הפרוטוקול הנוכחי מתאר את ההזרקה התוך-חדרית (ICV) של דגי זברה בוגרים עם נוירוטוקסי-הידרוקסידופאמין (6-OHDA) בדיאנספלון הגחוני (Dn) ואת הערכת הליקוי וההתאוששות שלאחר מכן של פוסטלציה של התנהגות שחייה באמצעות מבחן הטנק הפתוח, המלווה בניתוח באמצעות תוכנת מעקב וידאו.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הערכת לוקומוטור של מודל מחלת פרקינסון למבוגרים המושרה על ידי 6-הידרוקסידופמין
במאמר זה
סיכום
תקציר
המגבלות של הטיפולים הנוכחיים בעיכוב אובדן עצבי דופאמין במחלת פרקינסון (PD) להעלות את הצורך טיפולים חלופיים שיכולים לשחזר נוירונים אלה. מאמץ רב מופנה כיום להבנה טובה יותר של ניוון עצבי באמצעות מודלים פרה-קליניים ב- vivo . עם זאת, יכולת רגנרטיבית זו לתיקון עצמי אינה יעילה ביונקים. בעלי חיים שאינם יונקים כמו דגי זברה התגלו כך כמודל נוירו-גנרטיבי מצוין בשל יכולתו לחדש את עצמם ללא הרף ויש להם הומולוגיית מוח קרובה לבני אדם. כחלק מהמאמץ להבהיר אירועים תאיים המעורבים בארגון עצבי ב- vivo, הקמנו את מודל PD למבוגרים המבוסס על דגי זברה למבוגרים המושרה על ידי 6-HYDROXYDopamine (6-OHDA). זה הושג באמצעות אופטימיזציה תוך שרירית (ICV) microinjection של 99.96 mM 6-OHDA כדי במיוחד ablate נוירונים דופאמין (DpN) ב diencephalon הגחוני (Dn) של המוח דגי זברה. Immunofluorescence הצביע על יותר מ 85% של אבלציה DpN ביום השלישי postlesion ושיקום מלא של DpN באתר lesioned 30 ימים postlesionion. המחקר הנוכחי קבע את הליקוי ואת ההתאוששות שלאחר מכן של התנהגות שחייה של דגי זברה בעקבות נגע באמצעות מבחן השדה הפתוח שדרכו כימתו שני פרמטרים, מרחק נסע (ס"מ) ומהירות ממוצעת (ס"מ /s), היו מכמתים. התנועה הוערכה על ידי ניתוח ההקלטות של דגים בודדים של כל קבוצה (n = 6) באמצעות תוכנת מעקב וידאו. הממצאים הראו ירידה משמעותית (p < 0.0001) במהירות (ס"מ/ים) ובמרחק נסע (ס"מ) של דגי זברה נגועים 3 ימים postlesion בהשוואה לזיוף. דגי הזברה הנגעים הפגינו התאוששות מלאה של התנהגות השחייה 30 יום לאחר מכן. הממצאים הנוכחיים מראים כי 6-OHDA נגע זברה בוגר הוא מודל מצוין עם איכות רבייה כדי להקל על המחקר של neuroregeneration ב PD. מחקרים עתידיים על המנגנונים שבבסיס neuroregeneration, כמו גם גורמים פנימיים וחיצוניים לווסת את התהליך עשוי לספק תובנה חשובה לתוך אסטרטגיות טיפול החלפת תאים חדשים נגד PD.
מבוא
מחלת פרקינסון (PD), מחלה המאופיינת באופן ייחודי על ידי קשיחות שרירים, רעד במנוחה וברדיקינזיה, היא המחלה הנוירולוגית הגדלה במהירות הגבוהה ביותר בעולם1,2. הסיכון והשכיחות של PD להגדיל במהירות עם הגיל במיוחד אצל אנשים בגילאי 50 ומעלה. האטיולוגיה והפתוגנזה של PD עד כה נשארים מובנים בצורה גרועה. זה לעתים קרובות השאיר את ההתחלה המוקדמת של PD לא מאובחנת. נכון לעכשיו, חוסר דופמין ואובדן נוירונים דופאמין (DpN) בחולי PD קשורים מאוד לביטוי של סימפטומים מוטוריים4. ניצול מערכת יחסים זו, מספר טיפולים תוכננו או לפעול ישירות כתחליף דופמין (כלומר, levodopa) או כדי לפצות על אובדן ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
המחקר הנוכחי אושר על ידי הוועדה לחקר בעלי חיים ואתיקה (CARE), האוניברסיטה טכנולוגית MARA (UiTM) [התייחסות לא: UiTM CARE 346/2021, מיום 7 במאי 2021].
הערה: הפרוטוקולים שפורסמו2,25,26 עבור גידול ותחזוקה סטנדרטיים של מודל PD דג זברה למבוגרים 6-OHDA נגע נוצלו. הניסויים נערכו עם דגי זברה זכריים בוגרים (דניו ריו) בני יותר מחמישה חודשים עם אורך סטנדרטי של 3.2-3.7 ס"מ.
1. תחזוקת דגי זברה ותכשירי מיקרו-ICV לפני ה-ICV
- לשמור על הדגים במיכל מים מאוורר תחת טמפרטורה מבוקרת של 28 ± 1.0 °C (50 °F). ל....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הניסוי הנוכחי העריך את השינויים בהתנהגות השחייה של דגי זברה למבוגרים בעקבות מיקרו-ICV עם 6-OHDA. הסיבה לשימוש 6-OHDA כמו neurotoxin של בחירה נבע חוסר היכולת שלה לחצות את מחסום הדם - מוח, אשר הפיק אבלציה ספציפית וממוקדת של DpN בתחום של דיאנספלון עניין-גחון (Dn)16. אוכלוסיית המשנה של DpN כאן מחזיקה דמיון אנטומי לתת-אוכלוסיית ה-DpN בסובסטנציה של האדם nigra pars compacta31.
לפי העבודה הקודמת שלנו22, ההשפעה התאית של 6-OHDA ICV .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
העבודה הנוכחית הדגימה בהצלחה את הערכת הלוקומוטור של מודל ה-PD המבוסס על דגי זברה למבוגרים בגודל 6-OHDA. הניסוי כולו כלל שלושה שלבים עיקריים: תכשירי מיקרו-ג'ינג'ים טרום-ICV, מיקרו-ICV של דגי זברה והערכה של לוקומוטור. כדי להבטיח התאוששות בריאה של דגי זברה בוגרים בעקבות הליך microinjection ICV ותוצאה ניסיונית טובה, כמה שיטות טובות עבור כל צעד הומלצו במחקר הנוכחי.
הכנה מיקרו-ICV טרום ICV: בחירת בעלי חיים בוצעה בצורה הטובה ביותר יום לפני הניסוי. המין זוהה ואורך הדג נמדד. דגי זברה בוגרים זכרים באורך.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין ניגודי עניינים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי המשרד להשכלה גבוהה מלזיה במסגרת תוכנית מענק המחקר הבסיסי [600-IRMI/FRGS 5/3 (033/2019)].
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>חומרים | |||
| 6-הידרוקסידופמין (6-OHDA) | סיגמא-אולדריץ', מיזורי, ארה"ב | 162957 | |
| חומצה אסקורבית | תרמו פישר סיינטיפיק, קליפורניה, ארה"ב | FKC#A/8882/53 | |
| פיפטה פסטר חד פעמית, 3 מ"ל | תרמו פישר סיינטיפיק, קליפורניה, ארה"ב | FB55348 | |
| צינור מיקרוצנטריפוגה, 0.2 מ"ל | Eppendorf, המבורג, גרמניה | 30124332 | |
| בקבוק חרוטי נחמד, 100 מ"ל | Evergreen Engineering & משאבים, סמניה, מלזיה | SumYau0200 | |
| תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) | סיגמא-אולדריץ', מיזורי, ארה"ב | P4417 | |
| נתרן ביקרבונט | סיגמא-אולדריץ', מיזורי, ארה"ב | S5761 | |
| נתרן כלורי | Merck, דרמשטדט, גרמניה | 106404 | |
| סטריאומיקרוסקופ | ניקון, טוקיו, יפן | SMZ745 | |
| טריקאין מתאן-סולפונאט (MS-222) | סיגמא-אולדריץ', מיזורי, ארה"ב | E10521 | |
| <חזק>ציוד | |||
| ANY-maze תוכנה | Stoelting Co., אילינוי, ארה | "ב-גרסה | 7.0; תוכנת מעקב וידאו |
| Cubis II Micro Lab Balance | Sartorius, Gö ttingen, גרמניה | SE 2 | |
| מיקרו-מזרק FemtoJet IV | Eppendorf, המבורג, גרמניה | 5192000035 | |
| Femtotip II, נימי הזרקה סטרילית | Eppendorf, המבורג, גרמניה | 5242957000 | |
| InjectMan 4 מיקרומניפולטור | Eppendorf, המבורג, גרמניה | 5192000027 | |
| מנורת LED ניידת | MR. DIY, Selangor, מלזיה | 9023251 | 20 מיליאמפר / שעה |
| PELCO Pro Superalloy, קיזוז, טיפים עדינים | טד פלה, קליפורניה, ארה"ב | 5367-12NM | |
| מחמם אקווריום שנדה | אקווריום יק פונג, סלנגור, מלזיה | SDH-228 | |
| מדחום | Sera Precision, היינסברג, גרמניה | 52525 | |
| מצלמת וידאו | ניקון, טוקיו, יפן | D3100 |
מקורות
- Dorsey, E. R., et al. regional, and national burden of Parkinson's disease, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurology. 17 (11), 939-953 (2018).
- Maserejian, N., Vinikoor-Imler, L., Dilley, L.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
