - 1.4.6.
    2. צור פרויקט חדש והוסף את נתוני LC-MS הבוחרים ללא עבור האנזים, Orbitrap עבור המכשיר, HCD עבור השבר ורכישה תלוית נתונים (DDA) לרכישה.
      הערה: בחר את הפרמטרים המתאימים בהתבסס על פרמטרים של רכישת נתונים.
    3. בחר זיהויים ובחר מבשר נכון [DDA] ומסה בלבד.
    4. בחר חיפוש מסד נתונים והגדר סובלנות שגיאה של 20.0 ppm באמצעות מסה מונואיזוטופית עבור מסה מבשרת ו - 0.02 Da עבור מסת יון שבר, ללא עבור סוג אנזים, לא ספציפי למצב עיכול, 100 עבור מחשוף מקסימלי שהוחמצו, ואת המשתנה הבא PTMs עם המשתנה המרבי המותר PTM לכל פפטיד של 3: אימה, חמצון (M), Pyro-glu מ- E, ופירו-גלו מ-Q.
    5. בחר את מסד הנתונים של נוירופפטידים, הערך את שיעור הגילוי הכוזב (FDR) באמצעות היתוך דמה.
      הערה: יש להתאים את שגיאת עמידות ההמונים כך שתתאים לנתונים שנאספו. השתמש במסד הנתונים המתאים לסוג המדגם. כאשר לא נבחר אנזים, פרמטר הבקעים המקסימלי שהוחמצו אינו משפיע על החיפוש. עם זאת, נדרש מספר רב של מחשוף שהוחמצו אם לתוכנה אין את מצב העיכול שלא צוין כאופציה.
    6. אם רצוי כימות ללא תווית, בחר כימות, בחר Label-Free והגדר סובלנות שגיאה של 20.0 ppm וסובלנות זמן שמירה של 1.0 דקות.
    7. בצע כימות יונים מקדים אם בוצע שלב 1.2 לתיוג איזוטופי.
      1. בחר כימות, בחר כימות יונים מקדים, השתמש בטווח זמן שמירה של 1.0 דקות והשתמש בסף FDR של 1%.
      2. בחר שיטת כימות מוגדרת מראש או מותאמת אישית מהתפריט הנפתח 'בחר שיטה '.
      3. כדי ליצור שיטה מותאמת אישית חדשה, לחץ על > חלון > תצורה > Label Q Method > חדש. תן שם לשיטה החדשה ובחר כימות יונים מבשר עבור סוג השיטה. בחר הוסף שורה ובחר שינוי מהרשימה אפשרויות PTM.
      4. הוסף את נתוני ה- LC-MS ובחר תנאי ייחוס להיות השינוי על נוירופפטידים ממצב הבקרה של הניסוי.
    8. הערך את תוצאות החיפוש כמתואר בשלבים 1.4.9 - 1.4.11.
    9. סנן את התוצאות דרך לשונית הסיכום עבור פפטידים וחלבונים עם -10lgP ≥ 20, בחר ≥ 1 פפטיד ייחודי ובחר תיבה המסומנת בפפטידים משמעותיים.
    10. הערך את תוצאות החיפוש של מסד הנתונים כאשר protein.csv מייצג זיהוי נוירופפטידים ופפטיד.csv מייצג זיהוי שברים נוירופפטידיים.
    11. בדוק את מסד הנתונים בחיפוש אחר ציוני חלבונים ופפטידים, דיוק מסה וכיסוי רצפים.
      הערה: כל תוכנת חיפוש במסד נתונים משתמשת באלגוריתמים ייחודיים לניקוד וייתכן שיהיה צורך להעריך אותה בהתאם. ניתן להעריך זיהויים על ידי בדיקה ידנית של הספקטרום שנצפה עבור פפטידים מזוהים המכילים את סדרת יוני השבר השלמה.

2. ניתוח איתור MALDI-MS של נוירופפטידים

  1. הכנת דוגמאות
    1. בצע את שלב 1.1 או שלבים 1.1 - 1.2 אם יש צורך בכימות, למעט שלב 1.2.8 (התפלה לאחר תיוג איזוטופי אינה נדרשת לפני ניתוח MALDI-MS).
    2. שחזרו את הנוירופפטידים המותפלים המיובשים ב-5 μL של 0.1% FA, באר מערבולת, סוניקאט באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, וצנטריפוגה לזמן קצר ב-2,000 x גרם.
    3. לאיתור נוירופפטידים ברקמות סרטנים, הכינו 150 מ"ג/מ"ל 2,5-חומצה דיהידרוקסיבנזואית (DHB) ב-50% מתנול (MeOH)/0.1% FA (v/v) כמטריצה.
    4. פיפטה טיפה של 3 μL של דגימה על סרט הידרופובי (ראה טבלת חומרים) ופיפטה 3 μL של המטריצה ישירות על טיפת הדגימה. פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב.
    5. פיפטה 1 μL של דגימת 1:1: תערובת מטריצה לתוך באר של לוחית המטרה מפלדת אל-חלד MALDI. השתמשו בקצה הפיפטה כדי לפזר כל תערובת החוצה עד לקצות הדגימה היטב. הדגימה חייבת לגעת בשולי חריטת הבאר כדי לאפשר התפלגות אחידה (איור 4A).
    6. ספוט 1 μL של קליברנט 1:1:1:תערובת מטריצה (תערובת כיול מסחרית או מותאמת אישית, חומרים פולימריים (כלומר, זרחן אדום מומס ב- MeOH), או יוני צביר מטריצה נפוצים)12 לבאר ליד הדגימה.
      הערה: אין צורך לערבב זרחן אדום עם מטריצה לפני התצפית.
  2. רכישת נתונים
    1. הכנס לוחית מטרה המכילה כתמי דגימה מיובשים למכשיר MALDI Tandem Time-of-Flight (TOF/TOF) (ראה טבלת חומרים).
    2. עבור מטריצת DHB, הגדר את עוצמת הלייזר ל - 95%, בחר רווח גלאי אופטימלי אוטומטי, ו - Smart - מצב תנועה של מדגם מלא. רכשו ספקטרום טרשת נפוצה בטווח של 200 - 3200 מ"ק/z והוסיפו ספקטרום מרובה מכל נקודה יחד כדי להגדיל את יחס האות לרעש הנוירופפטידי.
      הערה: מטב את אחוז כוח הלייזר, רווח הגלאי ובחר את מצב התנועה המתאים של המוביל לדוגמה, כך שכל רכישה מכסה בערך את כל הנקודה והרכישות הבאות לא יעברו לעמדות הקודמות.
    3. כיול המכשיר.
      הערה: התאם את טווח המסה כך שיכלול את טווח הנוירופפטידים הרצוי.
  3. ניתוח נתונים
    1. פתח את קובץ MALDI-MS בתוכנת ניתוח נתונים (ראה טבלת חומרים) ולחץ על חיסור בסיסי עבור התוכנה המשמשת כאן.
    2. בצע בחירת שיא על-ידי לחיצה על מצא רשימת מסות. אם יש מעט מדי פסגות, ערוך את רשימת המסות באופן ידני על-ידי בחירה באפשרות ערוך רשימת מסות ולחץ על פסגות בספקטרום כדי להוסיף אותן לרשימת המסות.
    3. בצע התאמת מסה מדויקת על-ידי השוואת רשימת מסות עם מסד נתונים נוירופפטידי המכיל ערכי [M+H]+ m/z (± שגיאה של 200 ppm).
      הערה: תוספות מלח נפוצות, כגון [M+K]+, [M+Na]+, ו-[M+NH4]+, צריכות להיכלל גם הן ברשימת המטרות המדויקות להתאמת מסה.
    4. כדי לאמת את הפסגות שזוהו, צור רשימה של m/z של עניין ובצע ניסויי MS/MS.

3. ניתוח הדמיית MALDI-MS של נוירופפטידים

  1. הכנה לדוגמה
    הערה: שלבי ההטבעה והחתך אינם נחוצים לרקמות דקות מכדי שניתן יהיה לחתוך אותן.
    1. מלאו חצי קריוסטאט בג'לטין (37 מעלות צלזיוס, 100 מ"ג/מ"ל במים שעברו דה-יוניזציה) ואפשרו לה להתמצק בטמפרטורת החדר. שמרו על שאריות ג'לטין נוזלי חם באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
    2. אספו את הרקמה העצבית הרצויה מבעל החיים והשתמשו במלקחיים כדי לטבול את הרקמה באופן מיידי בצינור 0.6 מ"ל המכיל מים שעברו דה-יוניזציה במשך 1 שניות.
      הערה: עיין בשלב 1.1.2 הערה עבור כריתת רקמות עצביות.
    3. מניחים את הרקמה על גבי הג'לטין המוצק וממלאים את שארית הקריוסטט בג'לטין נוזלי. השתמש במלקחיים כדי למקם את הרקמה.
    4. מניחים את הקריוסטט על משטח שטוח ומקפיאים בקרח יבש.
      הערה: אחסן דוגמאות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש (באופן אידיאלי תוך 6 חודשים).
    5. להכנת חתך, הפרד את הדגימה המשובצת בג'לטין מתבנית הקריוסטט על ידי חיתוך העובש.
    6. הרכיבו את הרקמה המוטבעת על צ'אק קריוסטאט על ידי צנרת טיפה של 1 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה על הצ'אק ומיד לחיצה על הרקמה המוטבעת על הטיפה.
    7. לאחר הקפאה, פיפטה פיפטה יותר עיצבה מים סביב הרקמה כדי להדק אותם עוד יותר לצ'אק. בצע שלבים אלה בתוך תיבת cryostat (ראה טבלת חומרים) שנקבעה בטמפרטורה של -20 °C (75 °F).
    8. חתכו את הרקמה בעובי משוער של תא אחד (8-20 מיקרומטר בהתאם לסוג הדגימה) והפירו כל חלק על מגלשת זכוכית מצופה תחמוצת בדיל אינדיום (ITO) על ידי הצבת צד אחד של המגלשה ליד הקטע והנחת אצבע בצד השני של המגלשה כדי לחמם באיטיות את הזכוכית ולאפשר לקטע להיצמד למגלשה.
      הערה: ניתן גם להפשיר את חלקי הרקמה על ידי הרמת קצה אחד של הג'לטין עם פינצטה (מצוננת עד -20 מעלות צלזיוס), הנחתו על מגלשת הזכוכית המצופה ב-ITO והנחת אצבע בצד השני של המגלשה כדי לחמם באיטיות את הזכוכית ולאפשר לחלק להידבק למגלשה.
    9. זהה את הדגימה כך שתשמש כקליברנט (ראה שלב 2.1.6 לאפשרויות קליברנט) על ידי ציור עיגול קטן ליד קטע הרקמה באמצעות עט הידרופובי ואיתור הקליברנט בתוך המעגל.
    10. סמן כל פינה בשקופית בעט הלבנה עם צורה קטנה המכילה קצוות חדים (כלומר, x) שישמשו כנקודות לימוד.
    11. מקם את שקופית הזכוכית בלוח מתאם השקופיות של MALDI ובצע סריקת תמונה אופטית ברזולוציה גבוהה (≥2400 DPI) באמצעות סורק.
    12. מטריצת ריסוס על חלק הרקמה באמצעות מרסס אוטומטי (ראו טבלת חומרים לפרטים והוראות מרסס).
    13. עבור MSI של נוירופפטידים ברקמות סרטנים להשתמש 40 מ"ג / מ"ל DHB ב 50% מתנול / 0.1% FA (v / v) כמו המטריצה, להגדיר את טמפרטורת הזרבובית ל 80 ° C, מהירות ל 1,250 מ"מ לדקה, קצב זרימה ל 0.1 מ"ל לדקה, מספר מעברים ל 12, ו 30 s בין כל מעבר עבור המרסס האוטומטי.
  2. רכישת נתונים
    1. הכנס את צלחת המטרה המיובשת לחלוטין המכילה קטעי רקמה מופשרים שרוססו במטריצה.
    2. הגדר את הפרמטרים של קובץ רכישת ההדמיה של MS כך שקוטר הלייזר יהיה קטן מגודל שלב הרסטר.
    3. טען את התמונה האופטית הסרוקה וכייל את לוחית הדגימה באמצעות x נקודות לימוד. הגדירו את אזורי העניין של הרקמה כך שיימדדו מעט גדולים יותר מקטע הרקמה בפועל כך שיכללו גם אזורים המכילים מטריצה בלבד.
    4. כיול המכשיר ורכישת ספקטרה בטווח של 200 - 3200 מ '/z. התאם את טווח המסה כך שיכלול את טווח הנוירופפטידים הרצוי.
  3. ניתוח נתונים
    1. כדי לעבד נתונים, יבא ערכת נתונים של הדמיית MS לתוכנה הרצויה, בחר אלגוריתם הסרה בסיסי ונרמל נתונים באמצעות ספירת היונים הכוללת.
      הערה: בחירה של אלגוריתמי נורמליזציה שונים, כגון חציון, ערך ריבוע ממוצע שורש (RMS), או עוצמת ערך m/z הפניה, תשנה ככל הנראה את ההתפלגות המרחבית של ערכי m/z רבים. בחר את אלגוריתם הנורמליזציה המתאים ביותר לאנליטים הרצויים.
    2. כדי ליצור תמונה עבור כל ערך m/z מרשימת שיא תיאורטית, העלה קובץ ערכים מופרדים בפסיקים (CSV) המכיל נוירופפטיד [M+H]+, [M+Na]+, [M+NH4]+וכו'. השג ערכי m/z על-ידי לחיצה על קובץ > ייבוא רשימת שיא >. תן שם לרשימת השיאים.
    3. כדי להעריך את סף השגיאה המתאים ל-ppm, תחילה זהה באופן ידני שיא נוירופפטידי בספקטרום הטרשת הנפוצה והשווה אותו למסה התיאורטית של הנוירופפטיד. חשב את שגיאת ה- ppm ולחץ על מאפייני קובץ > קובץ > רוחב מרווח ושגיאת קלט ppm.
    4. בחר את רשימת השיא מהתפריט הנפתח ולחץ על צור תמונות m/z עבור כל מרווח של רשימת השיא.
    5. שמור כל תמונה m/z על-ידי לחיצה על שמור צילום מסך של כל תמונה m/z.
      הערה: זיהוי נוירופפטידי פוטטיבי יכול להתבצע על ידי זיהוי תמונות m/z שבהן אות האנליט נמצא רק בתוך הרקמה ולא במטריצה הסובבת אותה.
    6. כדי לאמת את זהות השיא, צור רשימה של m/z של עניין ובצע ניסויי MS/MS.

4. גילוי נוירופפטידים פוטטיביים חדשניים באמצעות ריצוף דה נובו

  1. בצע שלבים 1.4.2 - 1.4.5.
  2. ייצוא פפטידים דה נובו בלבד.csv מתוכנת PEAKS עם ציון ממוצע של ביטחון מקומי (ALC) של ≥ 75.
    הערה: ישנן תוכנות רבות הזמינות לביצוע ריצוף דה נובו , כל אחת עם אלגוריתמי ניקוד משלה ויש להעריך אותה בהתאם.
  3. חפש ברשימת הפפטידים מוטיבים ידועים של רצף המעידים על נוירופפטידים השייכים למשפחות נוירופפטידים ספציפיות19.
    הערה: בעוד שמוטיבים נשמרים בדרך כלל היטב בין מינים, יש לבחור את המוטיבים שחיפשו תוך התחשבות באורגניזם המדגם.

5. כריית תעתיק לרצפי נוירופפטידים חזויים

הערה: שלב זה הוא אופציונלי ומשמש רק להוספה למסד נתונים קיים של נוירופפטידים או לבניית מסד נתונים חדש של נוירופפטידים.

  1. בחר רצף ידוע של חומצות אמינו פרה-פרוהורמון המעניין והשתמש ב- tBLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_PROGRAMS=tblastn&PAGE
    _TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK
    _LOC=blasthome) כדי לחפש רצף פרה-פרוהורמון של שאילתה כנגד מסדי נתונים הכוללים nr/nt, Refseq_genomes, EST ו-TSA.
    הערה: כדי לחפש רצפי שאילתות כנגד מסד נתונים של חלבונים, השתמש ב- BLASTp (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE
    _TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&BLAST
    _SPEC=&LINK_LOC=blasttab&LAST_PAGE=tblastn).
    1. בחר את אורגניזם היעד (מזהה מס) ושנה את הפרמטרים של אלגוריתם הסף של Expect ל - 1000 כדי לכלול יישורים בעלי ניקוד נמוך.
    2. הפעל את תוכנית BLAST ולאחר מכן בדוק את התוצאות לקבלת ציונים הומולוגיים גבוהים בין רצפי שאילתה ונושאים היוצרים יישורים משמעותיים. שמור קובץ FASTA המכיל רצף נוקלאוטידים.
      הערה: אם ישנם מספר רצפי נושאים עם ציוני הומולוגיה דומים, בצע יישור MAFFT כדי לצמצם רצפים פוטטיביים20,21.
  2. תרגם את רצף הנוקלאוטידים הפרה-פרוהורמון לרצפי פפטידים פרה-פרוהורמונים באמצעות הכלי Expasy Translate (https://web.expasy.org/translate/). עבור C. sapidus, בחר מיטוכונדריאלי חסר חוליות עבור קוד גנטי.
  3. בדוק אם יש רצף פפטידי אותות ואתרי ביקוע פרוהורמון ברצפי הפפטידים באמצעות SignalP (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP).
    הערה: הומולוגיה לסכימות עיבוד קדם-פרוהורמון ידועות יכולה לשמש גם לזיהוי אתרי ביקוע פרוהורמון. ניתן לחזות שינויים אפשריים לאחר התרגום עבור פפטידי אותות אם תרצה בכך. ניתן להשתמש בסולפינטור (https://web.expasy.org/sulfinator/) כדי לחזות מצב גופרית של שאריות טירוזין. ניתן להשתמש ב-DiANNA (http://clavius.bc.edu/~clotelab/DiANNA/) כדי לחזות קישוריות קשר דיסולפידית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

זרימת העבודה להכנת דגימות ולניתוח טרשת נפוצה מתוארת באיור 1. לאחר כריתה של רקמה עצבית, הומוגניזציה, מיצוי והתפלה מבוצעים כדי לטהר דגימות נוירופפטידים. אם רוצים כימות מבוסס תווית איזוטופית, דגימות מסומנות ומתותפלות שוב. הדגימה המתקבלת מנותחת באמצעות LC-MS/MS לצורך זיהוי וכימות נוירופפטידים.

נוירופפטידים שזוהו באמצעות תוכנת הפרוטאומיקה צריכים להיות בעלי כיסוי טוב של רצף פיצול פפטידים, אולם הדבר אינו מוגדר או מתוקנן באופן גלובלי. לצורך זיהוי מוחלט, כל חומצת אמינו אמו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הזיהוי המדויק, הכימות והלוקליזציה של נוירופפטידים ופפטידים אנדוגניים שנמצאים במערכת העצבים חיוניים להבנת תפקודם23,24. ספקטרומטריית מסות היא טכניקה רבת עוצמה שיכולה לאפשר לכל זה להתבצע, אפילו באורגניזמים ללא גנום בעל רצף מלא. מדגימה היכולת של פרוטוקול זה לזהות, לכמת ולמקם נוירופפטידים מרקמה שנאספה מ-C. sapidus באמצעות שילוב של LC-ESI ו-MALDI-MS.

במהלך הכנת מדגם לניתוח LC-ESI-MS, יש לקחת בחשבון. בעוד ש-MS היא טכניקה רגישה, הריכו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע (CHE-1710140 ו- CHE-2108223) ומכוני הבריאות הלאומיים (NIH) באמצעות מענק R01DK071801. A.P. נתמך בחלקו על ידי מענק ההדרכה לממשק כימיה-ביולוגיה של NIH (T32 GM008505). N.V.Q. נתמך בחלקו על ידי המכונים הלאומיים לבריאות, תחת פרס שירות המחקר הלאומי של רות ל. קירששטיין מהמכון הלאומי לריאות ודם ללב למרכז לחקר הלב וכלי הדם של אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון (T32 HL007936). L.L. רוצה להכיר במענקי NIH R56 MH110215, S10RR029531 ו- S10OD025084, כמו גם תמיכה במימון של פרופסורה להישגים מצטיינים של וילאס ופרופסור צ'ארלס מלבורן ג'ונסון במימון הקרן לחקר בוגרי ויסקונסין ובית הספר לרוקחות של אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<>כימיקלים חזקים, ריאגנטים וחומרים מתכלים
2,5-חומצה דיהידרוקסיבנזואית (DHB) מטריצתSupelco39319
חומצה אצטיתפישר כימיקלA38S-500
אצטוניטריל אופטימה LC/MS כיתהפישר כימיקלA955-500
אמוניום ביקרבונטסיגמא-אולדריץ'9830
בוראן פירידין, סיגמא-אולדריץ'179752
תערובת כיול פפטידיםBruker Bruker DaltonicsNC9846988
נימיPolymicro1068150019ליצירת עמודת ננו-זרימה (75 ומיקרו; קוטר פנימי m x 360 ומיקרו; קוטר חיצוני מ ')
קריוסטטסיגמא-אולדריץ'E6032כל או תבנית צריכה לעבוד
  צינורות מיקרוצנטריפוגהאפנדורף30108434
פורמלדהידסיגמא-אולדריץ'252549
פורמלדהיד - D2סיגמא-אולדריץ'492620
חומצה פורמית אופטימה LC/MS כיתהפישר כימיקלA117-50
ג'לטיןדיפקו214340מקום ב 37 מעלות; אמבט מים C להמסת
עט מחסום הידרופוביVector Labs15553953
מגלשות זכוכית מצופות תחמוצת פח אינדיום (ITO) DeltaTechnologiesCB-90IN-S10725 מ"מ x 75 מ"מ x 0.8 מ"מ (רוחב x אורך x עובי)
בקבוקוני LC-MSתרמוTFMSCERT5000-30LVW
מתנול אופטימה LC/MS כיתהפישר כימיA456-500
פרפילםSigma-AldrichP7793סרט הידרופובי
רצועות מחוון pHSupelco109450
אשכולות זרחן אדוםSigma-Aldrich343242
חומר שלב C18 הפוךמים186002350ארוז ידנית בעמודת ננו-זרימה
עט Wite-outBIC150810
ZipTipMilliporeZ720070
<חזק>מכשירים וכלים
מערכת מרסס מטריקס אוטומטית- M5HTX Technologies, LLC
צנטריפוגה - 5424 REppendorf05-401-205
קריוסטט- HM 550Thermo Fisher Scientific956564A
מייבש מייבש2088701
מלקחייםWPI501764
MALDI צלחת יעד מנירוסטהBruker Daltonics8280781
Pipet-Lite XLSRainin17014391 200 ומיקרו; L
Q Exactive Plus היברידי Quadrupole-OrbitrapThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMBDK
RapifleX MALDI-TOF/TOFBruker Daltonics
SpeedVac - SVC100SavantSVC-100D
מנקה אולטרסאונדBransonic2510R-MTHלסוניקציה
הומוגנייזר קוליפישר סיינטיפיקFB120110FB120 Sonic Dismembrator עם משאבת ואקום בדיקה CL-18
Alcatel 2008 מוצריואקום אידיאלייםP10976לחץ אולטימטיבי = 1 x 10-4 Torr
Vortex MixerCorning6775
אמבט מים (37C) - Isotemp 110Fisher Scientific15-460-10
<חזק>תוכנת ניתוח נתונים
Expasyhttps://web.expasy.org/translate/
FlexAnalysisBruker Daltonics
FlexControlBruker Daltonics
FlexImagingBruker Daltonics
PEAKS StudioBioinformatics Solutions, Inc.
מעבדת SCiLShttps://scils.de/
SignalP 5.0https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0
tBLASTnhttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_
תוכניות=tblastn& PAGE_
TYPE=BlastSearch& SHOW_
ברירות מחדל=מופעל& LINK_LOC
= blasthome
של -

מקורות

  1. Hökfelt, T., et al. Neuropeptides - an overview. Neuropharmacology. 39 (8), 1337-1356 (2000).
  2. Radhakrishnan, V., Henry, J. L. Electrophysiology of neuropeptides in the sensory spinal cord. Progress in Brain Research. 104, 175-195 (1995).
  3. Nässel, D. R., Ekström, P. Detection of neuropeptides by immunocytochemistry. Methods in Molecular Biology. 72, clifton, N.J. 71-101 (1997).
  4. Martins, J., et al. Activation of Neuropeptide Y Receptors Modulates Retinal Ganglion Cell Physiology and Exerts Neuroprotective Actions In Vitro. ASN Neuro. 7 (4), 1759091415598292(2015).
  5. Racaityte, K., Lutz, E. S. M., Unger, K. K., Lubda, D., Boos, K. S. Analysis of neuropeptide Y and its metabolites by high-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry and integrated sample clean-up with a novel restricted-access sulphonic acid cation exchanger. Journal of Chromatography. A. 890 (1), 135-144 (2000).
  6. Salisbury, J. P., et al. A rapid MALDI-TOF mass spectrometry workflow for Drosophila melanogaster differential neuropeptidomics. Molecular Brain. 6, 60(2013).
  7. Schmerberg, C. M., Li, L. Function-driven discovery of neuropeptides with mass spectrometry-based tools. Protein and Peptide Letters. 20 (6), 681-694 (2013).
  8. Lee, J. E. Neuropeptidomics: Mass Spectrometry-Based Identification and Quantitation of Neuropeptides. Genomics & Informatics. 14 (1), 12-19 (2016).
  9. Sauer, C. S., Phetsanthad, A., Riusech, O. L., Li, L. Developing mass spectrometry for the quantitative analysis of neuropeptides. Expert Review of Proteomics. 18 (7), 607-621 (2021).
  10. Pratavieira, M., et al. MALDI Imaging Analysis of Neuropeptides in Africanized Honeybee ( Apis mellifera) Brain: Effect of Aggressiveness. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2358-2369 (2018).
  11. Buchberger, A. R., Vu, N. Q., Johnson, J., DeLaney, K., Li, L. A Simple and Effective Sample Preparation Strategy for MALDI-MS Imaging of Neuropeptide Changes in the Crustacean Brain Due to Hypoxia and Hypercapnia Stress. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (5), 1058-1065 (2020).
  12. Vu, N. Q., DeLaney, K., Li, L. Neuropeptidomics: Improvements in Mass Spectrometry Imaging Analysis and Recent Advancements. Current Protein & Peptide Science. 22 (2), 158-169 (2021).
  13. Li, L., Sweedler, J. V. Peptides in the brain: mass spectrometry-based measurement approaches and challenges. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 451-483 (2008).
  14. Li, N., et al. Sequential Precipitation and Delipidation Enables Efficient Enrichment of Low-Molecular Weight Proteins and Peptides from Human Plasma. Journal of Proteome Research. 19 (8), 3340-3351 (2020).
  15. Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (4), (2012).
  16. Sturm, R. M., Greer, T., Woodards, N., Gemperline, E., Li, L. Mass spectrometric evaluation of neuropeptidomic profiles upon heat stabilization treatment of neuroendocrine tissues in crustaceans. Journal of Proteome Research. 12 (2), 743-752 (2013).
  17. Gutierrez, G. J., Grashow, R. G. Cancer borealis stomatogastric nervous system dissection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1207(2009).
  18. Sample Preparation for Mass Spectrometry. Merck. , Available from: http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737 (2021).
  19. DeLaney, K., et al. PRESnovo: Prescreening Prior to de novo Sequencing to Improve Accuracy and Sensitivity of Neuropeptide Identification. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1358-1371 (2020).
  20. Oleisky, E. R., Stanhope, M. E., Hull, J. J., Christie, A. E., Dickinson, P. S. Differential neuropeptide modulation of premotor and motor neurons in the lobster cardiac ganglion. Journal of Neurophysiology. 124 (4), 1241-1256 (2020).
  21. Ma, M., et al. Combining in silico transcriptome mining and biological mass spectrometry for neuropeptide discovery in the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei. Peptides. 31 (1), 27-43 (2010).
  22. Christie, A. E., Stemmler, E. A., Dickinson, P. S. Crustacean neuropeptides. Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67 (24), 4135-4169 (2010).
  23. DeLaney, K., et al. New techniques, applications and perspectives in neuropeptide research. The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 3 (2018).
  24. Habenstein, J., et al. Transcriptomic, peptidomic, and mass spectrometry imaging analysis of the brain in the ant Cataglyphis nodus. Journal of Neurochemistry. 158 (2), 391-412 (2021).
  25. Maes, K., et al. Improved sensitivity of the nano ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis of low-concentrated neuropeptides by reducing aspecific adsorption and optimizing the injection solvent. Journal of Chromatography. A. 1360, 217-228 (2014).
  26. Li, G., et al. Nanosecond photochemically promoted click chemistry for enhanced neuropeptide visualization and rapid protein labeling. Nature Communications. 10 (1), 4697(2019).
  27. Corbière, A., et al. Strategies for the Identification of Bioactive Neuropeptides in Vertebrates. Frontiers in Neuroscience. 13, 948(2019).
  28. Chen, R., Ma, M., Hui, L., Zhang, J., Li, L. Measurement of neuropeptides in crustacean hemolymph via MALDI mass spectrometry. Journal of American Society for Mass Spectrometry. 20 (4), 708-718 (2009).
  29. Fridjonsdottir, E., Nilsson, A., Wadensten, H., Andrén, P. E. Brain Tissue Sample Stabilization and Extraction Strategies for Neuropeptidomics. Peptidomics: Methods and Strategies. , Springer Protocols. New York,NY. 41-49 (2018).
  30. Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
  31. Phetsanthad, A., et al. Recent advances in mass spectrometry analysis of neuropeptides. Mass Spectrometry Reviews. , 21734(2021).
  32. Pérez-Cova, M., Bedia, C., Stoll, D. R., Tauler, R., Jaumot, J. MSroi: A pre-processing tool for mass spectrometry-based studies. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 215, 104333(2021).
  33. Christie, A. E., Chi, M. Prediction of the neuropeptidomes of members of the Astacidea (Crustacea, Decapoda) using publicly accessible transcriptome shotgun assembly (TSA) sequence data. General and Comparative Endocrinology. 224, 38-60 (2015).
  34. Livnat, I., et al. A d-Amino Acid-Containing Neuropeptide Discovery Funnel. Analytical Chemistry. 88 (23), 11868-11876 (2016).
  35. Lehrer, R. I., Ganz, T. Defensins: endogenous antibiotic peptides from human leukocytes. Ciba Foundation Symposium. 171, 276-290 (1992).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

אפיון נוירופפטידיםספקטרומטריית מסותפפטידים אנדוגנייםMALDI MSכרומטוגרפיה נוזלית ומסות (Liquid Chromatography MS)כימות פפטידיםמיצוי מרקמותגילוי סמנים ביולוגייםרצף דה נובו (De Novo Sequencing)
חקירה ספקטרומטרית מסה רבת פנים של נוירופפטידים בקלינקטס ספידוס
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.