הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

חקר סחר בחלבוני ממברנה בתאי דרוזופילה פוטורצפטור באמצעות חלבונים המתויגים על ידי eGFP

2.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63375

⸱

21 בינואר 2022

 ,  ,  , 
1Institute of Biology, Department of Biochemistry, University of Hohenheim

במאמר זה

סיכום

כאן מתוארות שיטות לא פולשניות ללוקליזציה של חלבוני קרום פוטורצפטור ולהערכת ניוון הרשתית בעין המורכבת דרוזופילה באמצעות פלואורסצנציה eGFP.

תקציר

סחר בחלבון ממברנה מווסת את השילוב וההסרה של קולטנים ותעלות יונים בקרום הפלזמה. תהליך זה חשוב ביסודו לתפקוד התא ולשלמות התאים של תאי העצב. תאי דרוזופילה פוטורצפטורים הפכו למודל לחקר סחר בחלבון ממברנה. מלבד רודופסין, אשר עם ההארה מופנם מממברנת הפוטורצפטור ומתפרק, תעלת היונים דמוית פוטנציאל הקולטן הארעי (TRPL) בדרוזופילה מציגה טרנסלוקציה תלוית אור בין קרום הפוטורצפטור הרבדומרלי (שם הוא ממוקם בחושך) לבין גוף התא הפוטורצפטור (שאליו הוא מועבר עם ההארה). ניתן לחקור את ההובלה התוך-תאית הזו של TRPL בצורה פשוטה ולא פולשנית על ידי ביטוי TRPL המתויג על ידי eGFP בתאים פוטורצפטורים. לאחר מכן ניתן לראות את הפלואורסצנציה eGFP בפסאודו-פופיל העמוק או על ידי מיקרוסקופיה של טבילת מים. שיטות אלה מאפשרות זיהוי של פלואורסצנציה בעין שלמה ולכן הן שימושיות לבדיקות בתפוקה גבוהה ולמסכים גנטיים עבור מוטציות דרוזופילה הפגומות בטרנסלוקציה של TRPL. כאן, הכנת זבובים, הטכניקות המיקרוסקופיות, כמו גם שיטות כימות המשמשות לחקר טרנסלוקציה המופעלת על ידי אור זה של TRPL מוסברים בפירוט. שיטות אלה יכולות להיות מיושמות גם עבור מחקרי סחר בבני אדם על חלבונים אחרים של Drosophila photoreceptor, למשל, רודופסין. בנוסף, על ידי שימוש בחלבונים rhabdomeral המתויגים על ידי eGFP, ניתן להשתמש בשיטות אלה כדי להעריך את התנוונותם של תאים פוטורצפטורים.

מבוא

על ידי אספקה והסרה של חלבונים אל קרום הפלזמה וממנו, סחר בחלבון ממברנה בתאי עצב שולט בציוד קרום הפלזמה באמצעות קולטנים כמו גם תעלות יונים, וכתוצאה מכך מווסת את תפקוד העצבים. לרגולציה שגויה או פגמים בסחר בחלבונים יש בדרך כלל השפעות מזיקות על התאים וגורמות לניוון עצבי. בבני אדם, זה עלול לגרום למחלות נוירודגנרטיביות כגון מחלת אלצהיימר ופרקינסון או רטיניטיס פיגמנטוזה1. פוטורצפטורים בעין המורכבת של Drosophila melanogaster הפכו למערכת מודל in vivo לחקר סחר בחלבון ממברנה2. זה לא רק בגלל הרבגוניות הגנטית של Drosophila המאפשרת מסכים גנטיים יעילים, אלא גם משום שכל המרכיבים החיוניים של קרום הפוטורצפטור סופג האור מאופיינים בפירוט רב וטכניקות מיקרוסקופיות יעילות זמינות שניתן ליישם על עין הזבוב. טכניקות אלה הן המוקד של מאמר זה.

בתאי דרוזופילה פוטורצפטורים, קרום הפלזמה האפית יוצר ערימה צפופה של מיקרוווילי לאורך צד אחד של התא, המכונה rhabdomere. הרבדומרים של תאי הפוטורצפטור R1-6 מסודרים בתבנית טרפזית אופיינית בעוד שתאי הפוטורצפטור R7 ו-R8 יוצרים רבדומר יחיד במרכז הטרפז3. יש צורך בסחר בחלבוני ממברנה לצורך תחלופה מוסדרת של חלבוני ממברנה רבדומרליים כגון רודופסין וה-TRP המופעל באור (פוטנציאל קולטן חולף) ותעלות יונים TRPL (דמויות TRP) כדי להבטיח את הכמות הנכונה של חלבוני פוטו-טרנסדוקציה אלה ברבדומר. חלבוני קרום פוטורצפטור מסונתזים ברשתית האנדופלסמית ומועברים דרך מנגנון גולג'י לרבדומר. לאחר הפעלת רודופסין על ידי אור, מולקולת רודופסין יכולה להיות מושתקת על ידי ספיגה של פוטון שני או להיות מוסרת מהרבדומר על ידי אנדוציטוזה בתיווך קלתרין. רודופסין אנדוציטוסי מתפרק בליזוזום או ממוחזר בחזרה לרבדומר 4,5. תעלת היונים TRPL מופנמת גם לאחר הפעלת מפל הפוטו-טרנסדוקציה ועוברת טרנסלוקציה תלוית אור בין הרבדומאר (שם הוא ממוקם כאשר זבובים מוחזקים בחושך) לבין תא אחסון מועשר ב-ER בגוף התא (שאליו הוא מועבר תוך מספר שעות עם ההארה)6,7,8,9,10 . בניגוד לרודופסין אנדוציטוסיטוס, רק כמויות קטנות של TRPL מתפרקות דרך המסלול האנדוליזוזומלי, והרוב מאוחסן במקום זאת תוך-תאי וממוחזר בחזרה לרהבדומר עם הסתגלות כהה6. לפיכך, TRPL יכול לשמש לניתוח סחר המופעל על ידי אור של חלבוני ממברנת פלזמה. תאים פוטורצפטורים של דרוזופילה משמשים גם לחקר ניוון עצבי. ניוון תאי פוטורצפטור נקבע לעתים קרובות על ידי הערכת המבנה של rhabdomeres, אשר מתפרקים כתוצאה מתהליכים ניווניים5.

על מנת לחקור את הלוקליזציה התת-תאית של TRPL ורודופסין בתאי פוטורצפטור או בניוון תאי פוטורצפטור, יושמו כאן שתי שיטות מיקרוסקופיה פלואורסצנטיות הנבדלות זו מזו ביחס למהירות הניתוח ולרזולוציה. שיטה מהירה מאוד, לא פולשנית, שיכולה לשמש למסכים גנטיים אך עם רזולוציה מרחבית מוגבלת היא זיהוי של פלואורסצנציה בפסאודו-פופיל עמוק (DPP). ה- DPP הוא תופעה אופטית של עיניים מורכבות פרוקי רגליים שמקורן הגיאומטרי הוסבר בפירוט על ידי פרנצ'סקיני וקירשפלד בשנת 197111. בקיצור, בכמה מישורים אופטיים מתחת לכיסוי הרשתית ניתן לראות תמונות-על של rhabdomeres מאומטידיה סמוכה. במישור מוקד דרך מרכז עקמומיות העין, הקרנות על-גביות אלה יוצרות תמונה המזכירה את הפריסה הטרפזית של הרבדומרים באומטידיום יחיד רק בסדרי גודל גדולים יותר. תופעה זו יכולה גם להיות נצפית ללא תלות בביטוי אקסוגני של חלבונים פלואורסצנטיים (למשל TRPL::eGFP8), אשר בכל זאת הופכים את ה-DPP לקל יותר לזיהוי (איור 1A-A'')12. שיטה לא פולשנית שנייה היא מיקרוסקופיית טבילה במים המסתמכת על הדמיה של חלבונים המתויגים באופן פלואורסצנטי לאחר נטרול אופטי של המנגנון הדיופטרי של העיניים באמצעות מים (איור 1B-C'')12. באמצעות שיטת טבילת המים, ניתן להעריך באופן כמותי את הכמות היחסית של TRPL::eGFP ברבדומרים או בגוף התא עבור תאים פוטורצפטורים בודדים. יתר על כן, ניתן להשתמש בחלבונים שאינם מתויגים בפלואורסצנציה כדי להעריך את שלמות הרבדומרל ולקבוע את מהלך הזמן של התנוונות פוטנציאלית באופן כמותי, כפי שמתואר כאן.

בעוד שהקלטות של ה-DPP הן ללא ספק הקלות והמהירות ביותר מבין השיטות הללו לביצוע, הרזולוציה המרחבית של הנתונים שהן מייצרות מוגבלת. בנוסף, ישנן סיבות רבות מדוע DPP עשוי להיות נעדר, אשר אינם בהכרח ניתן להבחין על ידי הדמיית DPP עצמה. מכיוון שה- DPP מייצג סיכום של מספר אומטידיה, מידע על תאים בודדים הולך לאיבוד. לפיכך, הדמיית DPP ברזולוציה נמוכה משרתת תפקיד חשוב בסינון מספר רב של זבובים, אך בדרך כלל יש לעקוב אחריה הקלטות ברזולוציה גבוהה יותר בדרך של מיקרוסקופיה של טבילה במים. מיקרוגרפים של טבילה במים מאפשרים פרשנויות על תאים בודדים, פגמים התפתחותיים, מורפולוגיה של העיניים, אי-סלוקליזציה של חלבונים או ניוון רשתית, כמו גם כימות של השפעות אלה. פרוטוקול זה מתאר את שתי הטכניקות הללו בפירוט.

figure-introduction-1
איור 1: סקירה כללית של וריאציות מיקרוסקופיה עבור עין הדרוזופילה המוצגות בפרוטוקול זה. ייצוגים סכמטיים ומיקרוגרפים למופת של הדמיית פסאודו-פופיל עמוק (DPP) פלואורסצנטית (A-A''), מיקרוסקופיית טבילת מים קטלנית (B-B'') של רבדומרים פלואורסצנטיים, ו-(C-C'') מיקרוסקופיית טיפת מים לא קטלנית של רהבדומרים פלואורסצנטיים. סרגל קנה מידה (A''): 100 מיקרומטר. סרגלי קנה מידה (B''-C''): 10 מיקרומטר. הנתון שונה מהפניה13. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. שיקולים כלליים

  1. השתמש במניות Drosophila המבטאות חלבון פלואורסצנטי הממוקם באופן קבוע במיקום רבדומרלי לניתוח מורפולוגי (לדוגמה, TRP::eGFP, eGFP::NINAC) וטרנסלוקציה של חלבונים לניתוחים בנוגע לסחר בחלבונים (לדוגמה, TRPL::eGFP, Arr2::eGFP).
  2. קבעו מראש תנאי חשיפה לאור של זבובים נבחרים לצורך הגישה הניסיונית.
    1. להתאמה כהה, שמור את הזבובים בקופסאות חשוכות לתקופה הרצויה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. להארה של עד 16 שעות בניסויי טרנסלוקציה (לדוגמה, TRPL::eGFP המבטאת זבובים), יש לשמור על זבובים מתחת לצינור פלואורסצנטי בטמפרטורת החדר.
    2. בניסויים המעריכים ניוון פוטורצפטורים (לדוגמה, TRP::eGFP המבטא זבובים), שמור את הזבובים מתחת לצינור פלואורסצנטי בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס במחזור חושך של אור של 12 שעות / 12 שעות להארה ארוכת טווח של עד 28 ימים עם אור לבן.
    3. להארת זבובים באור צבעוני, השתמשו בקופסאות פלסטיק שקופות בצבעים שונים יחד עם צינור הפלורסנט.
  3. אם נעשה שימוש במלאי זבובים עם עיניים פיגמנטיות, בעלי חיים מזדקנים דווקא לניתוח השוואתי, שכן פיגמנטציה של העין עשויה לגדול באופן משמעותי עם הגיל.
    הערה: לצורך פרשנות נתונים, חשוב לציין שקיימת הטיית אות עקב אפקט הגל האופטי של המבנה הרבדומרלי. בהתאם לכך, האות הפלואורסצנטי מהרבדומר תמיד יוגבר במידה מסוימת בהדמיית DPP ובמיקרוסקופיית טבילת מים ביחס לאותות המתקבלים מגוף התא. זה נצפה באופן הבולט ביותר בעיניים פיגמנטיות, שבהן פלואורסצנציה מחוץ לרבדומרים נספגת על ידי פיגמנטים אלה ויש לה חשיבות מיוחדת כאשר יש לזהות חלבוני היתוך תוך-תאיים. לפיכך, לגבי שלבים קריטיים, מחקר זה מתייחס בנפרד לזבובים לבנים ואדומים עיניים.
  4. לגבי מיקרוסקופיה של טבילה במים, מתוארות שתי וריאציות. וריאציה קטלנית מהירה יותר, כמו גם וריאציה לא קטלנית המאפשרת התאוששות למחקרים הבאים.

2. הדמיית DPP

  1. הכינו את חלל העבודה עם הציוד והריאגנטים הדרושים, כפי שמוצג באיור 2. להרדים זבובים (בני 1-3 ימים) של גנוטיפ המבטא חלבון פלואורסצנטי בתאי פוטורצפטור עם CO2 על משטח זבובים. בחר בעלי חיים להדמיה תחת מיקרוסקופ סטריאו עם מקור אור קונבנציונלי והגדלה נמוכה (למשל, פי 10).

figure-protocol-1
איור 2: סביבת עבודה להדמיית DPP. החומרים הדרושים הם (A) מכשיר הרדמה CO2 , (B) מיקרוסקופ סטריאו עם מנורת UV ומערכת מסנן פלואורסצנטי, (C) מקור אור, (D) מצלמה המותקנת על מיקרוסקופ עם (E) תוכנה, (F) מברשת צבע, (G) קרטון שחור, ו-(H) בקבוקון זבוב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

  1. לצורך הדמיית DPP, השאירו את הזבובים שנבחרו מורדמים והניחו את אחד מהם במרכז מטרת המיקרוסקופ על צדו, כך שעין שמאל או ימין תפנה למטרה באופן רדיאלי מדויק (איור 3A).
    הערה: מאחר שהמתווה האומטידיאלי של תאי הפוטורצפטור מציג סימטריית מראה בקו האמצע הגבי-בנטרלי, עדיף לראות את ה-DPP מעט מעל או מתחת לקו המשווה של העין (איור 3B).

figure-protocol-2
איור 3: מיקום הזבוב מתחת לסטריאומיקרוסקופ להדמיית DPP. (A) איור של הזבוב על צדו כאשר עין אחת פונה אל מטרת המיקרוסקופ באופן רדיאלי. (B) יש לסובב את ראש הזבוב מעט למעלה או למטה כך שהמטרה תתמקד בנקודה מעט מעל או מתחת לקו המשווה של העין כפי שמציינים החצים האדומים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

  1. הגדל את ההגדלה כך שתתאים לכל העין (למשל, פי 100) ומרכז את האומטידיה המרכזית של העין. הפחיתו את עומק השדה של המיקרוסקופ, למשל, על ידי התאמת הסרעפת בעלת הקשתית הכפולה לסביבה רדודה (איור 4A-B').
  2. כבו את מקור האור הקונבנציונלי והדליקו את מנורת ה-UV של המיקרוסקופ בעוצמה מרבית ובחרו את סט המסנן הפלואורסצנטי של המיקרוסקופ בהתאם לחלבון הפלואורסצנציה המבוטא בעיניים (איור 4C-E). הגדר את נתיב האור לעבר המצלמה המותקנת במיקרוסקופ.
  3. השתמש בתכונת ההדמיה החיה בתוך התוכנה כדי להתאים את בהירות התמונה להגדרה שמזהה רק אותות ספציפיים מהעין על-ידי התאמת זמן החשיפה וערך העלייה (לדוגמה, 80 אלפיות השנייה ו-12x, בהתאמה). התאימו מחדש את המיקרוסקופ להתמקד "לתוך" העין (מתחת לקרנית) כדי ליצור את התמונה העל-גבית של ה-DPP (איור 4C-E').

figure-protocol-3
איור 4: איור של הדמיית DPP ו-DPP פלואורסצנטית. תמונות מופתיות של עיני דרוזופילה תחת תאורה קונבנציונלית ו-UV עם סט מסנן GFP, שצולמו עם מישורי מוקד משתנים המאוירים בחתכים סכמטיים דרך העין. (A) מיקרוגרף נרשם עם הגדרות בהירות של מקור אור קונבנציונלי, זמן חשיפה של 30 אלפיות השנייה, רווח של פי 1, עומק שדה עמוק ומישור מוקד ליד פני השטח של הקרנית כפי שמודגם ב-(A'). (B) מיקרוגרף נרשם עם הגדרות בהירות של מקור אור קונבנציונלי, זמן חשיפה של 30 אלפיות השנייה, רווח של פי 1, עומק שדה רדוד ומישור מוקד כ-180 מיקרומטר מתחת לפני השטח של הקרנית כפי שמתואר ב-(B'). DPP ציין. (ג-ה) מיקרוגרף נרשם עם הגדרות בעוצמה גבוהה של מקור אור UV וערכת מסנני GFP, זמן חשיפה של 80 אלפיות השנייה, רווח של פי 12, עומק שדה רדוד ומישור המוקד (C') ליד, (D') מעט מתחת, או (E') כ-180 מיקרומטר מתחת לפני השטח של הקרנית. DPP פלואורסצנטי מסומן בחץ מעוקל. סרגל קנה מידה 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

  1. צלם תמונה של ה-DPP הפלואורסצנטי. החליפו את המיקרוסקופ בחזרה לאור הנראה ואת נתיב האור בחזרה לכיוון עיניהם. שחזרו את החיה המצולמת בבקבוקון זבובים להמשך הליכים על פי פנוטיפ ה-DPP שלה (למשל, צלבים). המשך עם החיה הבאה בשלב 2.2.

3. מיקרוסקופיית טבילה במים

  1. הכנת זבובים
    1. הכינו את חלל העבודה עם הציוד והריאגנטים הדרושים, כפי שמוצג באיור 5. מעבירים זבובים עם תנאי גיל ותאורה קבועים מראש לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל מקורר מראש ומרדימים על ידי דגירה שלהם על קרח למשך 15 עד 30 דקות.
      הערה: נשאו עמכם זבובים בני יום אחד, המותאמים לחושך, כהפניה. באופן כללי, זבובים המותאמים לכהה צריכים להיות מועברים לארגז קרח עם מכסה בחושך. זבובים המותאמים לאור יכולים להיות מועברים לקרח באור החדר.

figure-protocol-4
איור 5: סביבת עבודה של מיקרוסקופיית טבילה במים. החומרים הדרושים הם: (A) צינור צנטריפוגה 15 מ"ל, (B) פתיתי קרח, (C) מים מזוקקים צוננים, (D) סטריאומיקרוסקופ, (E) צלחת פטרי, (F) פלסטלינה, (G) החלקת אובייקט, (H) סיכות חרקים או קצות פיפטה ואזמל, (I) מיקרוסקופ פלואורסצנציה עם (J) תוכנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

  1. בחר את ההכנה המתאימה מבין השתיים המתוארות להלן (3.1.3 וריאציה קטלנית או 3.1.7 וריאציה לא קטלנית) ובכל פעם שנעשית הבחנה בין עיניים פיגמנטיות ללא פיגמנטיות, בצע את השלבים המתאימים.
  2. הכן זבובים לווריאציה הקטלנית כדלקמן.
  3. הדביקו חתיכת פלסטלינה על שקופית אובייקט וחתיכה נוספת למרכז צלחת פטרי (למשל, 94 מ"מ Ø) ושמרו על הפרדה ביניהם לעת עתה. מלאו את צלחת הפטרי במים מזוקקים מקוררים בקרח ובכמה פתיתי קרח (איור 6A).
  4. שים זבוב אחד מורדם קרח מתחת לסטריאומיקרוסקופ על גבי שקופית האובייקט המצופה פלסטלינה. סובבו את הזבוב על גבו וחדרו סיכת חרקים דרך מרכז בית החזה (איור 6B). קבעו את הסיכה בצורה אופקית על החלקת האובייקט המצופה פלסטלינה וכיוונו את העין השמאלית או הימנית של הזבוב כלפי מעלה (איור 6C).
  5. קבעו בזהירות את מגלשת האובייקט, כאשר הצד נטול הפלסטלינה שלה פונה כלפי מטה, בצלחת פטרי ומונעת סיבוב של הזבוב. ודאו שעין הזבוב מכוסה במים (איור 6D). השתמשו במחט הכנה כדי להסיר בזהירות את בועות האוויר שאולי נוצרו סביב העין, והמשיכו מיד לרכישת התמונה לקבלת התוצאות הטובות ביותר.
    הערה: עיכוב משמעותי ברכישת התמונה גורם להתעוררות מחדש ולתנועות של הזבוב, מה שעלול להוביל לתמונות מטושטשות.

figure-protocol-5
איור 6: הכנה למיקרוסקופיה קטלנית של טבילת מים. איור של (A) החלקת עצם מצופה פלסטלינה וצלחת פטרי, (B) הצמדת זבוב דרך בית החזה על קרקע פלסטלינה, (C) כיוון זבוב על שקופית האובייקט המצופה פלסטלינה, ו-(D) מערך ניסויי סופי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

  1. הכינו זבובים לווריאציה הלא קטלנית באופן הבא.
  2. מעבירים זבוב אחד מורדם בקרח לתוך קצה פיפטה של 200 μL ודוחפים את הזבוב לכיוון הקצה בזהירות עם אוויר דחוס.
  3. חותכים את קצה הפיפטה ממש מול הראש באמצעות אזמל. באמצעות פינצטה, דחפו בזהירות את הזבוב כמה מילימטרים הרחק מהקצה. חותכים שוב את קצה הפיפטה ודוחפים את הזבוב בחזרה לכיוון הקצה עם אוויר דחוס, כך שרק ראש הזבוב בולט מקצה הפיפטה.
  4. הדביקו חתיכת פלסטלינה על החלקת עצם ולחצו לתוכה את קצה הפיפטה כך שעין שמאל או ימין של הזבוב תפנה כלפי מעלה (איור 7A). ממש לפני רכישת התמונה, השתמשו בפיפטה של מעבדה כדי להדביק טיפה גדולה של מים צוננים לחלק התחתון של מטרת טבילת מים (איור 7B). המשך באופן מיידי לרכישת תמונה לקבלת התוצאות הטובות ביותר.
    הערה: עיכוב משמעותי ברכישת התמונה גורם להתעוררות מחדש ולתנועות של הזבוב, מה שעלול להוביל לתמונות מטושטשות.

figure-protocol-6
איור 7: הכנה למיקרוסקופיית טיפת מים לא קטלנית. איור של (A) זבוב מורדם קר קבוע בתוך קצה פיפטה של 200 μL המותקן על מגלשת עצם מצופה פלסטלינה ו-(B) יישום של טיפת מים צוננים בצד התחתון של מטרת טבילת המים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

  1. רכישת תמונה
    1. הניחו בזהירות את צלחת הפטרי (שלב 3.1.3) או את החלקת האובייקט (שלב 3.1.7) עם הזבוב המוכן על במת המיקרוסקופ ובחרו מטרת טבילת מים.
    2. הנמיכו את מטרת טבילת המים באופן ידני עד שהם נוגעים בפני המים (שלב 3.1.3) או שהעין של הזבוב נוגעת בטיפה (שלב 3.1.7) (איור 8A,B).
    3. הפעילו את מנורת ה-UV של המיקרוסקופ ובחרו את ערכת הסינון המתאימה. השתמשו בעיניות כדי למקם את הזבוב מתחת למטרה ולמקד את המיקרוסקופ על פני השטח של העין.
    4. החלף את נתיב האור לכיוון מצלמת המיקרוסקופ וצור תמונה חיה בתוכנה המתאימה. התאימו מחדש את המיקוד למצלמה והעריכו את כיוון העין, בהתחשב בכך שהעין צריכה להתמודד עם מטרת המיקרוסקופ באופן רדיאלי כפי שמודגם בפירוט רב יותר באיור 8C-E.

figure-protocol-7
איור 8: מיקום הזבוב מתחת למיקרוסקופ הפלואורסצנטי לצורך הדמיית טבילה במים. הגדרה וכיוון סופי לרכישת תמונה באמצעות (A) פרוטוקולי הכנת זבובים קטלניים או (B) לא קטלניים. (C) המחשה של כיוון זבוב להשגת התוצאות הטובות ביותר של תמונות מיקרוסקופיית טבילה במים. הנקודה האידיאלית להתמקד בעין אינה המרכז המדויק ביחס לצירים הקדמיים/אחוריים והגחוניים/הגחוניים, אלא מעט מעל קו המשווה של העין, כפי שמעיד החץ האדום. (D) דוגמה לתמונת טבילה במים לעין במיקום מושלם. כל שלושת צירי הסימטריה של הריצוף האומטידיאלי המשושה מופיעים כקווים ישרים והכמות המרבית של אומטידיה יכולה להיות בפוקוס בו זמנית. (E) דוגמה לתמונת טבילה במים של עין הממוקמת בצורה לא נכונה. התמונה מכילה צירים מעוקלים ועומק שדה רדוד. סרגל קנה מידה: 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

  1. השתמש ב- LUT המתאים (טבלת חיפוש למעלה) בתוך תוכנת ההדמיה כדי לזהות גלישת יתר (מסומנת כפיקסלים אדומים).
  2. במקרה של זבובים ללא פיגמנט, התאם את זמן החשיפה כך שהפיקסלים הבהירים ביותר יהיו ממש מתחת לגבול הרוויה עבור כל תמונה.
  3. במקרה של זבובים פיגמנטיים והשונות הקטלנית, התאימו את זמן החשיפה כך שכל הפיקסלים הבהירים ביותר יהיו מעט מתחת לגבול הרוויה בחמישה זבובים בני יום אחד לפחות, המותאמים לכהים. החל את זמן החשיפה הממוצע המחושב על כל תנאי הניסוי האחרים (גנוטיפים, תנאי תאורה, נקודות זמן וכו ').
  4. במקרה של זבובים פיגמנטיים (למשל, אדומי עיניים) והשונות הלא קטלנית, התאימו את זמן החשיפה כך שכל הפיקסלים הבהירים ביותר יהיו ממש מתחת לגבול הרוויה עבור כל זבוב בן יום אחד, מותאם לכהה בנפרד. החל את זמן החשיפה הזה על כל תנאי הניסוי האחרים (תנאי תאורה, נקודות זמן וכו') של זבוב זה.
  5. הקלט תמונה ושמור אותה כקובץ גולמי כדי לאחסן בארכיון את כל המטא-נתונים המתאימים של ההקלטה. ייצא את התמונה בתבנית .tif עבור הכימות הבא.
    הערה: במקרה של הווריאציה הלא קטלנית, האירו את הזבובים במשך 5 דקות באור אדום (למשל, 630 ננומטר) מיד לאחר רכישת התמונה, אם הם מיועדים לשמש לניסויים נוספים. אור אדום משבית את מפל הפוטו-טרנסדוקציה שהופעל בצורה מוגזמת על-ידי אור אינטנסיבי בגלים קצרים במהלך רכישת התמונה.

  1. ניתוח נתונים וכימות של פלואורסצנציה eGFP יחסית ברבדומרים של מיקרוגרפים של טבילת מים
    1. הורד, התקן והפעל את התוכנה ImageJ/Fiji.
    2. התאם את הגדרות ImageJ על ידי לחיצה על נתח > הגדר מדידות... וסמן רק את התיבה עבור 'ערך אפור ממוצע'. ייבוא תמונה .tif על-ידי לחיצה על קובץ > פתח... או על ידי גרירה ושחרור. בחר אזור מייצג של התמונה שנמצא במוקד והגדל אותה ל- 200%-300% על-ידי הקשה חוזרת ונשנית על Ctrl ו - + יחד .
    3. בחר בכלי הסגלגל ותוך כדי לחיצה על מקש Shift צור בחירה מעגלית בתמונה הקטנה משמעותית מרבדומר פלואורסצנטי אחד. לפני שחרור לחצן העכבר, חפש את הגודל המדויק המוצג מתחת לסרגל הכלים בחלון הראשי של ImageJ. השתמש באותו גודל של בחירה מעגלית עבור כל הניתוחים.
      הערה: הגודל המדויק של הבחירה המעגלית בפיקסלים או במיקרונים תלוי בהגדרה הספציפית. השתמש בעיגול בערך 1/3 או 1/4 מהקוטר הרבדומרלי של זבובי בקרה בני יום אחד, המותאמים לכהה.
    4. הזז את הבחירה העגולה על-ידי לחיצה על העכבר לתוכו וגרירה או על-ידי לחיצה על מקשי החצים במקלדת.
    5. כדי למדוד את עוצמות הפלואורסצנציה בתוך הבחירה המעגלית, הזז את המעגל ל- rhabdomere הראשון (r1) ולחץ על נתח > מדוד או השתמש בקיצור המקשים Ctrl + M. חלון תוצאה המפרט את הערך האפור שנמדד יופיע.
    6. המשך עם מדידות של r2-r6 כמדידות חוזרות ומדידת אות הרקע (b). במקרה של זבובים ללא פיגמנט, בצע מדידות נוספות של אזורי גוף התא המתאימים (c1-c6) (איור 9).

figure-protocol-8
איור 9: כימות של פלואורסצנציה רבדומרלית יחסית למחקרי טרנסלוקציה. המחשה לגבי כימות פלואורסצנציית eGFP יחסית ברבדומרים על ידי מדידת עוצמת הפלואורסצנטיות של rhabdomere (r), גוף התא (c) והרקע (b) של שלושה אומטידיה מייצגת (עיגולים לבנים) שונים בתמונת מיקרוסקופיית טבילה אחת במים; סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. אומטידיום מוגדל מוצג מימין; סרגל קנה מידה: 2 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

  1. חזור על שלבים 3.3.5 ו- 3.3.6 עבור שני אומטידיה נוספים, וכתוצאה מכך שלושה שכפולים טכניים. סמן את האומטידיה המנותחת באמצעות הכלי עיפרון ושמור תמונה זו לתיעוד.
  2. בחר והעתק את הערכים האפורים שנמדדו מחלון התוצאה והדבק אותם בתוכנת גיליון אלקטרוני לצורך חישובים נוספים. מיין את הערכים של עוצמת הפלואורסצנציה לפי מקורם לקטגוריות rhabdomere (r), גוף התא (c) והרקע (b). חשב את העוצמה הממוצעת מכל קטגוריה (Ir, Ic, Ib).
  3. חשב את הכמות היחסית של eGFP הקיימת ברבדומר (R), באמצעות הנוסחה הבאה (1) עבור ללא פיגמנט ונוסחה (2) עבור עיניים פיגמנטיות:
    figure-protocol-9(1)
    figure-protocol-10(2)
  4. המשך עם התמונה הבאה בשלב 3.3.3. מומלץ להשתמש בתמונות של לפחות חמישה פרטים מכל קבוצת ניסוי כשכפולים ביולוגיים כדי לקבל מדידה אמינה.
  1. ניתוח נתונים וכימות של מורפולוגיה של העין על ידי פלואורסצנציה eGFP במיקרוגרפים של טבילה במים
    1. הורד, התקן והפעל את תוכנת ImageJ/Fiji. ייבא תמונה .tif על-ידי לחיצה על קובץ > פתח... או על-ידי גרירה ושחרור. בחר שלוש אומטידיה סמוכות באזור מייצג של התמונה שנמצאת במוקד.
    2. הערך את 18 הרבדומרים של הברירה בנפרד על פי עוצמת ה- eGFP שלהם, חדות הקצוות והניגודיות ביחס לאות הרקע שמסביב כדי ליצור מדד ניוון. ניקוד של rhabdomeres גלויים בבירור עם ערך של 2, rhabdomeres גלויים חלשים עם ערך של 1, rhabdomeres נעדרים עם ערך של 0 (איור 10).
      הערה: דרך כימות זו מביאה לציון של 36 לעיניים שלמות לחלוטין ולציון של 0 לעיניים מנוונות לחלוטין. מומלץ לקבוע את הציון של 36 עד 100% על מדד הניוון.

figure-protocol-11
איור 10: כימות באמצעות הערכת rhabdomere למחקרי ניוון. המחשה לגבי כימות מורפולוגיה של העין על ידי ניקוד הרבדומרים של שלושה אומטידיה מייצגים שונים (עיגולים לבנים) בתמונת מיקרוסקופיית טבילה אחת במים עם ערכים של 2 (גלוי בבירור; עיגול כחול), 1 (נראה חלש; עיגול כתום), או 0 (נעדר; עיגול אדום). סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. אומטידיום מוגדל מוצג מימין; סרגל קנה מידה: 2 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

  1. פתח את התמונה הבאה והמשך עם שלב 3.4.2. מומלץ להשתמש בתמונות של לפחות שמונה פרטים מכל קבוצת ניסוי כשכפולים ביולוגיים כדי לקבל מדידה אמינה.
    הערה: מכיוון ששיטת כימות זו פחות אובייקטיבית מהשיטה לכימות טרנסלוקציה על ידי עוצמת פלואורסצנציה, המספר המומלץ של שכפולים גבוה יותר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

נוצרו זבובי דרוזופילה מהונדסים המבטאים חלבון היתוך TRPL::eGFP בשליטת מקדם רודופסין 1. בזבובים אלה, TRPL::eGFP מתבטא בתאי פוטורצפטור R1-6 של העין המורכבת ומציג לוקליזציה תלוית תאורה. כאשר זבובים נשמרים בחושך, TRPL::eGFP משולב ברבדומרים החיצוניים. לאחר ההארה במשך מספר שעות, TRPL מבצע טרנסלוקציה לתוך גוף התא, שם הוא מאוחסן בתא מועשר ב-ER. 8,10 כאשר TRPL::eGFP ממוקם ברבדומרים, ניתן לראות את הפלואורסצנציה שלו ב- DPP. עם זאת, פלואורסצנציה רבדומרלית נעלמת באור ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הישימות של חלבונים פלואורסצנטיים ופשטות ההקרנה על ידי הדמיית DPP ומיקרוסקופיה של טבילת מים ברשתית הוכחו כמוצלחות על ידי קבוצות רבות12. אסטרטגיות דומות לאלה שהוצגו כאן שימשו במספר בדיקות גנטיות כדי לזהות פגמים ברמות ביטוי רודופסין, הומאוסטזיס, ארגון רשתית או שלמות תאית בעזרת Rh1::eGFP 17,18,19,20,21. כפי שהוסבר לעיל, ניתן להשתמש בהעתקת ח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

ברצוננו להודות לחוקרים הסטודנטים שלנו לאורך השנים. בפרט, נינה מאייר, סיביל מאייר, ג'וליאן קאים ולורה ג'אגי, שנתוניהם שימשו בפרוטוקול זה כתוצאות מייצגות. המחקר של הקבוצה שלנו שהוצגה כאן מומן על ידי מענקים מ- Deutsche Forschungsgemeinschaft (Hu 839/2-4, Hu 839/7-1) לארמין הובר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינור צנטריפוגה 15 מ"לGreiner Bio-One188271
CO2 כרית זבוב הרדמהFlystuff59-172
מנורת אור קר (KL 1500 LCD)Zeiss
Fiji/ImageJNIH
מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מנורת UV, מצלמה, סט מסננים ותוכנה (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 כחול מהדורה)שפופרת
(Lumilux T8, L 30W/840, 4000 K, G13)
[1750 Lux, Ee470nm = 298 µ W cm-2, Ee590nm = 215 µ W cm-2]
ו-[760 Lux, Ee470nm = 173 µ W cm-2, Ee590nm = 147 µ W cm-2]		Osram4050300518039
פיפטת מעבדה (20-200 ומיקרו; L)אובייקט אפנדורף
רוט0656.1
צלחת פטרי (94 מ"מ)גריינר ביו-וואן633102
קצות פיפטה (200 ומיקרו; L)7695844Labsolute
(Blu-Tack)מיקרוסקופ סטריאו Bostik30811745
(SMZ445)של ניקון
עם מנורת UV, מצלמה, סט תיוק ותוכנה (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12)Leica
פלואורסצנטית Zeiss שקופית פלסטלינה מיקרוסקופ סטריאו

מקורות

  1. Wang, X., Huang, T., Bu, G., Xu, H. Dysregulation of protein trafficking in neurodegeneration. Molecular Neurodegeneration. 9. 9, 31(2014).
  2. Schopf, K., Huber, A. Membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells. European Journal of Cell Biology. 96 (5), 391-401 (2017).
  3. Hardie, R. C. The photoreceptor array of the dipteran retina. Trends in Neurosciences. 9, 419-423 (1986).
  4. Wang, T., Montell, C. Phototransduction and retinal degeneration in Drosophila. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 454 (5), 821-847 (2007).
  5. Xiong, B., Bellen, H. J. Rhodopsin homeostasis and retinal degeneration: lessons from the fly. Trends in Neurosciences. 36 (11), 652-660 (2013).
  6. Bähner, M., et al. Light-regulated subcellular translocation of Drosophila TRPL channels induces long-term adaptation and modifies the light-induced current. Neuron. 34 (1), 83-93 (2002).
  7. Cronin, M. A., Lieu, M. -H., Tsunoda, S. Two stages of light-dependent TRPL-channel translocation in Drosophila photoreceptors. Journal of Cell Science. 119, 2935-2944 (2006).
  8. Meyer, N., Joel-Almagor, T., Frechter, S., Minke, B., Huber, A. Subcellular translocation of the eGFP-tagged TRPL channel in Drosophila photoreceptors requires activation of the phototransduction cascade. Journal of Cell Science. 119, Pt 12 2592-2603 (2006).
  9. Oberegelsbacher, C., Schneidler, C., Voolstra, O., Cerny, A., Huber, A. The Drosophila TRPL ion channel shares a Rab-dependent translocation pathway with rhodopsin. European Journal of Cell Biology. 90 (8), 620-630 (2011).
  10. Wagner, K., Smylla, T. K., Lampe, M., Krieg, J., Huber, A. Phospholipase D and retromer promote recycling of TRPL ion channel via the endoplasmic reticulum. Traffic. , (2021).
  11. Franceschini, N., Kirschfeld, K. Les phénoménes de pseudopupille dans l'oeil compose de Drosophila. Kybernetik. 9 (5), 159-182 (1971).
  12. Pichaud, F., Desplan, C. A new visualization approach for identifying mutations that affect differentiation and organization of the Drosophila ommatidia. Development. 128 (6), 815-826 (2001).
  13. Smylla, T. K., Wagner, K., Huber, A. Application of fluorescent proteins for functional dissection of the Drosophila visual system. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), (2021).
  14. Meyer, N. Mechanisms of the light-dependent translocation of the ion channel TRPL in the photoreceptors of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer. nat. University of Karlsruhe (TH). , Karlsruhe. (2005).
  15. Meyer, N., Oberegelsbacher, C., Dürr, T. D., Schäfer, A., Huber, A. An eGFP-based genetic screen for defects in light-triggered subcelluar translocation of the Drosophila photoreceptor channel TRPL. Fly. 2 (1), 36-46 (2008).
  16. Zheng, L., Carthew, R. W. Lola regulates cell fate by antagonizing Notch induction in the Drosophila eye. Mechanisms of Development. 125 (1-2), 18-29 (2008).
  17. Hibbard, K. L., O'Tousa, J. E. A role for the cytoplasmic DEAD box helicase Dbp21E2 in rhodopsin maturation and photoreceptor viability. Journal of Neurogenetics. 26 (2), 177-188 (2012).
  18. Huang, Y., Xie, J., Wang, T. A Fluorescence-based genetic screen to study retinal degeneration in Drosophila. PloS One. 10 (12), 0144925(2015).
  19. Zhao, H., Wang, J., Wang, T. The V-ATPase V1 subunit A1 is required for rhodopsin anterograde trafficking in Drosophila. Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1640-1651 (2018).
  20. Xiong, L., et al. ER complex proteins are required for rhodopsin biosynthesis and photoreceptor survival in Drosophila and mice. Cell Death and Differentiation. 27 (2), 646-661 (2020).
  21. Zhao, H., Wang, T. PE homeostasis rebalanced through mitochondria-ER lipid exchange prevents retinal degeneration in Drosophila. PLoS Genetics. 16 (10), 1009070(2020).
  22. Cerny, A. C., et al. The GTP- and phospholipid-binding protein TTD14 regulates trafficking of the TRPL ion channel in Drosophila photoreceptor cells. PLoS Genetics. 11 (10), 1005578(2015).
  23. Richter, D. Structural and functional analyses of TRP ion channels in the photoreceptor cells of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer, nat. University of Karlsruhe (TH). , Karlsruhe. (2007).
  24. Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila. Developmental Biology. 351 (1), 128-134 (2011).
  25. Hardie, R. C., Liu, C. -H., Randall, A. S., Sengupta, S. In vivo tracking of phosphoinositides in Drosophila photoreceptors. Journal of Cell Science. 128 (23), 4328-4340 (2015).
  26. Chakrabarti, P., et al. A dPIP5K dependent pool of phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate (PIP2) is required for G-protein coupled signal transduction in Drosophila photoreceptors. PLoS Genetics. 11 (1), 1004948(2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הסעה של חלבוניםדימוי עמוק של פסאודו-אישוןמיקרוסקופיית טבילה במיםדגנרציה של פוטורצפטוריםטרנסלוקציה של TRPLסריקה גנטיתכימות פלואורסצנציה
חקר סחר בחלבוני ממברנה בתאי דרוזופילה פוטורצפטור באמצעות חלבונים המתויגים על ידי eGFP
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.