מתואר פרוטוקול לבידוד שיבוטי תאי מלנומה שעברו טרנספטציה יציבה באמצעות גלילי זכוכית. אנו מתמקדים בעצות מעשיות שעשויות להיות מכריעות להצלחת ההליך כולו.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד של שיבוטי תאי מלנומה שעברו טרנספטציה יציבה
במאמר זה
סיכום
תקציר
אוכלוסיות תאים שיש להן שינויים יציבים במידע הגנומי שלהן נמצאות בשימוש נרחב על ידי מדענים כמודל מחקר. הם אינם דורשים טרנספקציה חוזרת של תאים מכיוון שהיא עלולה להוביל לאוכלוסיית תאים הטרוגנית וליעילות טרנספקציה משתנה, מה שמשפיע על יכולת השחזור. יתר על כן, הם עדיפים לניתוחים בקנה מידה גדול. יצירת שיבוטי תאים יציבים שימושית למגוון רחב של יישומים, כגון מחקר על תפקודי גנים וייצור חלבון רקומביננטי. ישנן מספר שיטות להשגת אוכלוסיית תאים הומוגנית עם טרנספקציה חולפת ראשונית. כאן, אנו מתארים את הבידוד של שיבוטים של תא בודד עם גלילי זכוכית. למרות ששיטה זו ידועה מזה זמן מה, ישנם כמה שלבים מכריעים, והזנחתם עלולה להוביל לכישלון. השתמשנו בהצלחה בשיטה זו כדי להשיג שיבוטים המבטאים יתר על המידה חלבון מעניין (POI) או עם נוקאאוט של גן מעניין (GOI). אנו מתארים שלבי הכנה כגון אופטימיזציה של בחירת ריכוזי תרופות, הכנת גלילי זכוכית ואימות האם לשיבוטים המתקבלים יש את השינוי הרצוי בביטוי ה-GOI על ידי PCR, ניתוח כתמים מערביים, צביעה חיסונית או ריצוף gDNA (תלוי בסוג השיבוטים הנגזרים). אנו דנים גם בהטרוגניות הפנוטיפית של קווי תאים מבוססים היטב מכיוון שזו עשויה להיות בעיה בהשגת שיבוטי תאים יציבים.
מבוא
טרנספקציה יציבה של תאי יונקים היא שיטה המשמשת באופן שגרתי במספר יישומי תרביות תאים, כולל חקר סרטן. יתרונו על פני טרנספקציה חולפת הוא שלא ניתן לאבד את החומר הגנטי הזר שהוכנס עקב גורמים סביבתיים (למשל, מפגש תאים או שלב שכפול) וחלוקת תאים מכיוון שהוא משולב בגנום של המארח1. פיתוח קווי תאים המתבטאים ביציבות יכול להיות מייגע ומאתגר, אך אם נדרש ביטוי מתמשך של גנים לאורך תקופה ממושכת, גזירת קווי תאים יציבים היא אפשרות מועדפת. המטרה הנפוצה ביותר של טרנספקציה היא לחקור את הפונקציות של גן או תוצר גן ספציפי על ידי ייצור יתר או הפחתת ויסות הביטוי שלו. עם זאת, ייצור חלבונים רקומביננטיים וטיפולים גנטיים ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. תת-תרבית תאים וזריעה לאופטימיזציה של ריכוז תרופות
- יש לחמם את מדיום תרבית התאים (במקרה זה, מדיום הנשר המותאם של Dulbecco עם ריכוז מופחת (1.5 גרם/ליטר) של NaHCO3, 10% (v/v) סרום בקר עוברי (FBS), 1% (v/v) L-גלוטמין ו-1% (v/v) אנטיביוטיקה-אנטי-פטריית) ותמיסת טריפסין באמבט מים ל-37 מעלות צלזיוס.
- שאפו והשליכו את מדיום תרבית התאים מתאי A735 הגדלים בבקבוק תרבית תאים T25. קו התאים מתקבל ממקורות מסחריים.
- שטפו את כל מדיום תרבית התאים שנותר מהתאים על ידי שטיפת הבקבוק עם 1 מ"ל של תמיסת טריפסין או PBS.
- שאפו והשליכו את תמיסת הטריפסין או PBS מהתאים.
- הוסף 1 מ"ל תמיסת טר....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
באמצעות הפרוטוקול המוצג, אנו מספקים הדגמה מפורטת של הבידוד של שיבוטי תאי מלנומה שעברו טרנספטציה יציבה בשיטת גליל הזכוכית (איור 1A). המחקרים שלנו מתייחסים לביולוגיה של תאי מלנומה, ומודל המחקר הנפוץ ביותר בו אנו משתמשים הוא קו המלנומה A375 הדבק והפולשני ביותר. מכיוון שהמחקר שלנו הראה שתאי מלנומה מייצרים ג'לסולין (GSN) ברמה גבוהה בהשוואה לסוגים אחרים של סרטן14, אנו חוקרים את תפקידו של חלבון זה בהתקדמות מלנומה. GSN הוא חלבון קושר אקטין הממלא תפקיד בתנועתיות של תאי מלנומה<.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
סיפקנו תיאור מפורט של הבידוד של שיבוטי תאי מלנומה שעברו טרנספטציה יציבה עם גלילי זכוכית. חשוב להשיג שיבוטי בקרה בעת הפקת שיבוטים עם ביטוי שונה של גנים מכיוון שתמיד יש להשוות את התוצאות המתקבלות עבור שיבוטי השינוי הממוקד לתוצאות המתקבלות עבור בקרות. באופן זה אנו יכולים לבדוק האם הטרנספקציה עצמה או תרבית עם אנטיביוטיקה סלקטיבית אינם משפיעים על תוצאות הניסויים, במקום כמה גורמים אחרים, כמו השינוי הגנטי שהוכנס. כאשר מתכננים הכנת שיבוט תאים, כדאי לבדוק האם קו התאים הנבדק הומוגני בייצור POI. יש.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי המרכז הלאומי למדע, פולין (פרויקט #2016/22/E/NZ3/00654, הוענק ל-AJM).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צינור צנטריפוגה 15 מ"ל | GoogleLab Scientific | G66010522 | |
| תרבית תאים 150 מ"מ עם רשת 20 מ"מ | Falcon | 353025 | |
| צלחת 24 בארות | VWR International | 10062-896 | |
| צלחת תרבית 35 מ"מ | Eppendorf | EP0030700112 | |
| צלחת 6 בארות | Eppendorf | EP0030700113 | |
| 96 בארות לוחית | VWR International | 10062-900 | |
| חומצה אצטית, תמיסה 80% | Chempur | 115687330 | |
| Agarose | Prona-Abo | BLE500 | |
| נוגדנים אנטיביוטיים-אנטי-פטרייתיים | Gibco | 15240062 | |
| נוגדנים נגד GAPDH | סנטה קרוז ביוטכנולוגיה בע"מ, | sc-47724 | |
| נוגדנים נגד GSN - שיבוט C20 | סנטה קרוז ביוטכנולוגיה בע"מ, | sc-6405 | |
| נוגדנים נגד GSN - שיבוט GS-2C4 | Sigma-Aldrich | G44896 | |
| אלבומין סרום בקר (BSA) | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Color Taq PCR Master Mix (2x) | EurX | E2525 | |
| Control Double Nickase Plasmid | Santa Cruz Biotechnology Inc., | sc-437281 | |
| Coverslips | bionovo | 16283 | |
| מדיום הרכבה של דאקו | Clontech | S3023 | |
| DMSO - ערכת טיהור DNA דימתיל סולפוקסיד | A3672,0250 | ||
| nbsp; | EurX | 3555-02 | |
| חמור נגד עכבר-Alexa Fluor 488 | Invitrogen | # A-21202 | |
| DTT - 1,4-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| EcoRI | תרמו פישר סיינטיפיק | FD0274 | |
| EDTA- חומצה אתילנדיאמינטטראצטית | פוץ' (Pol-Aura)593280117 | ||
| EGTA - אתילן גליקול-ביס(2-אתר אמינואתיל)- N,N,N',N'-חומצה טטראצטית | סיגמא-אולדריץ' | E0396 | |
| FBS - סרום בקר עוברי | Gibco | 10270-106 | |
| ג'לסולין CRISPR פלסמידים סנטה | קרוז ביוטכנולוגיה בע"מ, | sc-401005-NIC | |
| פורמלדהיד | סיגמא-אולדריץ' | P6148 | |
| גליצרול | סיגמא-אולדריץ' | L-4909 | |
| גלוקוז גבוה Dulbecco' s שונה Eagle' מדיום עם ריכוז מופחת (1.5 גרם/ליטר) של NaHCO3 | האקדמיה הפולנית למדעים,Wroc aw, פולין | 11-500 | |
| Hoechst 33342 | תרמו פישר סיינטיפיק | H3570 | |
| L-גלוטמין | גיבקו | 25030-024 | |
| ליגנין | Bionovo | B-0521 | |
| ליפופקטמין 3000 מגיב טרנספקציה | Invitrogen | L3000-008 | |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich | S6508 | |
| Na4P2O7 | Sigma-Aldrich | P8010 | |
| NaF | Sigma-Aldrich | 450022 | |
| NEBuilder כלי הרכבה | http://nebuilder.neb.com/#!/ | ||
| pACGFP-C1 | Clontech | ||
| PageRuler סולם חלבון צבוע מראש | תרמו פישר מדעי | 26616 | |
| מושלם 100 bp סולם DNA | EurX | E3134 | |
| פלואידין-אלקסה פלואור 568 | Invitrogen | A12380 | |
| קוקטייל מעכב פוספטאז 2 | קוקטייל מעכב | P5726 | |
| סיגמא-אולדריץ' 3 סיגמא-אולדריץ' | P0044 | ||
| פולימראז DNA בנאמנות גבוהה | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| Pierce | תרמו פישר סיינטיפיק | קוקטייל | |
| סיגמא-אולדריץ' | P8340 | ||
| puromycin | InviviGen | ant-pr | |
| סיליקון סיגמא-אולדריץ' | L4509 | ||
| CX80 Polska | |||
| נתרן כלורי - NaCl | Chempur | 7647-14-5 | |
| נתרן דאוקסיכולאט | סיגמא-אולדריץ' | D6750259 | |
| סוכרוז | פוש (Pol-Aura) | PA-06-772090110 | |
| גלילי הזכוכית | Sigma-Aldrich | C3983-50EA | |
| בקבוק תרבית רקמות 25 מ"ל | VWR International | 10062-868 | |
| תרבית רקמות 75 ס"מ בקבוק | VWR | 10062-872 | |
| בסיס Trisma | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| trypsin | האקדמיה הפולנית למדעים,Wrocaw, פולין | 20-500 | |
| אוריאה | סיגמא-אולדריץ' | 8656 | |
| תמיסת קסילן | Chempur | 115208603 |
מקורות
- Recillas-Targa, F. Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals. Molecular Biotechnology. 34 (3), 337-354 (2006).
- Wurm, F. M.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
מאמר זה פורסם
הסרטון יגיע בקרוב