מאמר שיטה

השוואה בין שיטות לבידוד פטריות אנטומופתוגניות מדגימות קרקע

DOI:

10.3791/63353

⸱

6 בינואר 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Instituto de Veterinária, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, 2Laboratório de Taxonomia Bioquímica e Bioprospecção de Fungos/Coleção de Cultura de Fungos Filamentosos, Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), 3Departamento de Parasitologia Animal, Instituto de Veterinária, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מושבות פטרייתיות אנטומופתוגניות מבודדות מדגימות קרקע טרופיות באמצעות פיתיון טנבריו , פיתיון גלריה , כמו גם מדיום מלאכותי סלקטיבי, כלומר, אגר דקסטרוז תפוחי אדמה מועשר בתמצית שמרים בתוספת כלוראמפניקול, תיאבנדזול וציקלוהקסימיד (מדיום CTC).

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטרת המחקר הנוכחי היא להשוות את היעילות של שימוש בפיתיונות חרקים לעומת מדיום סלקטיבי מלאכותי לבידוד פטריות אנטומופתוגניות (EPF) מדגימות קרקע. האדמה היא בית גידול עשיר למיקרואורגניזמים, כולל EPF השייך במיוחד לסוגים Metarhizium ו - Beauveria, שיכולים לווסת מזיקים פרוקי רגליים. מוצרים ביולוגיים המבוססים על פטריות זמינים בשוק בעיקר להדברת פרוקי רגליים חקלאיים. עם זאת, למרות המגוון הביולוגי האנדמי הגבוה, רק זנים מעטים משמשים בתוצרים ביולוגיים מסחריים ברחבי העולם. במחקר הנוכחי, 524 דגימות קרקע הועתקו בתרבית על אגר דקסטרוז תפוחי אדמה מועשר בתמצית שמרים בתוספת כלורמפניקול, תיאבנדזול וציקלוהקסימיד (מדיום CTC). הצמיחה של מושבות פטריות נצפתה במשך 3 שבועות. כל Metarhizium ו - Beauveria EPF זוהו באופן מורפולוגי ברמת הסוג. בנוסף, חלק מהמבודדים זוהו מולקולרית ברמת המין. 24 מתוך 524 דגימות הקרקע הללו נסקרו גם הן לצורך התרחשות EPF בשיטת פיתיון החרקים (Galleria mellonella ו-Tenebrio molitor). בסך הכל בודדו 51 זני EPF (41 זני Metarhizium spp. ו-10 Beauveria spp.) מתוך 524 דגימות הקרקע. כל הזנים הפטרייתיים בודדו משטחי יבול או מרעה. מתוך 24 הדגימות שנבחרו להשוואה, 91.7% היו חיוביות ל-EPF באמצעות פיתיון גלריה , 62.5% השתמשו בפיתיון Tenebrio ו-41.7% השתמשו ב-CTC. התוצאות שלנו הצביעו על כך ששימוש בפיתיונות חרקים כדי לבודד את ה-EPF מהאדמה יעיל יותר משימוש במדיום CTC. להשוואת שיטות הבידוד בנוסף לזיהוי ולשימור של EPF יש השפעה חיובית על הידע על המגוון הביולוגי. השיפור של אוסף EPF תומך בפיתוח מדעי ובחדשנות טכנולוגית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אדמה היא המקור למספר מיקרואורגניזמים, כולל פטריות אנטומופתוגניות (EPF). קבוצה מסוימת זו של פטריות מוכרת על ידי יכולתן להתיישב ולעתים קרובות להרוג פונדקאים של פרוקי רגליים, במיוחד חרקים1. לאחר בידוד, אפיון, בחירת זנים ארסיים ורישום, EPF מיוצרים בייצור המוני להדברת פרוקי רגליים, התומכת ברלוונטיות הכלכלית שלהם2. לפיכך, הבידוד של EPF נחשב הצעד הראשון לפיתוח של biopesticide. Beauveria spp. (היפוקריאלס: Cordycipitaceae) ו-Metarhizium spp. (היפוקריאלס: Clavicipitaceae) הן הפטריות הנפוצות ביותר המשמשות להדברת פרוקי רגליים3. EPF בודדו בהצלחה מהאדמה, פרוקי רגליים עם מיקוזיס נראית לעין, צמחים מיושבים וריזוספירה צמחית 4,5.

בידוד של EPF יכול להיות שימושי גם כדי לחקור את המגוון, ההפצה והאקולוגיה של קבוצה מסוימת זו. ספרות עדכנית דיווחה כי השימוש ב- EPF אינו מוערך כראוי, וציטט מספר יישומים לא קונבנציונליים של EPF כגון יכולתם לשפר את צמיחת הצמח4, להסיר מזהמים רעילים מהאדמה, ולהשתמש בהם ברפואה6. המחקר הנוכחי נועד להשוות את היעילות של בידוד EPF מהאדמה באמצעות פיתיונות חרקים לעומת תווך תרבית מלאכותית 7,8,9. השימוש ב-Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Phyralidae) כפיתיון חרקים בהקשר של בידוד EPF התקבל היטב. זחלים אלה משמשים ברחבי העולם את הקהילה המדעית כמודל ניסיוני לחקר אינטראקציות בין מארח לפתוגנים10,11. זחל Tenebrio molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae) נחשב למודל חרקים נוסף למחקרים המערבים אלימות ובידוד של EPF מכיוון שחרק זה קל לנדיר במעבדה בעלות נמוכהשל 7,12.

ניתן ליישם שיטות שאינן תלויות בתרבית כגון שימוש במגוון טכניקות PCR כדי לזהות ולכמת EPF על המצעים שלהם, כולל קרקע13,14. עם זאת, כדי לבודד כראוי את המושבות הפטרייתיות הללו, יש לתרבת את המצע שלהן על מדיום מלאכותי סלקטיבי9, או שניתן יהיה לפתות את הפטריות הקיימות בדגימות באמצעות חרקים רגישים15. מצד אחד, CTC הוא מדיום מלאכותי נטול Dodine המורכב מתפוחי אדמה דקסטרוז אגר מועשר בתמצית שמרים בתוספת כלוראמפניקול, תיאבנדזול וציקלוהקסימיד. מדיום זה פותח על ידי פרננדס ואחרים. 9 כדי למקסם את ההתאוששות של Beauveria spp. ו- Metarhizium spp. ממקור טבעי מהאדמה. מצד שני, זחלי G. mellonella ו- T. molitor יכולים לשמש בהצלחה גם כפיתיונות כדי להשיג מבודדי EPF מהאדמה. עם זאת, על פי שארמה ואחרים,15, פחות מחקרים דיווחו על שימוש והשוואה מקבילים בין שני חרקי הפיתיון הללו. בקרקעות הכרמים הפורטוגזיות נמצאו שחזורים משמעותיים של Metarhizium robertsii (Metscn.) סורוקין משתמש ב-T. זחלי מוליטור בהשוואה לזחלי G. mellonella; לעומת זאת, בובריה בסיאנה (בלס. -Criv.) בידוד Vuill נקשר לשימוש בפיתיונות G. mellonella 15. לפיכך, יש לשקול את ההחלטה באיזו שיטת בידוד EPF להשתמש (כלומר, G. mellonella-fiit, T. molitor-fiit או CTC medium) בהתאם למטרת המחקר ולתשתית המעבדה. מטרת המחקר הנוכחי היא להשוות את היעילות של שימוש בפיתיונות חרקים לעומת מדיום סלקטיבי מלאכותי לבידוד EPF מדגימות קרקע.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאשר המחקר הנוכחי ניגש למורשת הגנטית הברזילאית, המחקר נרשם במערכת הלאומית לניהול מורשת גנטית וידע מסורתי משויך (Sisgen) תחת הקוד AA47CB6.

1. דגימת קרקע

  1. אספו 800 גרם אדמה (עם או בלי שורשי צמחים משניים) לעומק של 10 ס"מ באמצעות חפירה קטנה. אחסנו אותם בשקיות פוליפרופילן בטמפרטורת החדר עד לתחילת הניסוי.
    הערה: ניתן גם לאסוף שורשים קטנים מכיוון שדווח כי ל-EPF יש יכולת ריזוספרה. ככל שהעיבוד של הדגימות מהיר יותר, כך ייטב משום שהנבגים הפטרייתיים עשויים להיות פחות ברי קיימא לאורך זמן. במחקר הנוכחי נותחו דגימות לא יותר מ-7 ימים לאחר האיסוף.
  2. השתמש ב-GPS כדי לזהות את מיקומן של הדגימות שנאספו בקווי הרוחב והאורך ולסווג את השטח שנאסף לפי סוג הקרקע (לדוגמה, שטחי מרעה, יערות גשם מקומיים, חופי אגמים או שטחי יבול).

2. שיטות בידוד לפטריות אנטומופתוגניות

  1. בידוד באמצעות מדיום מלאכותי סלקטיבי CTC.
    1. כדי להכין את מדיום CTC [אגר דקסטרוז תפוחי אדמה בתוספת תמצית שמרים (PDAY) בתוספת 0.5 גרם/ליטר של כלוראמפניקול, 0.001 גרם/ל' של תיאבנדזול, ו-0.25 גרם/ליטר של ציקלוהקסימיד9], שקלו את כל הריאגנטים בנפרד, ערבבו אותם במים מזוקקים ועקרו את המדיום באוטוקלב. בארון בטיחות ביולוגית, צלחת 23 מ"ל של המדיום לתוך 60 מ"מ x 15 מ"מ לוחות פטרי.
      אזהרה: בעת שקילת ריאגנטים של CTC, השתמש במעיל מעבדה, מסכה, כפפות ומשקפי מגן מכיוון שציקלוהקסימיד וכלוראמפניקול רעילים.
    2. שקלו 0.35 ± 0.05 גרם מכל דגימת קרקע (עם או בלי שורשים) והניחו אותה במיקרו-צינורית של 1.5 מ"ל.
    3. בארון בטיחות ביולוגית, הוסיפו 1 מ"ל של תרחיף מימי סטרילי של פוליאוקסיאתילן סורביטן מונוליאט 0.01% (vol/vol) פוליאוקסיאתילן סורביטן מונואולאט למיקרו-צינור המכיל אדמה ומערבולת במשך 30 שניות.
    4. הסר 50 μL של supernatant ו pipette אותו על מרכז לוחות פטרי עם מדיום CTC. מפזרים באופן הומוגני את ההשעיות על פני השטח של המדיום באמצעות מרית דריגלשי סטרילית (בקוטר 6 מ"מ).
      הערה: יש להכין לפחות שלושה שכפולים עבור כל דגימת קרקע.
    5. דגירה של הצלחות בתאי האקלים (25 ± 1 מעלות צלזיוס, לחות יחסית ≥80%) בחושך וצפו בצמיחת המושבות הפטרייתיות לאחר 7, 14 ו -21 ימים של דגירה.
    6. שימו לב למקרומורפיולוגיה ולמיקרומורפולוגיה של המושבות הפטרייתיות המחפשות EPF. העבר את תרביות ה- EPF למדיום אגר דקסטרוז תפוחי אדמה בתוספת 0.05% כלוראמפניקול (PDAC) עד לקבלת תרביות טהורות.
      הערה: השתמש במפתחות התיאור המוצגים להלן בשלב 3 לזיהוי מושבות EPF.
  2. בידוד באמצעות פיתיונות חרקים
    1. השתמש בזחלים בעלי חיטוי פני השטח G. mellonella ו- T. molitor בשלב מאוחר. מטבלים את הזחלים לתוך 0.5% נתרן היפוכלוריט למשך דקה אחת לעיקור. לשטוף את הזחלים פעמיים באמצעות מים סטריליים.
      הערה: זחלי G. mellonella מהשלב הרביעי שימשו במחקר הנוכחי. שלבי הזחל של T. molitor לא היו סטנדרטיים.
    2. השתמשו בסירי פלסטיק כדי להרכיב את הפיתיונות. הוסיפו 250 גרם של אדמה שנאספה לכל סיר פלסטיק (רוחב 98 מ"מ x גובה 47 מ"מ x 142 מ"מ אורך). הפרד 15 זחלים מכל מין (T. molitor ו- G. mellonella) והפקיד חמישה זחלים לכל סיר פלסטיק. אחסנו את הסירים בטמפרטורה של 25 ± מעלות צלזיוס והלחות היחסית ≥-80% בחושך.
      הערה: לקדוח 10 חורים קטנים (בקוטר 2 מ"מ) במכסי הסיר כדי לאפשר אוורור. ניתן להשתמש במכשיר ברזל מחומם חד כדי לקדוח את החורים.
    3. הומוגניזציה של הקרקע כל יומיים כדי לאפשר מגע מקסימלי של זחלים עם אדמה.
      הערה: לחות חשובה לתמיכה בזיהום הפטרייתי של הזחלים. כדי לשמור על הלחות בקרקע, יש לרסס מים מזוקקים סטריליים על פני הקרקע בעת הצורך. אין להשרות את דגימת הקרקע במים.
    4. לנתח את הסירים מדי יום בחיפוש אחר חרקים מתים.
      הערה: שימו לב לזחלים הנותרים במושבה מדי יום אחר סימנים פתולוגיים של חסרי חוליות כדי לוודא שהחרקים אינם נגועים. כחלופה, ניתן לכלול במחקר סירי הדברה עם אדמה סטרילית כדי לבדוק את מצבם הבריאותי של זחלי החרקים.
    5. מסירים חרקים מתים ומעקרים אותם באופן שטחי עם 0.5% נתרן היפוכלוריט למשך דקה אחת. ממקמים את החרקים הסטריליים בתא לח (לחות יחסית ≥ 80%) בטמפרטורה של 25 ±-1 מעלות צלזיוס למשך 7 ימים כדי להעדיף את ההחצנה של פטריות אנטומופתוגניות (מיקוזיס).
    6. עם המיקוזיס, לקצור את הקונידיה מפני השטח של החרקים. השתמש בלולאה מיקרוביולוגית כדי למקם את הקונידיה על מדיום PDAC תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי. כחלופה, הניחו את כל הזחלים הנגועים על מדיום ה-PDAC. דגירה של לוחות התרבית בתא אקלים בטמפרטורה של 25 ± 1 מעלות צלזיוס ולחות יחסית ≥ 80%.
    7. שימו לב למקרומורפיולוגיה ולמיקרומורפולוגיה של המושבות הפטרייתיות על הלוחות כדי לאשר את זהותו של EPF. חזור על התרבות ב- PDAC עד לקבלת מושבות פטרייתיות טהורות.
      הערה: השתמש במפתחות התיאור המוצגים להלן בשלב 3 לזיהוי מושבות EPF.

3. זיהוי EPF (Metarhizium spp. ו - Beauveria spp.)

  1. נתחו את המאפיינים המקרומורפיולוגיים של התרבויות הפטרייתיות על הלוחות (כלומר, פני השטח וההיפוך של המושבות, צורתן, קצהן, קצב הגדילה שלהן, צבען, מרקמן, פיגמנט מתפזר, אקסודטים וקונידיה אווירית) לאחר 14 יום בטמפרטורה של 25 ± 1 מעלות צלזיוס ולחות יחסית ≥ 80%.
  2. העבר את הקונידיה האווירית לתרביות החלקה (טכניקת מיקרו-תרבות)16 למשך 3 ימים בטמפרטורה של 25 ± 1 מעלות צלזיוס ולחות יחסית ≥ 80% וכתם בכחול לקטופנול כדי לצפות בתכונות המיקרוסקופיות (כלומר, סידור של קונידיה, קונידיופורים, צורה וגודל של קונידיה)17,18,19,20.
  3. צפו במבנים הפטרייתיים המיקרוסקופיים פי 400 באמצעות מיקרוסקופ אופטי כדי לאשר את זיהוי ה-EPF.
    הערה: מפתחות מורפולוגיים עבור EPF מתוארים בדוחות על ידי Bischoff et al., Rehner et al., Seifert et al., ו- Humber 17,18,19,20. המאקרו והמיקרומורפולוגיה של מושבות פטריות הם הקריטריונים השכיחים ביותר המשמשים לזיהוי פטריות נימה ברמת הסוג. בהתאם לסוג של EPF, מאפיינים מורפולוגיים אלה ישתנו. Humber20 מציג מפתח זיהוי לסוגים עיקריים של אנטומופתוגנים פטרייתיים. מושבות Metarhizium spp. לדוגמה, הן בדרך כלל עגולות, אבקתיות, מציגות גוונים משתנים של ירוק, ויכולות להציג הפרשה. באופן מיקרוסקופי, למושבות אלה יש תאים חרוטיים אפיים על קונידיופורים מסועפים בצפיפות, השזורים זה בזה בצפיפות ויוצרים קרום הבתולים הקומפקטי, וקונידיה גלילית עד אליפסואידית בשרשראות מקבילות היוצרות עמודים או מסות דמויות צלחת. מושבות Beauveria spp. הן בדרך כלל לבנות, אבקתיות או דמויות כותנה. הם מציגים תאים חרוטיים עם חלק בסיסי מורחב המשתרע באופן אפיפי בכיוון זיגזג. Beauveria conidiophores יוצרים אשכולות צפופים של קונידיה בצורת גלובוס. יש צורך בניתוחים מולקולריים לזיהוי EPF ברמת המין.
  4. בצע ניתוחים מולקולריים על המבודדים לזיהוי טקסונומי ברמת המין. עבור זני ה-EPF שבודדו במחקר זה, כלומר, Metarhizium spp. ו-Beauveria spp., מבצעים ניתוחים מולקולריים המבוססים על הדיווחים של Bischoff et al.17 ו-Rehner et al.18.
  5. לאחר אישור המבודדים להיות EPF, להפקיד את מבודדים באוסף של תרבויות פטרייתיות. במחקר הנוכחי, המבודדים הופקדו באוסף תרביות פטרייתיות אנטומופתוגניות מהמעבדה לבקרה מיקרוביאלית (LCM) באוניברסיטה הכפרית הפדרלית של ריו דה ז'ניירו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בסך הכל נאספו 524 דגימות קרקע משטחי מרעה: מרעה של בעלי חיים (165 דגימות), יער טרופי מקומי (90 דגימות), שפת האגם (42 דגימות) ושטחי יבול מעובדים/מעובדים (227 דגימות) בין 2015 ל-2018 במדינת ריו דה ז'ניירו, ברזיל. פרטים על קואורדינטות גיאוגרפיות של דגימות חיוביות ל-EPF מובאים בטבלה משלימה 1.

מתוך 524 דגימות הקרקע, 500 דגימות נותחו רק באמצעות מדיום CTC, ו-24 דגימות נותחו במקביל באמצעות שלוש צורות של בידוד (Galleria-fiit, Tenebrio-fiit, ומדיום תרבית CTC הסלקטיבי), ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בתי גידול טבעיים וחקלאיים בקרקע הם סביבות אופייניות ל-EPF22 ומאגר טבעי מצוין. במחקר הנוכחי טופלו שתי שיטות לבידוד EPF באמצעות פיתיונות חרקים לעומת מדיום סלקטיבי. הצעד הראשון לבידוד הוא איסוף דגימות הקרקע. אחסון וזיהוי נכונים של דגימות קרקע הם חיוניים. מידע על קו הרוחב, קו האורך, סוג הקרקע והביום חיוני למחקרים הכוללים נושאים אפידמיולוגיים, מידול וגיאו-מרחביים23,24. לאחר האיסוף, מומלץ שהדגימות יעובדו בהקדם האפשרי (רצוי תוך 7 ימים) מכיוון שהכ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מומן בחלקו על ידי Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) מברזיל, קוד מימון 001, Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (מספר פרויקט E-26/010.001993/2015), ו- Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) מברזיל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אוטוקלאבפיניקס לופרקו9451
ארון בטיחות ביולוגיתAirstream ESCOAC2-4E3
כלורמפניקולסיגמא-אולדריץ'C0378
תאי אקליםEletrolabEL212/3
CoverslipRBR3871
CycloheximideSigma-AldrichC7698
מרית דריגלסקימרינפלד1800024
אפליקציית GPSאפליקציית מיקום גיאוגרפי2.1.2005
תמיסה כחולה לקטופנולסיגמא-אולדריץ'61335
מיקרוסקופZeiss Axio star plus1169 149
מצלמת מיקרוסקופZeiss Axiocam 105 צבע426555-0000-000
מיקרוסקופ softwereZen lite Zeiss 3.0
מיקרוסקופ שקופיתOlenk5-7105-1
MicrotubeBRANDZ336769-1PAK
צלחות פטריKasviK30-6015
קצה פיפטהVattenVT-230-200C / VT-230-1000C
פיפטהHTL - LabmateproLMP 200 / LMP 1000
סירי פלסטיקPrafesta descartá veis8314
שקיות פוליפרופילןExtrusa38034273/5561
אגר דקסטרוז תפוחי אדמהKasviK25-1022
תוכנת פריזמה 9.1.2Graph Pad
ShovelTramontina77907009
Tenebrio mollitorSafariQP98DLZ36
ThiabendazoleSigma-AldrichT8904
Tween 80Vetec60REAVET003662
VortexBiomixerQL-901
תמצית שמריםKasviK25-1702

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Roberts, D. W., St. Leger, R. J. Metarhizium spp., cosmopolitan insect-pathogenic fungi: Mycological aspects. Advances in Applied Microbiology. 54, 1-70 (2004).
  2. do Nascimento Silva, J., et al. New cost-effective bioconversion process of palm kernel cake into bioinsecticides based on Beauveria bassiana and Isaria javanica. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (6), 2595-2606 (2018).
  3. Faria, M. R., Wraight, S. P. Mycoinsecticides and Mycoacaricides: A comprehensive list with worldwide coverage and international classification of formulation types. Biological Control. 43 (3), 237-256 (2007).
  4. Vega, F. V. The use of fungal entomopathogens as endophytes in biological control: a review. Applied Mycology. 110 (1), 4-30 (2018).
  5. Sharma, L., et al. Advances in entomopathogen isolation: A case of bacteria and fungi. Microorganisms. 9 (1), 1-28 (2021).
  6. Litwin, A., Nowak, M., Różalska, S. Entomopathogenic fungi: unconventional applications. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 19, 23-42 (2020).
  7. Kim, J. C., et al. Tenebrio molitor-mediated entomopathogenic fungal library construction for pest management. Journal of Asia-Pacific Entomology. 21 (1), 196-204 (2018).
  8. Meyling, N., Eilenberg, J. Ocurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, Ecosystems and Environment. 113 (1), 336-341 (2006).
  9. Fernandes, E. K. K., Keyser, C. A., Rangel, D. E. N., Foster, R. N., Roberts, D. W. CTC medium: A novel dodine-free selective medium for isolating entomopathogenic fungi, especially Metarhizium acridum, from soil. Biological Control. 54 (3), 197-205 (2010).
  10. Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Molecular genetics of Beuveria bassiana infection of insects. Advantages in Genetics. 94, 165-249 (2016).
  11. Pereira, M. F., Rossi, C. C., Silva, G. C., Rosa, J. N., Bazzolli, M. S. Galleria mellonella as infection model: an in depth look at why it works and practical considerations for successful application. Pathogens and Disease. 78 (8), (2020).
  12. Souza, P. C., et al. Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae) as an alternative host to study fungal infections. Journal of Microbiological Methods. 118, 182-186 (2015).
  13. Canfora, L., et al. Development of a method for detection and quantification of B. brongniartii and B. bassiana in soil. Scientific Reports. 6, 22933(2016).
  14. Garrido-Jurado, I., et al. Transient endophytic colonization of melon plants by entomopathogenic fungi after foliar application for the control of Bemisia tabaci Gennadius (Hemiptera: Aleyrodidae). Journal of Pest Science. 90, 319-330 (2016).
  15. Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: suggesting a 'Galleria-Tenebrio-bait method' as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana). MycoKeys. 38, 1-23 (2018).
  16. Riddell, R. W. Permanent stained mycological preparations obtained by slide culture. Mycologia. 42 (2), 265-270 (1950).
  17. Bischoff, J., Rehner, S. A., Humber, R. A. A multilocus phylogeny of the Metarhizium anisopliae lineage. Mycologia. 101 (4), 512-530 (2009).
  18. Rehner, S. A., et al. Phylogeny and systematics of the anamorphic, entomopathogenic genus Beauveria. Mycologia. 103 (5), 1055-1073 (2011).
  19. Seifert, K. A., Gams, W. Anamorphs of Clavicipitaceae, Cordycipitaceae and Ophiocordycipitaceae. The Genera of Hyphomycetes. CBS Biodiversity Series. CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre. Seifert, K. A., Morgan-Jones, G., Gams, W., Kendrick, B. 9, 903-906 (2011).
  20. Humber, R. A. Identification of entomopathogenic fungi. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology., 2nd ed. Lacey, L. A. , Academic Press. Washington. 151-187 (2012).
  21. Mesquita, E., et al. Efficacy of a native isolate of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae against larval tick outbreaks under semifield conditions. BioControl. 65 (3), 353-362 (2020).
  22. St Leger, R. J. Studies on adaptations of Metarhizium anisopliae to life in the soil. Journal of Invertebrate Pathology. 98 (3), 271-276 (2008).
  23. Mar, T. T., Suwannarach, N., Lumyong, S. Isolation of entomopathogenic fungi from Nortern Thailand and their production in cereal grains. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28 (12), 3281-3291 (2012).
  24. Rocha, L. F. N., Inglis, P. W., Humber, R. A., Kipnis, A., Luz, C. Occurrence of Metarhizium spp. in central Brazilian soils. Journal of Basic Microbiology. 53 (3), 251-259 (2013).
  25. Quesada-Moraga, E., Navas-Cortés, J. A., Maranhao, E. A. A., Ortiz-Urquiza, A., Santiago-Álvarez, C. Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils. Mycological Research. 111 (8), 947-966 (2007).
  26. Mora, M. A. E., Rouws, J. R. C., Fraga, M. E. Occurrence of entomopathogenic fungi in atlantic forest soils. Microbiology Discovery. 4 (1), 1-7 (2016).
  27. Goble, T. A., Dames, J. F., Hill, M. P., Moore, S. D.The effects of farming system, habitat type and bait type on the isolation of entomopathogenic fungi from citrus soils in the Eastern Cape Province, South Africa. BioControl. 55 (3), 399-412 (2010).
  28. Medo, J., Cagáň, L. Factors affecting the occurrence of entomopathogenic fungi in soils of Slovakia as revealed using two methods. Biological Control. 59 (2), 200-208 (2011).
  29. Chase, A. R., Osborne, L. S., Ferguson, V. M. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. 69, 285-292 (1986).
  30. Liu, Z. Y., Milner, R. J., McRae, C. F., Lutton, G. G. The use of dodine in selective media for the isolation of Metarhizium spp. from soil. Journal of Invertebrate Pathology. 62, 248-251 (1993).
  31. Rangel, D. E. N., Dettenmaier, S. J., Fernandes, E. K. K., Roberts, D. W. Susceptibility of Metarhizium spp. and other entomopathogenic fungi to dodine-based selective media. Biocontrol Science and Technology. 20 (4), 375-389 (2010).
  32. Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae. BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).
  33. Enkerli, J., Widmer, F., Keller, S. Long-term field persistence of Beauveria brongniartii strains applied as biocontrol agents against European cockchafer larvae in Switzerland. Biological Control. 29 (1), 115-123 (2004).
  34. Imoulan, A., Alaoui, A., El Meziane, A. Natural occurrence of soil-borne entomopathogenic fungi in the Moroccan endemic forest of Argania spinosa and their pathogenicity to Ceratitis capitata. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (11), 2619-2628 (2011).
  35. Keyser, C. A., De Fine Licht, H. H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark. BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MetarhiziumBeauveriaCTC

מאמרים קשורים