הקלטת זרם צומת גאפ מביציות קסנופוס

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול לביטוי חלבוני צומת פערים בביציות קסנופוס ורישום זרם צומתי בין שתי ביציות באמצעות מגבר מסחרי המיועד לרישומי מהדק מתח ביציות כפול במצב מדידת זרם צד גבוה.

תקציר

ביטוי הטרולוגי של קונקסינים ופונקסינים בביציות קסנופוס הוא גישה רבת עוצמה לחקר התכונות הביופיזיות של צמתי פער (GJs). עם זאת, גישה זו מאתגרת מבחינה טכנית מכיוון שהיא דורשת מהדק מתח דיפרנציאלי של שתי ביציות מנוגדות החולקות מכנה משותף. למרות שמספר קטן של מעבדות הצליחו לבצע טכניקה זו, למעשה כולן השתמשו במגברים תוצרת בית או במגברים מסחריים שנועדו להקלטות של ביצית בודדת. לעתים קרובות זה מאתגר עבור מעבדות אחרות ליישם טכניקה זו. למרות שמצב מדידת זרם צד גבוה שולב במגבר מסחרי להקלטות של מהדקי מתח ביציות כפולים, לא היה שום דיווח על יישומו עד למחקר האחרון שלנו. הפכנו את גישת מדידת הזרם הגבוה למעשית ונוחה יותר על ידי הכנסת מספר שינויים טכניים, כולל בניית פלטפורמת הקלטה מבוססת מגנטית המאפשרת מיקום מדויק של ביציות ואלקטרודות שונות, שימוש בתמיסת האמבטיה כמוליכה באלקטרודות דיפרנציאליות מתח, אימוץ אלקטרודת KCl מסחרית עם דליפה נמוכה כאלקטרודת הייחוס, ייצור אלקטרודות זרם ומתח מנימי זכוכית בעלי דופן דקה, ומיקום של כל האלקטרודות באמצעות מכשירים מבוססי מגנטים. השיטה המתוארת כאן מאפשרת הקלטות נוחות וחזקות של זרם צומתי (I_j) בין שתי ביציות קסנופוס מנוגדות.

מבוא

GJs הם תעלות בין-תאיות שעשויות לאפשר זרימה והחלפה של זרם של מולקולות ציטוזוליות קטנות בין תאים שכנים. הם קיימים בסוגי תאים רבים ומבצעים תפקודים פיזיולוגיים מגוונים. GJs אצל בעלי חוליות נוצרים על ידי connexins, ואילו אלה של חסרי חוליות על ידי innexins. כל GJ מורכב משני המיכנלים עם 6 או 8 תת-יחידות לכל המיקנל, תלוי אם הם קונקסינים או innexins ^1,2,3. לבני אדם יש 21 גנים של קונקסין⁴, בעוד שלדגמים הנפוצים של חסרי חוליות C. elegans ו- Drosophila melanogaster יש 25 ו-8 גנים של innexin, בהתאמה ^5,6. שחבור חלופי של תעתיקי גנים עשוי להגדיל עוד יותר את המגוון של חלבוני GJ, לפחות עבור innexins ^7,8.

ניתן לחלק את ה-GJs לשלוש קטגוריות המבוססות על הרכבים מולקולריים: הומוטיפיים, הטרוטיפיים והטרומריים. ל-GJ הומוטיפי כל תת-היחידות שלו זהות. ל-GJ הטרוטיפי יש שני המיכנלים הומומריים, אך שני ההמיכנלים נוצרים על ידי שני חלבוני GJ שונים. GJ הטרומרי מכיל לפחות ההמיכנל ההטרומרי אחד. הגיוון המולקולרי של GJs עשוי להעניק תכונות ביופיזיות מובהקות החשובות לתפקודים הפיזיולוגיים שלהם. תכונות ביופיזיות של GJ מווסתות גם על ידי חלבונים רגולטוריים⁹. כדי להבין כיצד GJs מבצעים את התפקודים הפיזיולוגיים שלהם, חשוב לדעת את ההרכבים המולקולריים שלהם, את התכונות הביופיזיות שלהם ואת התפקידים של חלבונים רגולטוריים בתפקודים שלהם.

מערכות ביטוי הטרולוגיות משמשות לעתים קרובות לחקר תכונות ביופיזיות של תעלות יונים, כולל GJs, ואת ההשפעות של חלבונים רגולטוריים עליהם. מאחר שמערכות ביטוי הטרולוגיות מאפשרות ביטוי של חלבונים ספציפיים, הן בדרך כלל נוחות יותר לניתוח פונקציות חלבונים מאשר רקמות מקומיות שבהן חלבונים עם פונקציות יתירות יכולות לסבך את הניתוח, ורישום של I_j יכול להיות בלתי ניתן להשגה. למרבה הצער, קווי התאים הנפוצים ביותר למעט התא Neuro-2A אינם מתאימים לחקר תכונות ביופיזיות של GJ עקב סיבוכים של קונקסינים אנדוגניים. אפילו תאי Neuro-2A לא תמיד מתאימים לניתוח מסוג זה. לדוגמה, לא הצלחנו לזהות כל I_j בתאי Neuro-2A שעברו טרנספקציה עם innexins UNC-7 ו- UNC-9 בהיעדר או בנוכחות של UNC-1 (לא פורסם), הנדרש לתפקוד של UNC-9 GJs ב- C. elegans ^9,10. מצד שני, ביציות קסנופוס הן מערכת חלופית שימושית לניתוחים אלקטרופיזיולוגיים של GJs. למרות שהם מבטאים חלבון GJ אנדוגני, connexin 38 (Cx38)¹¹, סיבוכים פוטנציאליים ניתן להימנע בקלות על ידי הזרקת אנטיסנס ספציפי oligonucleotide¹². עם זאת, ניתוחים של GJs עם ביציות קסנופוס דורשים מהדק מתח דיפרנציאלי של שני תאים מעוותים, וזה מאתגר מבחינה טכנית. ההצלחות המוקדמות ביותר של מהדק מתח כפול של בלסטומרים של צפרדעים דווחו לפני כ-40 שנה^{לפני כ-13,14} שנה. מאז, מחקרים רבים השתמשו בטכניקה זו כדי לתעד את I_j בביציות קסנופוס מזווגות. עם זאת, למעשה כל המחקרים הקודמים בוצעו עם מגברים תוצרת בית^12,15,16 או מגברים מסחריים המיועדים להקלטות על ביציות בודדות (GeneClamp 500, AxoClamp 2A, או AxoClamp 2B, Axon Instruments, Union City, CA)^{8,17,18,19,20} . מכיוון שאפילו המגברים המסחריים אינם מספקים הוראות למהדק מתח ביציות כפול, לעתים קרובות זה מאתגר עבור מעבדות אלקטרופיזיולוגיות חדשות או פחות מתוחכמות ליישם טכניקה זו.

רק מגבר מסחרי אחד פותח עבור מהדק מתח ביציות כפול, ה-OC-725C ממכשירי וורנר (טבלת חומרים, איור 1A). ניתן להשתמש במגבר זה במצב סטנדרטי (עבור ביציות בודדות) או במצב מדידת זרם צד גבוה (עבור ביציות בודדות או כפולות), תלוי אם שני שקעים בבדיקת המתח שלו מחוברים (איור 1B, C). עם זאת, עד למחקר האחרון שלנו⁷, לא היה פרסום אחד המתאר את השימוש במגבר זה במצב מדידת הזרם הצדדי הגבוה שלו. למרות שהמגבר שימש מעבדה אחרת להקלטות של שתי ביציות, הוא שימש בתקן ולא במצב הצד הגבוה^21,22. היעדר דיווחים זה באמצעות המגבר במצב מדידת הזרם הצדדי הגבוה שלו עשוי לנבוע מקשיים טכניים. לא הצלחנו להשיג הקלטות יציבות של שתי ביציות באמצעות מצב הצד הגבוה על ידי ביצוע הוראות היצרן. במהלך השנים, ניסינו שלוש גישות שונות לרישומי ביציות כפולות, כולל שימוש בשני מגברי OC-725C במצב מדידת זרם צד גבוה, שני מגברי OC-725C במצב סטנדרטי ושני מגברים מיצרן אחר. בסופו של דבר הצלחנו להשיג הקלטות יציבות רק בגישה הראשונה לאחר ניסוי וטעייה נרחבים. פרסום זה מתאר ומדגים את ההליכים בהם אנו משתמשים כדי לבטא חלבוני GJ בביציות קסנופוס, לרשום I_j באמצעות מצב מדידת הזרם הגבוה, ולנתח את הנתונים האלקטרופיזיולוגיים באמצעות תוכנה מסחרית פופולרית. מידע נוסף על טכניקת הידוק המתח הכפול ניתן למצוא בפרסומים אחרים^19,23.

פרוטוקול

הניתוחים מבוצעים בעקבות פרוטוקול שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת קונטיקט.

1. ניתוח צפרדע והכנת ביציות מפורקות

1. להרדים נקבה בוגרת של צפרדע אפריקאית בעלת טפרים (Xenopus laevis) (טבלת חומרים) על ידי טבילה בתמיסת טריקאין קרירה (עם קרח) (כ-300 מ"ג/ל').
2. המתן (כ-15 דקות) עד שהצפרדע תציג תגובה מועטה, אם בכלל, ללחיצה על רגליה ברשת. הניחו את הצפרדע על שולחן ניתוחים כשבטנה פונה כלפי מעלה.
3. לאחר חתך אורכי (באורך 8-10 מ"מ) באזור הבטן התחתונה השמאלית או הימנית, שלפו בעדינות חתיכה קטנה של רקמת שחלה עם זוג מלקחיים, וחתכו את רקמת השחלה עם זוג מספריים קטנים.
4. לטבול מיד את רקמת השחלה החופשית בתמיסת Ca²⁺ ללא תמיסת ND96 (NaCl 99 mM, KCl 2 mM, MgCl₂ 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7.5) בתוך צלחת פטרי 60 מ"מ.
5. לאחר סגירת החתך על ידי תפרים מופרעים פשוטים באמצעות תפר משי 5-0 (טבלת חומרים), החזירו את הצפרדע למיכל מים רדודים להתאוששות.
   הערה: החתך סגור בשני שלבים: תחילה שכבות הצפק והשרירים, ולאחר מכן שכבת העור. כל צפרדע עוברת 5 ניתוחים במרווח של 4 שבועות לפחות בין שני ניתוחים רצופים.
6. העבר את רקמת השחלה המבודדת לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל של תמיסת Ca²⁺ ללא ND96 עם 20 מ"ג קולגן (טבלת חומרים) ו-20 מ"ג היאלורונידאז (טבלת חומרים).
7. יש לנער את הצינור על שייקר מסלולי בטמפרטורת החדר (RT) עד שכל הביציות יהפכו מבודדות (בודדות).
8. לאחר מכן, העבירו 30-50 ביציות לצלחת פטרי באמצעות פיפטה של פסטר זכוכית ובחנו את הביציות לעתים קרובות תחת סטריאומיקרוסקופ (כוח ההגדלה הגבוה ביותר ≥ פי 25) כדי לקבוע אם הן מנופחות.
   הערה: יש "לחתוך" את פיפטת הפסטר לפתח קצה רחב יותר באמצעות כותב יהלומים (טבלת חומרים) ולהבעיר אותה כדי להחליק את קצה החיתוך.
9. ברגע ש-70%-80% מהביציות מתפרקות, יש לנטרל את תמיסת האנזים על ידי הטיה עדינה של הצינור. לשטוף את הביציות 5 פעמים על ידי מילוי הצינור בתמיסת ND96 (NaCl 96 mM, KCl 2 mM, CaCl₂ 1.8 mM, MgCl₂ 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7.5) וטיהור התמיסה.
10. לאחר הכביסה הסופית, העבירו את הביציות לצלחת פטרי 60 מ"מ המכילה תמיסת ND96. בחרו והעבירו ביציות גדולות ובריאות למראה לצלחת פטרי 60 מ"מ המכילה תמיסת ND96 בתוספת נתרן פירובט (2 מ"מ) ופניצילין-סטרפטומיצין (100 U/mL) באמצעות פיפטת פסטר מזכוכית נקייה.
    הערה: "ביציות גדולות ובריאות למראה" הן אלה של שלבים V ו- VI שאינם מראים שום סימן לעיכול יתר על ידי האנזימים.
11. הניחו את צלחת הפטרי המכילה את הביציות שנקטפו בתוך תא סביבתי (15-18 מעלות צלזיוס).

2. ביטוי חלבון GJ

1. סינתזה של RNA משלים (cRNA) של קונקסין מסוים או innexin in vitro באמצעות ערכת שעתוק RNA (טבלת חומרים) בהתאם לפרוטוקול היצרן.
2. זרז את ה- cRNA בשיטת ליתיום כלוריד המתוארת במדריך למשתמש של ערכת שעתוק הרנ"א.
3. שטפו את הכדור עם 70% אתנול, מיסו אותו ב-20 μL של H₂O ללא נוקלאז, והוסיפו 1 μL של מעכב ריבונוקלאז (40 U, טבלת חומרים).
4. מדוד את ריכוז ה- cRNA באמצעות ספקטרופוטומטר (טבלת חומרים).
5. מערבבים את ה-cRNA עם אוליגו אנטי-סנס Cx38 כך שהריכוזים הסופיים הם 200-1,000 ng/μL cRNA ו-100 ng/μL oligo.
   הערה: רצף האוליגו הוא 5′-GCTTTAGTAATTCCCATCCTGCCATGTTTC-3′, אשר מתאים לנוקלאוטידים מ-5 עד +25 ב-Xenopus laevis Cx38 mRNA (הצטרפות ל-NCBI: NM_001088018)¹¹. האוליגו נשמר כתמיסת מלאי (2.0 מ"ג/מ"ל) לפני שהוא מעורבב עם ה-cRNA.
6. יש לחסל חלקיקים ב-cRNA על-ידי סיבוב במיקרו-צנטריפוגה (כ-16,000 x גרם) למשך 2 דקות, ולהעביר במהירות את כל הסופרנטנט לצינור חדש על-ידי צנרת (הימנעו מהפרעה לתחתית הצינור המיקרו-צנטריפוג).
7. מחלקים את ה-cRNA ל-aliquots (2.5 μL/בקבוקון), ומאחסנים את ה-aliquots במקפיא של -80 מעלות צלזיוס.
8. הכינו צלחת להזרקת ביציות על ידי הדבקת חתיכה קטנה (כ-1 ס"מ על 1 ס"מ) של רשת ניילון (טבלת חומרים) לתחתית צלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ באמצעות דבק אפוקסי מהיר לריפוי.
   הערה: צלחת הזרקת הביציות ניתנת לשימוש חוזר. שטפו אותו עם 70% אתנול לאחר כל שימוש.
9. מלאו את צלחת הזרקת הביציות בערך באמצע הדרך בתמיסת ND96 (בתוספת פירובט ופניצילין-סטרפטומיצין).
10. מניחים 25-30 ביציות בשורות בתוך צלחת הפטרי.
11. הכן מיקרופיפטים מזכוכית להזרקות ביציות על ידי ביצוע הוראות במדריך למשתמש של מזרק הננוליטר האוטומטי (טבלת חומרים).
    הערה: שימוש במשפע מיקרו-אלקטרוניקה (טבלת חומרים) יכול לעזור לייצר מיקרו-פיפטים חדים בהזרקה הגורמים נזק מינימלי לביציות.
12. יש למלא בחזרה מיקרופיפט בהזרקה בשמן מינרלי קל משקל, ולהחדיר אותו למחזיק המיקרופיפט של המזרק.
13. העבירו את ה-cRNA מאחד האליקוטים המאוחסנים אל המשטח הפנימי של כיסוי צלחת פטרי או תחתיתו על ידי צנרת.
14. שאפו את טיפת ה-cRNA לקצה המיקרופיפט על ידי לחיצה על כפתור ה-FILL בבקר המזרק.
15. הזריקו את ה-cRNA (כ-50 nL/ביצית) על ידי לחיצה על כפתור INJECT .
    הערה: נפח ההזרקה עשוי להיות מוגדר על ידי מתגי הטבילה בבקר המזרק.
16. העבירו את הביציות המוזרקות לצלחת פטרי חדשה המכילה תמיסת ND96 (בתוספת פירובט ופיניצילין-סטרפטומיצין), ושמרו אותן בתוך התא הסביבתי (15-18 מעלות צלזיוס) למשך 1-3 ימים (תלוי במהירות הביטוי של חלבון GJ וברמתו). החלף את התמיסה מדי יום על ידי העברת הביציות לצלחת פטרי חדשה.

3. זיווג ביציות

1. העבירו כמה מהביציות המוזרקות לתוך צלחת פטרי 35 מ"מ המכילה תמיסת ND96.
2. השתמשו בשני פינצטה עדינה (טבלת חומרים) כדי לקלף בעדינות את קרום הוויטלין השקוף שעוטף את הביצית.
   הערה: ייתכן שיהיה צורך לחדד את קצות הפינצטה לפני השימוש הראשון ומדי פעם, באמצעות פיסת נייר זכוכית משובחת (600 Grit).
3. הניחו 2 ביציות לבאר בתא זיווג ביציות (איור 1D) המכיל תמיסת ND96 (בתוספת פירובט ופניצילין-סטרפטומיצין).
   הערה: תא זיווג הביציות נבנה על ידי הדבקת חתיכה קטנה של מיניטריית Microwell (טבלת חומרים) לתחתית של צלחת פטרי 35 מ"מ (טבלת חומרים) באמצעות דבק אפוקסי בעל ריפוי מהיר. המיניטריי נחתך לחתיכות קטנות באמצעות חותך חוט חם (טבלת חומרים). השימוש במיניטריי לזיווג ביציות תואר במקור על ידי אחרים²⁴. למרות שחלבון GJ עשוי להתפשט באופן לא אחיד בקרום תא הביציות בהתאם לתכונות המטען של שאריות חומצות אמינו בתחומים הציטוזוליים שלו²⁵, נראה כי זיווג אקראי (מבלי להבחין בין בעלי החיים לבין הקטבים הצמחיים של הביצית) מספיק באופן כללי.
4. שמור את צלחת פטרי המכילה ביציות מזווגות ב- RT על שולחן הבידוד כדי לשמש להקלטות אלקטרופיזיולוגיות.
   הערה: משך הזיווג יכול להשתנות בין כמה שעות ליום אחד. תרגול נוח הוא להצמיד ביציות בשעות אחר הצהריים המאוחרות ולתעד מהן ביום המחרת.

4. הכנת מערכת רכישה

1. הגדר שני מגברי מהדקי ביציות OC-725C (טבלת חומרים) למצב מדידת זרם צדדי גבוה על-ידי התאמת מתג טבילה פנימי (איור 1B).
2. טחנו את המגברים על ידי חיבור תחילה של שקעי מעגל הקרקע בלוחות האחוריים ולאחר מכן חיבור לכלוב פאראדיי ולנורית הסיבים המשמשת להארת תא ההקלטה.
3. חבר את המגברים לממיר אותות אנלוגי-לדיגיטלי (טבלת חומרים), והגדר אותם במודול Clampex של תוכנת pClamp (טבלת חומרים) בהתאם להוראות מיצרן המגבר.
4. בדוק את מערכת הרכישה עם תא המודל המסופק עם המגבר.
   1. חברו את הגשושית V_DIFF ואת כבלי הזרם (I) לתא המודל, חברו את השקעים האדומים והשחורים בגשושית V_DIFF עם המגשר המצורף, חברו את שתי רגלי המגשר לכל פין בתא המודל, וחברו את חוט ההארקה בתא המודל לכבל משקע מעגל ה-GROUNDS של המגבר (איור 1E).
   2. אפס את מטרים של אלקטרודת המתח (Vm) ואלקטרודת האמבטיה (Im) של המגבר על-ידי הפיכת כפתורי ה-Vm OFFSET וה-Ve OFFSET, בהתאמה, החליפו את ה-Clamp מ-OFF ל-FAST או SLOW והפכו את חוגת ה-GAIN בכיוון השעון לרמה המאפשרת מהדק מתח תקין (איור 1A). מתג D.C. GAIN עשוי להיות במצב OUT או IN.
   3. הפעל פרוטוקול רכישה פשוט המכיל כמה שלבי מתח כדי לאשר שהמתח המוצג במד ה- Vm משתנה בהתאם לפרוטוקול הרכישה וכי עקבות המתח והזרם מוצגים כראוי ב- Clampex.
      הערה: ניתן לבדוק רק מגבר אחד בכל פעם באמצעות גישה זו.

5. הקלטת I_j בין ביציות מזווגות

1. צור פרוטוקולי רכישה להקלטת I_j בתוכנת pClamp.
   הערה: צור שני פרוטוקולי רכישה. באחד מהם, מגבר מספר 1 משמש לייצור סדרה של צעדי מתח ממברנה (V_m) (למשל, -150 עד +90 mV במרווחים של 10-mV), ואילו מגבר #2 משמש לשמירה על V_m קבוע (למשל, -30 mV). בפרוטוקול השני, מגבר #2 משמש לייצור שלבי V_m , ואילו מגבר # 1 משמש לשמירה על קבוע V_m. יש ליישם את שלבי ה - V_m החיוביים והשליליים לחלופין (למשל, -150, +90, -140, +80 ......), אשר ניתן לתכנת ב- Clampex באמצעות תכונת רשימת המשתמשים בפרוטוקול הרכישה.
2. הגדרת במת ההקלטה
   1. השליכו צלחת פטרי אחת המכילה ביציות מזווגות לתוך כלי הקיבול של צלחת פטרי בפלטפורמת ההקלטה (איור 2A)
   2. בחר זוג ביציות וסובב את צלחת פטרי במידת הצורך כך ששתי הביציות יהיו בכיוון שמאל וימין, ונעל את הבמה במקומה על ידי הבסיס המגנטי שלה.
   3. תקן את המעמדים המגנטיים המחזיקים את בדיקות הזרם והמתח במיקומים המתאימים על שולחן הבידוד.
      הערה: ודא שבדיקות הזרם והמתח ממגבר אחד ממוקמות בצד שמאל, בעוד שבדיקות מהמגבר השני נמצאות בצד ימין, ושבדיקת המתח נמצאת מול גשושית הזרם בכל צד (איור 2B, C).
3. הגדרת אלקטרודת הייחוס
   1. מקם אלקטרודת ייחוס (טבלת חומרים) ליד קצה צלחת פטרי לכיוון צד המשתמש (איור 2B, C).
   2. חבר את אלקטרודת הייחוס לשקע השחור (Circuit Ground) רק באחת משתי הגשושיות V_DIFF .
4. הגדרת אלקטרודות V_DIFF
   1. משכו זוג מיקרו-פיפטים מזכוכית, נתקו מעט מהקצה עם כותב היהלומים (טבלת החומרים), והחליקו את קצה הקצה על ידי ליטוש אש.
      הערה: התנגדות הקצה צריכה להיות פחות מ-150 kΩ (נמדדת עם ND96 בפיפטה). בדרך כלל micropipettes עם התנגדות קצה של 20-150 kΩ משמשים.
   2. החזיקו את המיקרופיפט מעל הלהבה של מבער אלכוהול כדי לכופף אותו לזווית חלקה (~130°) במיקום המרוחק כ-1 ס"מ מהקצה.
      הערה: מיקרופיפטים מפוברקים ניתנים לשימוש חוזר. יש לשטוף אותם במים לאחר כל שימוש.
   3. יש למלא את פיפטת הזכוכית באופן מלא בתמיסת ND96, להכניס אותה למחזיק מיקרו-אלקטרוניקה ממולא מראש (עם ND96) (טבלת חומרים, איור 2D), ולוודא שלא קיימות בועות אוויר במערכת.
   4. הכנס את פין ה-2 מ"מ של מחזיק המיקרו-אלקטרוניקה לשקע 2-מ"מ של חוט חיבור אלקטרודות V_DIFF (איור 2D).
   5. הידקו את שקע ה-2 מ"מ על צדפה מבוססת מגנטית (איור 2D), וכיוונו את קצה אלקטרודת ה-V_DIFF לעבר אחת משתי הביציות (איור 2E).
      הערה: התאם את המיקום והזווית של הצדפה כך שקצה האלקטרודה יהיה קרוב מאוד לביצית
   6. הכנס את פין ה-1 מ"מ של חוט חיבור האלקטרודה V_DIFF לשקע האדום (כניסת V_DIFF ) בגשושית V_DIFF באותו צד.
   7. הכן וחבר אלקטרודת V_DIFF עבור הביצית והמגבר האחרים בעקבות הליכים דומים.
      הערה: מבט מקרוב על זוג ביציות וכל האלקטרודות מוצג באיור 2E.
5. הגדרת אלקטרודות הזרם והמתח
   1. הכינו אלקטרודות מתח וזרם מנימי זכוכית, מלאו אותן (בערך באמצע הדרך) בתמיסת KCl (KCl 3.0 M, EGTA 10 mM, HEPES 10 mM, pH 7.4 עם KOH), והכניסו אותן למחזיקי האלקטרודות המסופקים עם המגברים.
      הערה: האלקטרודות צריכות להיות בעלות התנגדות של ~ 1 MΩ. ניתן לקבל אלקטרודות מתאימות מסוג של נימי זכוכית בעלי דופן דקה (טבלת חומרים) באמצעות קבוצה מסוימת של פרמטרי משיכה (טבלה 1). טיפים כאלה יכולים לחדור בקלות את קרום תא הביצית ללא צורך ללחוץ על Vm או על כפתור Ve BUZZ במגבר.
   2. הנמיכו את האלקטרודות לתמיסת האמבטיה, אפסו את מדי ה-Vm וה-Im על ידי הפיכת החוגות Vm OFFSET ו-Ve OFFSET ובדקו את התנגדות האלקטרודות על ידי לחיצה על בדיקת אלקטרודות Vm ומבחן אלקטרודות Ve.
   3. החדירו את אלקטרודות הזרם והמתח לתוך הביציות, וצפו בפוטנציאלי ממברנה שליליים (בדרך כלל -20 עד -50 mV).
      הערה: מדי ה- Vm וה- Im של אותו מגבר צריכים להציג שני ערכים זהים או דומים מאוד.
6. רכישת נתונים
   1. במקטע Clamp של המגבר, ודא ש- D.C. GAIN נמצא במצב IN, סובב את ידית ה- GAIN בכיוון השעון לרמה המאפשרת מהדק מתח תקין (בדרך כלל שליש עד מחצית מהטווח המלא), וסובב את מתג ה- Clamp מ- כבוי למהיר.
      הערה: בעת הפעלת המהדק, מדי Vm ו- Im יציגו את מתח ההחזקה ואת זרם ההחזקה, בהתאמה. למרות שזרם ההחזקה עשוי להשתנות במקצת בהתאם לתנאי הביציות, הוא בדרך כלל קטן ויציב ב-V_m החזקה (למשל, -30 mV).
   2. הפעל פרוטוקול רכישה.
      הערה: ארבעה עקבות יוצגו על המסך. עקבות המתח והזרם ממגבר אחד מציינים את שלבי ה- Vm המופעלים על ביצית #1 ואת הזרם הדרוש לייצור צעדי ה- Vm , בעוד שאלו מהמגבר השני מציינים את ה- Vm הקבוע (-30 mV) של ביצית #2, ואת הזרם המוזרק כדי לשמור על Vm קבוע זה. הזרם המוזרק לביצית #2 מייצג את ה - I_j.

6. ניתוח נתונים

1. ניתוח עם Clampfit.
   1. פתח קובץ abf מוקלט במודול Clampfit של pClamp.
   2. השתמש בסמנים 1 ו- 2 כדי להקיף מקטע של קו הבסיס לפני המעקב של I_j .
   3. לחץ על הסמל התאם את קו הבסיס כדי להוציא חלון בסיסי. בחר חיסור ממוצע של סמנים 1..2 עבור שיטה, ואשר שכל האותות הגלויים וכל העקבות הגלויים נבחרו לבחירת עקבות.
   4. בעת לחיצה על אישור, החלון 'קו בסיס' נסגר, קווי הבסיס של כל עקבות הזרם והמתח מתכנסים ברמת האפס. שים לב ששלבי המתח משתנים לרמות חדשות השוות למתח המקורי בניכוי מתח ההחזקה (לדוגמה, -30 mV).
   5. כדי להתוות את יחסי ה- I_j וה- V_j באמצעות מצב יציב I_j, הקף קטע רצוי של עקבות I_j המייצגים מצב יציב I_j עם סמנים 1 ו- 2, מקם את הסמן 3 בכל מקום בתוך חלון הזמן של שלבי המתח.
   6. עבור אל ניתוח / גרף מהיר / I-V כדי לפתוח חלון I-V .
   7. תחת ציר X (מתח), בחר סמן 3 מתוך אות, ציין את אות צעד המתח (לדוגמה, מתח 1) בתפריט הנפתח וסמן את התיבה הפוך.
      הערה: התיבה Invert מסומנת כדי להמיר את V_m לערכים המקבילים ל- V_j, המוגדר כ- V_m של ביצית #2-V _m של ביצית #1.
   8. תחת ציר Y (נוכחי), בחר את המקור של אות I_j (לדוגמה, זרם 0) מהתפריט הנפתח לצד אות, הגדר אזור כסמנים 1..2 מהתפריט הנפתח ובחר ממוצע.
      הערה: כדי להתוות את יחסי הגומלין I_j ו- V_j , סמנים 1 ו- 2 צריכים להקיף את הקטע של עקבות I_j המכילים את השיא I_j בשלב 6.1.5 ולבחור שיא (במקום ממוצע) בשלב 6.1.8.
   9. תחת אפשרות יעד , בחר /י ״החלף ״ או ״צרף״.
   10. בעת לחיצה על אישור בחלון I-V , מוצגת על המסך מערכת יחסים I_j - V_{j j} , וניתן למצוא את הערכים המתאימים I_j ו- V_j על ידי לחיצה על חלון / תוצאה.
2. להתוות ולהתאים את מערכת היחסים G_{j-V j} ב- OriginPro (טבלת חומרים)
   1. העתק את שתי העמודות המכילות את ערכי V_j ו - I_j מחלון התוצאות של Clampfit (שלב 6.1.10) לחוברת עבודה חדשה במקור. ודא שערכי V_j ו - I_{j נמצאים} תחת עמודות X ו- Y, בהתאמה.
   2. הוסף ארבע עמודות חדשות בחוברת העבודה על-ידי לחיצה על עמודה/ הוסף עמודות חדשות.
   3. תן שם לעמודה החדשה הראשונה כ- G_j, מלא אותה על-ידי הזנת המשוואה "עמודה I_j/column V_j * 1,000" בחלון הגדר ערכי עמודה, וצור תרשים פיזור של יחסי הגומלין G_{j-V j}.
      הערה: הכפל ב- 1,000 (אופציונלי) הוא כדי למנוע את אי הנוחות של התמודדות עם מספרים קטנים מאוד בשלבים הבאים.
   4. התאם את נקודות הנתונים G_j על פני טווחי V_j השליליים והחיוביים באופן עצמאי לפונקציית בולצמן. חשב G_j ב- V_j = 0 mV על ידי הזנת ערכי G_jmax, G_jmin, A ו - V₀ מההתאמה למשוואת בולצמן, דבר שניתן לעשות בגיליון אלקטרוני. ה-G_j המתקבל כך ישמש כ-G_jmax בשלב הבא.
      הערה: המשוואה שתתאים לפונקציית בולצמן היא: G_j = (G_{jmax-G jmin})/{1 + exp[A(V_{j-V 0})]} + G_jmin, שבו V₀ הוא V_j שבו המוליכות היא חצי מקסימלית, G_jmax הוא המוליכות המקסימלית, G_jmin הוא V_j-חסר רגישות מוליכות שיורית²³. כדי לבצע את ההתאמה, תחילה הוסף את משוואת בולצמן כפונקציית התאמה חדשה ל- OriginPro, ולאחר מכן בחר פונקציה זו להתאמה. הזן ערכי זרע משוערים עבור G_jmax, G_jmin, V₀ ו- A לפני ביצוע פונקציית ההתאמה. ודא שהפרמטר G_jmax אינו קבוע עבור התאמה זו.
   5. תן שם לעמודות החדשות השנייה והשלישית כ- nGj-L ו- nGj-R ("n" עבור "מנורמל"), ומלא אותן על ידי חלוקת העמודה G_{j j} בערכים G_jmax הנגזרים מהעקומות G_{j j} - V_j השמאלית והימנית, בהתאמה (שלב 6.2.4).
   6. תן שם לעמודה החדשה הרביעית כ- nGj-LR, ומלא אותה על-ידי העתקת ערכים מטווחי V_j השליליים והחיוביים של העמודות nGj-L ו- nGj-R, בהתאמה.
   7. צור תרשים פיזור עבור nGj-LR מעל V_j, והתאם את נקודות הנתונים מעל טווחי V_j השליליים והחיוביים לפונקציית בולצמן באופן עצמאי. ודא שהפרמטר G_jmax קבוע ב- 1.0 עבור ההתאמה.
   8. שמור רשומות של תוצאות ההתאמה (לדוגמה, הגרף המותאם וערכי G_jmin, V₀ ו- A ).

תוצאות

UNC-7 ו- UNC-9 הם innexins של C. elegans. בעוד של-UNC-9 יש רק איזופורם אחד, ל-UNC-7 יש מספר איזופורמים הנבדלים זה מזה בעיקר באורך וברצף חומצות האמינו של מסופי האמינו שלהם ^7,8. תמימים אלה עשויים ליצור GJs הומוטיפיים כמו גם הטרוטיפיים (של UNC-7 ו- UNC-9) כאשר הם באים לידי ביטוי בביציות קסנופוס ^7,8. עקבות _{מייצגים I j} והיחסים המנורמלים G_{j-V j ...}

דיון

נראה כי אופטימיזציה של המערכת נחוצה לניסויים כפולים של מהדקי מתח ביציות. בלעדיו, הקלטות יכולות להיות מאוד לא יציבות, וייתכן שהמגברים יצטרכו להזריק כמות מופרזת של זרם כדי להגיע למטרה Vm, וכתוצאה מכך לגרום לנזק לביציות ולכשלים ברישום. מספר גורמים הם קריטיים להשגת רישומי ביציות כפולות יציבות בשיטת מדידת הזרם הצדדי הגבוה. ראשית, אלקטרודות הזרם והמתח חייבות להיות בעלות התנגדות מתאימה (~1 MΩ), ומחזיקיהן חייבים להיות נקיים. שנית, אלקטרודות V_DIFF חייבות להיות בעלות התנגדות נמוכה (<150 kΩ) ולהיות קרוב...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מחזיק מגנטי של גשר אגר	ALA מכשירים מדעיים	MPSALT-H	יציב יותר מהדק הצינור של Narishige בשל הבסיס המגנטי הגדול יותר שלו, אך הוא דורש שינוי כדי לקלוט שקע נקבה בגודל 2 מ"מ.
מזרק ננוליטר אוטומטי	Drummond Scientific Company, Broomall, PA, ארה"ב	Nanoject II	מזרק ננוליטר אוטומטי
קולגנאז, סוג II	Gibco-USA, לנגלי, אוקיי, ארה"ב	17101-015
Diamond Scriber	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית, האטפילד, פנסילבניה, ארה"ב	62108-ST
בדיקת מתח דיפרנציאלי	וורנר אינסטרומנטס, המדן, קונטיקט, ארה"ב	7255DI
מכשירים מולקולריים ממיר אותות אנלוגי לדיגיטלי	, סן חוזה, קליפורניה, ארה"ב	Digidata 1440A
Dumont #5 פינצטה	מכשירי דיוק עולמיים, סרסוטה, פלורידה, ארה"ב	500341
נימי זכוכית	Drummond Scientific Company, Broomall, PA, ארה"ב	3-000-203-G/X
חותך חוטים חמים	Amazon.com	Proxxon 37080	אלטרנטיבה היא הרקולס 8500 DHWT, בעל דוושת בקרת כף הרגל.
Hyaluronidase, סוג I-S	MilliporeSigma, ברלינגטון, MA, ארה"ב	H3506
בסיס מחזיק מגנטי	Kanetec USA Corp., Bensenville, IL, ארה"ב	MB-L-45
Microelectrode Beveler	Sutter Instrument, Novato, CA, ארה"ב	BV-10
מחזיק מיקרואלקטרודה	World Precision Instruments, , סרסוטה, פלורידה, ארה"ב	MEH1S15
חולץ מיקרופיפטות	Sutter Instrument, , נובאטו, קליפורניה, ארה"ב	P-97
mMESSAGE mMACHINETM T3	Invitrogen-FisherScientific	AM1348
Nunc MicroWell MiniTray	Nalge Nunc International, רוצ'סטר, ניו יורק, ארה"ב	438733	Microwell Minitray
ניילון	רשת רכיבי חברת אספקת רכיבים, ספרטה, טנסי, ארה"ב	U-CMN-1000
מגבר מהדק ביציות	וורנר מכשירים, , המדן, קונטיקט, ארה"ב	OC-725C
OriginPro	OriginLab Corporation, נורת'המפטון, מסצ'וסטס, ארה"ב	2020b
pClamp	מכשירים מולקולריים, סן חוזה, קליפורניה, ארה"ב	גרסה 10
עולמיים של אלקטרודות ייחוס	, סרסוטה, פלורידה, ארה"ב	DRIREF-2SH	מפרטים: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes
RNaseOUT (מעכב ריבונוקלאז)	Invitrogen-FisherScientific	10777-019
תפר משי 5-0	Covidien, נורת' הייבן, קונטיקט, ארה"ב	VS890
ספקטרופוטומטר NanoDrop Lite	Thermo Scientific	ND-LITE-PR
קפליות זכוכית קיר דק	Precision Instruments, סרסוטה, פלורידה, ארה"ב	מהדק
	Narishige International USA, Amityville, NY, USA	CAT-1	מוכן לשימוש אך מיקומו נוטה להשתנות בגלל הבסיס המגנטי הקטן.
Xenopus laevis	Xenopus Express, ברוקסוויל, פלורידה, ארה"ב	IMP-XL-FM