כאן, אנו מתארים שיטה מפורטת לבידוד המיטוכונדריה משריר השלד של העכבר ואת הניתוח הבא של נשימה על ידי שיעור צריכת חמצן (OCR) באמצעות בדיקות respirometric מבוססות מיקרופלט. צינור זה יכול להיות מיושם כדי לחקור את ההשפעות של התערבויות סביבתיות או גנטיות מרובות על חילוף החומרים המיטוכונדריאלי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד המיטוכונדריה משריר שלד העכבר לבדיקות ספירומטריות
במאמר זה
סיכום
תקציר
רוב האנרגיה של התא מתקבלת באמצעות השפלה של גלוקוז, חומצות שומן וחומצות אמינו על ידי מסלולים שונים המתכנסים על מערכת זרחן חמצוני מיטוכונדריאלי (OXPHOS), אשר מוסדר בתגובה לדרישות הסלולר. מולקולת השומנים קואנזים Q (CoQ) חיונית בתהליך זה על ידי העברת אלקטרונים ל- III מורכב בשרשרת הובלת האלקטרונים (ETC) באמצעות מחזורי חמצון/הפחתה קבועים. מצב המיטוכונדריה, ובסופו של דבר, בריאות התא ניתן להעריך על ידי מדידת צריכת חמצן ETC באמצעות בדיקות respirometric. מחקרים אלה מבוצעים בדרך כלל בשורות תא מבוססות או ראשוניות אשר היו בתרבית במשך מספר ימים. בשני המקרים, הפרמטרים של הנשימה שהושגו עשויים לסטות ממצבים פיזיולוגיים רגילים בכל איבר או רקמה נתון.
בנוסף, המאפיינים המהותיים של סיבים בודדים מתורבתים המבודדים משרירי השלד מעכבים סוג זה של ניתוח. מאמר זה מציג פרוטוקול מעודכן ומפורט לניתוח נשימה במיטוכונדריה מבודדת טרייה משריר השלד של העכבר. אנו מספקים גם פתרונות לבעיות פוטנציאליות שעלולות להתעורר בכל שלב של התהליך. השיטה המוצגת כאן יכולה להיות מיושמת כדי להשוות את שיעורי צריכת החמצן במודלים שונים של עכבר מהונדס וללמוד את התגובה המיטוכונדריאלית לטיפולים תרופתיים או גורמים אחרים כגון הזדקנות או מין. זוהי שיטה אפשרית להגיב לשאלות מכריעות על חילוף החומרים והרגולציה הביו-אנרגטית המיטוכונדריאלית.
מבוא
המיטוכונדריה הם האברונים המטבוליים העיקריים בתא1. אברונים מיוחדים אלה סגורים ממברנה להשתמש במולקולות מזין כדי לייצר אנרגיה בצורה של אדנוזין טריפוספט (ATP) על ידי OXPHOS. תהליך זה מסתמך על העברת אלקטרונים ממולקולות תורמות בסדרה של תגובות redox ב ETC2. CoQ הוא השומנים הפעילים היחידים המיוצרים באופן אנדוגני בכל הקרומים התאיים וליפופרוטאינים במחזור שמראה תפקוד נוגד חמצון3. זהו מרכיב חיוני של ETC, העברת אלקטרונים מ NADH תלוי קומפלקס I ו FADH2 תלוי קומפלקס II מורכב מורכב III מורכב, אם כי צמצומים רבים אחרים יכולים להניע את ההפחתה של CoQ מיטוכונדריאלי ליוביקינול כצעד חובה במסלולים מטבוליים תאיי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
איסוף דיור ורקמות של עכברים בוצעו באמצעות פרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה פבלו דה אולביד (סביליה, ספרד; פרוטוקולים 24/04/2018/056 ו-12/03/2021/033) בהתאם לצו המלכותי הספרדי 53/2013, הוראה אירופית 2010/63/EU, והנחיות רלוונטיות אחרות.
1. הכנת מניות, חוצצים, ריאגנטים לבדיקות הנשימה
- הכן את פתרונות המלאי הבאים, אשר ניתן לאחסן בטמפרטורה שצוינה במשך חודשים. השתמש ב- H2O אולטרה-פורמט בכל המקרים.
- יש להמיס טבליות מלוחות עם אגירת פוספט (PBS) ב-H2O (טבליה אחת לכל 200 מ"ל של H2O) כדי להכין 1x PBS. יש לאתחלק אוטומטית את הפתרון ולאחסן אותו בטמפרטורת החדר (RT). <....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר ניתוח in vivo של נשימה מיטוכונדריאלית באמצעות בידוד של המיטוכונדריה משריר שלד העכבר. חלוקה לרמות של השיטה מוצגת באיור 1. לאחר ניתוח שרירי השלד מההינדלימבים (איור 2), הרקמות הומוגניות והמיטוכונדריה מטוהרת, בתנאים איזוטוניים, באמצעות צנטריפוגות סדרתיות. את טוהר השברים השונים המתקבלים במהלך תהליך הבידוד ניתן לנתח על ידי כתם מערבי באמצעות נוגדנים נגד סמני אברונים שונים. איור 3A מציג את פרופיל החלבון הכ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
לכל השיטות המשמשות לחקר הנשימה המיטוכונדריאלית יש מגבלות; לפיכך, חשוב לבחור את השיטה המתאימה ביותר לשאלה ניסיונית ספציפית. עבודה זו מספקת פרוטוקול מעודכן ומפורט כדי לבודד את המיטוכונדריה משריר השלד של העכבר כדי לבצע בדיקות נשימה שונות כדי לחקור את תפקוד המיטוכונדריה. ואכן, המחקר של ביו-אנרגטיקה מיטוכונדריאלית במיטוכונדריה מבודדת באמצעות טכנולוגיות מבוססות מיקרופלט הוא בעל ערך לחקר נשימה ספציפית לרקמות במונחים של רבייה, אמינות ומורכבות. יתר על כן, השימוש במיטוכונדריה מבודדת מעניק שליטה על זמינות המצע, ומאפשר את ההבנה של ה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים לחשוף.
תודות
אנו רוצים להודות לחואן ג'יי טנה על השימוש בהומוגניזר ובמתקני הפרוטאומיקה של CABD וגידול בעלי חיים על תמיכה טכנית. עבודה זו נתמכה על ידי משרד החינוך, התרבות והספורט הספרדי באמצעות מלגה FPU16/03264 ל- J.D.H.C., האגודה Française contre les Myopathies (AFM) באמצעות מענק מלגה #22450 ל- C.V.-G., מענק מוסדי MDM-2016-0687 (יחידת המצוינות מריה דה מאזטו, המחלקה לרגולציה גנטית ומורפוגנזה ב- CABD) ו- BFU2017-83150-P ל- J.J.C. מענק החונטה דה אנדלוסיה P18-RT-4572, תוכנית המימון של FEDER מהאיחוד האירופי, ומשרד המדע, החדשנות והאוניברסיטאות הספרדי מעניקים RED2018-102576-T ל- P.N.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מלאי ADP | Sigma | A5285 | ב-20 מעלות; C |
| AKT נוגדן | איתות תאים | C67E7 | ארנב (מין מארח) |
| אנטי עיזים HRP | סיגמא | 401504 | ארנב (מין מארח) |
| אנטי-עכבר HRP | איתות תאים | #7076 | סוס (מין מארח) |
| אנטימיצין A | Sigma | A8674 | מלאי ב-20 & deg; C |
| אנטי-ארנב HRP | איתות תאי | #7074 | עז (מין מארח) |
| חומצה אסקורבית | Sigma | A5960 | מלאי |
| בנוגדני RT Bactin | Sigma | MBS4-48085 | עז (מין מארח) |
| ערכת בדיקת חלבון Bio-Rad II | Bio-Rad | 5000002 | הוא כולל 5x מגיב ברדפורד ו-BSA בריכוז ידוע עבור העקומה הסטנדרטית |
| BSA, שבר V, | קלביוכימיה | 126575 מלאי בטמפרטורה של 4 מעלות; | |
| צינור | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | מכסה סגול |
| נוגדן Calnexin | ThermoFisher | MA3-027 | עכבר (מין מארח) |
| D-mannitol | Sigma | M4125 | מלאי ב-RT |
| EDTA | BDH | 280254D | מלאי ב-4 מעלות; מלאי C |
| EGTA | Sigma | E-4378 | ב-RT |
| מלאי FCCP | Sigma | C2920 | ב-20 & deg; C |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | הומוגנייזר |
| HEPES | Sigma | H3375 | מלאי |
| ב-RT HSP70 נוגדן | Proteintech | 10995-1-AP | ארנב (מין מארח)נוגדן |
| LDH-A | Cruz Biotechnology | SC27230 | עז (מין מארח) |
| מגנזיום כלוריד | ChemCruz | sc-255260A | מלאי ב-RT |
| מלאי חומצה מאלית | Sigma | P1645 | בספקטרופוטומטר |
| RT MICROPLATE | BMG LABTECH GmbH | POLARstar OMEGA S/N 415-0292 | מלאי במערכת מים RT |
| Milli-Q | Millipore | F7HA17757A | נוגדן |
| mtTFA | במיוחד Santa Cruz ביוטכנולוגיה | SC23588 | עז עז (מין מארח) |
| Na+/K+-ATPase ואלפא; 1 נוגדן | Novus Biologicals | NB300-14755 | עכבר (מין מארח) |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | מלאי ב-20 מעלות; C |
| Palmitoyl-L-carnitine | Sigma | P1645 | מלאי ב-20 מעלות; C |
| טבליות PBS | Sigma | P4417-100TAB | מלאי 1x ב-RT |
| אשלגן דימימן פוספט | ChemCruz | sc-203211 | מלאי ב-RT |
| אשלגן הידרוקסיד | Sigma | 60377 | מלאי ב-RT |
| חומצה פירובית | Sigma | 107360 | מלאי ב-4 מעלות; מלאי |
| C Rotenone | Sigma | R8875 | ב-20 מעלות; מנתח |
| שטף מיטוכונדריאלי C Seahorse XF24 | Agilent Technologies | 420179 | דגם XFe24 |
| Seahorse XFe24 FluxPak mini | Agilent Technologies | 102342-100 | הערכה כוללת מחסניות, מיקרו-פלטות ותמיסת קליברנט |
| מלאי Succinate | Sigma | S7626 | ב-RT |
| Sucrose | Sigma | S9378 | מלאי בנוגדנים RT |
| TIMM23 | Abcam | ab230253 | ארנב (מין מארח) |
| TMPD | Sigma | T7394 | מלאי ב-20 מעלות; C |
| TOMM20 נוגדן | Abcam | ab56783 | עכבר (מין מארח) |
| נוגדן VDAC | Abcam | ab15895 | ארנב (מין מארח) |
מקורות
- Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
- Alberts, B., et al. The mitochondrion. Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , Garland Science. New York. (2002).
- Turunen, M.....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
