הובלת ברזל כמותית על פני שליבת העכבר In Vivo באמצעות איזוטופים של ברזל לא רדיואקטיבי

סיכום

מאמר זה מדגים כיצד להכין ולנהל ברזל איזוטופי לא-רדיואקטיבי הקשור לטרנספרין למחקרים על הובלת ברזל בהריון עכבר. כמו כן מתוארת הגישה לכימות ברזל איזוטופי בתאי fetoplacental.

תקציר

ברזל חיוני לבריאות האם והעובר במהלך ההריון, כאשר כ-1 גרם ברזל דרושים בבני אדם כדי לקיים הריון בריא. הקדשת ברזל עוברית תלויה לחלוטין בהעברת ברזל על פני השליה, והפרעות בהעברה זו עלולות להוביל לתוצאות הריון שליליות. בעכברים, מדידת שטפי הברזל על פני השליה הסתמכה באופן מסורתי על איזוטופים של ברזל רדיואקטיבי, גישה רגישה מאוד אך מעיקה. איזוטופים יציבים מברזל (^{57 Fe ו-58}Fe) מציעים חלופה לא-רדיואקטיבית לשימוש במחקרי הריון אנושי.

בתנאים פיזיולוגיים, ברזל הקשור לטרנספרין הוא הצורה השלטת של ברזל שנלקחה על ידי השליה. לפיכך, ⁵⁸Fe-transferrin הוכן והוזרק לווריד בסכרים בהריון כדי להעריך ישירות את הובלת ברזל השליה ולעקוף את ספיגת הברזל במעיים האימהיים כמשתנה מבלבל. ברזל איזוטופי היה כמותי ברקמות עובריות של השליה והעכברים על ידי ספקטרומטריית מסת פלזמה מצומדת אינדוקטיבית (ICP-MS). ניתן להשתמש בשיטות אלה גם במערכות אחרות של מודלים של בעלי חיים של פיזיולוגיה או מחלות כדי לכמת את דינמיקת הברזל in vivo .

מבוא

ברזל חיוני לתהליכים מטבוליים שונים, כולל גדילה והתפתחות, ייצור אנרגיה והובלת חמצן¹. תחזוקה של הומאוסטזיס ברזל הוא תהליך דינמי ומתואם. ברזל נספג מהמזון בתריסריון ומועבר ברחבי הגוף במחזור הדם הקשור להעברת חלבון הובלת הברזל (Tf). הוא מנוצל על ידי כל תא לתהליכים אנזימטיים, משולב בהמוגלובין באריתרוציטים מתהווים, וממוחזר מאריתרוציטים מיושנים על ידי מקרופאגים. ברזל מאוחסן בכבד כאשר עודף ואבד מהגוף באמצעות דימום או sloughing התא. כמות הברזל במחזור היא תוצאה של האיזון בין הצריכה לבין אספקת הברזל, האחרון להיות מוסדר היטב על ידי הורמון הכבד hepcidin (HAMP), הרגולטור המרכזי של ברזל הומאוסטזיס¹. הפצידין מתפקד כדי להגביל את הזמינות הביולוגית של ברזל בדם על ידי חסימה או גרימת יוביקוויטין והשפלת יצואנית הברזל פרופורטין (FPN)². הפחתה ב-FPN התפקודי מובילה לירידה בספיגת ברזל בתזונה, לפירוק ברזל בכבד ולירידה במיחזור ברזל ממקרופאגים¹.

הפצידין מווסת על ידי מצב ברזל, דלקת, דחף אריתרופויטי והריון (נבדק ב ^-3). בהתחשב בכך שהומאוסטזיס ברזל הוא דינמי מאוד, חשוב להבין ולמדוד את סך מאגר הברזל ואת התפלגות הברזל ותחלופתו. מחקרים בבעלי חיים הסתמכו באופן מסורתי על איזוטופים של ברזל רדיואקטיבי, גישה רגישה מאוד אך מעיקה למדידת הדינמיקה של ברזל. עם זאת, במחקרים עדכניים יותר, כולל המחקר המוצג כאן⁴, איזוטופים של ברזל לא רדיואקטיבי ויציב (⁵⁸Fe) משמשים למדידת הובלת ברזל במהלך ההריון 5,6,7,8,9^. איזוטופים יציבים הם כלים חשובים לחקר חילוף החומרים של חומרים מזינים (נבדקו ^ב-10). השימוש באיזוטופים יציבים של ברזל במחקרים בבני אדם הראה כי 1) ספיגת הברזל עולה לקראת סוף ההיריון^5,6, ii) העברת ברזל תזונתי לעובר תלויה במצב הברזל האימהי⁷, 3) ברזל heme שנבלע אימהי משולב בקלות רבה יותר על ידי העובר מאשר ברזל nonheme 8, ו- 4) העברת ברזל לעובר מתואמת שלילית עם רמות hepcidin אימהי ^{8, 9}. ניסויים אלה מדדו איזוטופים של ברזל בסרה או שילובם ב-RBCs; עם זאת, מדידה של ברזל המשולב ב-RBCs בלבד עלולה לזלזל בספיגת ברזל^{אמיתית 9}. במחקר הנוכחי, הן heme והן ברזל nonheme נמדדים ברקמות.

במהלך ההריון, ברזל נדרש כדי לתמוך בהרחבת נפח תאי הדם האדומים האימהיים ולהעברה על פני השליה כדי לתמוך בגדילה ובהתפתחות של העובר¹¹. הקדשת ברזל עוברית תלויה לחלוטין בהובלת ברזל על פני השליה. במהלך הריון¹² אנושי ומכרסם ^4,13, רמות ההפצידין יורדות באופן דרמטי^, מה שמגדיל את זמינות ברזל הפלזמה להעברה לעובר.

היסודות של הובלת ברזל שליה אופיינו בתחילה בשנות החמישים וה -70 באמצעות עקבות רדיואקטיביים (⁵⁹Fe ו ⁵⁵Fe). מחקרים אלה קבעו כי שינוע הברזל על פני השליה הוא^{חד-כיווני 14,15} וכי טרנספרין דיפרי הוא מקור עיקרי לברזל עבור השליה והעובר^16,17. ההבנה הנוכחית של הובלת ברזל שליה שלמה יותר, אם כי כמה מובילי ברזל מרכזיים ומנגנוני ויסות עדיין לא ידועים. מודלים של עכברים היו חיוניים להבנת ויסות ברזל ותעבורה¹⁸ מכיוון שהמובילים והמנגנונים המרכזיים דומים להפליא. הן השליה האנושית והן השליה העכברית הן המוכוריאליות, כלומר, הדם האימהי נמצא במגע ישיר עם כוריון העובר¹⁹. עם זאת, ישנם כמה הבדלים מבניים בולטים.

ה- syncytiotrophoblast היא שכבת תאי השליה המפרידה בין מחזור הדם האימהי והעוברי ומעבירה באופן פעיל ברזל וחומרים מזינים אחרים²⁰. בבני אדם, הסינקטיוטרופובלסט הוא שכבה אחת של תאים מתמזגים. לעומת זאת, שליית העכבר מורכבת משתי שכבות סינכטיוטרופובלסט²¹, Syn-I ו- Syn-II. עם זאת, צמתי מרווחים בממשק של Syn-I ו- Syn-II מאפשרים דיפוזיה של חומרים מזינים בין שכבות^22,23. לפיכך, שכבות אלה מתפקדות כשכבה סינסיטיאלית אחת הדומה לסינכטיוטרופובלסט האנושי. קווי דמיון והבדלים נוספים בין שליה אנושית לעכבר נבדקים על ידי Rossant ו- Cross²¹. הובלת ברזל שליה מופעלת על ידי קשירת ברזל-Tf מדם אימהי לקולטן טרנספרין (TfR1) הממוקם בצד האפיקלי של הסינכטיוטרופובלסט²⁴. אינטראקציה זו גורמת להפנמה של ברזל-Tf/TfR1 באמצעות אנדוציטוזה בתיווך קלתרין²⁵. לאחר מכן הברזל משתחרר מ-Tf באנדוזום²⁶ החומצי, מצטמצם לברזל ברזלי על ידי פרירדוקטאז שלא נקבע, ומיוצא מהאנדוזום לציטופלסמה על ידי טרנספורטר שטרם נקבע. כיצד ברזל מלווה בתוך syncytiotrophoblast גם נשאר לתאר. ברזל מועבר בסופו של דבר לצד העוברי על ידי יצואן הברזל, FPN, הממוקם על פני השטח הבסיסיים או העובריים של הסינסיטיוטרופובלסט (נבדק ב^-27).

כדי להבין כיצד ויסות פיזיולוגי ופתולוגי של TfR1, FPN והפצידין משפיע על הובלת ברזל שליה, נעשה שימוש באיזוטופים של ברזל יציב כדי לבצע הובלת ברזל כמותית ממחזור הדם האימהי אל השליה והעובר in vivo⁴. מאמר זה מציג את השיטות להכנה ולמתן איזוטופי של ברזל-טרנספרין לעכברות הרות, עיבוד רקמות עבור ICP-MS וחישוב ריכוזי הברזל ברקמות. ניתן להתאים את השימוש באיזוטופים יציבים של ברזל in vivo כדי לחקור ויסות ופיזור ברזל במודלים שונים של בעלי חיים כדי לחקור ויסות ברזל פיזיולוגי ופתולוגי.

פרוטוקול

כל הפרוטוקולים והנהלים הניסיוניים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס.

1. הכנת ⁵⁸Fe-Tf

הערה: הפרוטוקול משתמש ב- ⁵⁸Fe; עם זאת, ניתן להשתמש בפרוטוקול זהה עבור ⁵⁷Fe. ניתן להשתמש בכל אחד מהאיזוטופים ולהשליך אותם ככימיקל ברזל סטנדרטי ללא אמצעי זהירות נוספים.

1. יש להמיס 58 Fe ב-12 N HCl ב-50 μL של HCl/מ"ג של ⁵⁸Fe.
   1. הוסיפו HCl למתכת בבקבוקון הזכוכית שסופק על ידי הספק, והחליפו את המכסה באופן רופף. כדי להמיס את הברזל, יש לחמם את תמיסת ⁵⁸Fe/HCl ל-60°C למשך שעה אחת. אם עדיין לא מומס, השאירו את התמיסה למשך הלילה בטמפרטורת החדר במכסה האדים כדי להתמוסס.
      הערה: תמיסת ⁵⁸Fe/HCl מומסת בצבע כתום-צהבהב.
      Fe₃O_4(s) + 8HCl(aq) → Fe(^II)Cl 2(aq) + 2Fe(III)Cl_3(aq) + 4H₂ O
2. חמצנו את כל Fe(^II)Cl₂ הנותר כדי ליצור את תמיסת Fe^(III)Cl₃ .
   1. חממו את תמיסת ⁵⁸Fe/HCl ל-60°C כשהמכסה כבוי כדי להקל על החמצון.
   2. יש להוסיף 1 μL של 35% H2 O₂ לכל 50 μL של תמיסת ⁵⁸Fe/HCl כדי להקל עוד יותר על החמצון.
      Fe(^II)Cl_2(aq) + O 2 + 4HCl → 4Fe(^III)Cl_3(aq) + 2H₂ O
3. הכן את תמיסת ברזל כלוריד (⁵⁸Fe^(III)Cl₃).
   1. השאירו את תמיסת הברזל כלוריד במכסה המנוע בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס כשהמכסה כבוי כדי לאדות את הדגימה.
      הערה: האידוי עשוי להימשך בין יום אחד למספר ימים.
   2. צור מחדש 58 Fe(III)Cl 3 עד 100 mM עם Ultrapure H 2 O, וחשב את כמות האולטרה-טהור H 2 O הנדרשת בהתבסס על משקל המתכת הראשוני המשמש בשלב 1.1 (משקל מולקולרי של ⁵⁸ Fe^(III)Cl₃ הוא 162.2).
4. הכן 58 Fe(III)-nitrilotriacetate (NTA) על ידי דגירה ⁵⁸Fe^(III)Cl 3 עם NTA ביחס טוחן 1:5 בנוכחות 20 mM NaHCO₃.
   1. הכן 500 mM NTA ב 1 N NaOH.
   2. הכן 5x מאגר טעינה טרנספרין (0.5 M HEPES, pH 7.5; 0.75 M NaCl).
   3. הכן 1 M NaHCO₃ ב-H₂O אולטרה-טהור.
   4. לצינור חרוטי של 15 מ"ל, הוסף 150 μL_{של 100} mM 58 Fe(^III)Cl 3 פתרון (משלב 1.3.2), 150 μL של 500 mM NTA מוכן ב 1 N NaOH, 480 μL של ultrapure H₂O, 200 μL של ^5xמאגר טעינה טרנספרין, ו 20 μL_{של 1 M} NaHCO 3 פתרון.
   5. דוגרים את התערובת במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
5. טען apo-Tf עם 58 Fe^(III)-NTA כדי ליצור ⁵⁸Fe-Tf.
   הערה: פרוטוקול זה הותאם ממקארתי וקוסמן²⁸.
   1. יש להמיס 500 מ"ג של apo-Tf ב-4 מ"ל של מאגר טעינת Tf אחד.
   2. לצינור החרוטי של 15 מ"ל בשלב 1.4.4 המכיל 1 מ"ל מתמיסת ⁵⁸Fe^(III)-NTA, הוסף 4 מ"ל של תמיסת apo-Tf.
      הערה: זהו יחס טוחן 3:1 של ⁵⁸Fe-NTA עם apo-Tf. כל Tf מכיל 2 אתרי קשירה Fe; עודף ⁵⁸Fe-NTA נוסף כדי להבטיח כי Tf היה טעון במלואו.
   3. כדי לאפשר טעינה מקסימלית של ⁵⁸Fe-NTA על apo-Tf, בדוק שהפתרון נמצא ב- pH 7.5, והתאם את ה- pH, במידת הצורך, עם NaHCO₃ או HCl.
   4. דגירה במשך 2.5 שעות בטמפרטורת החדר.
6. הסר עודפים לא מאוגדים ⁵⁸Fe^(III)-NTA ושחרר את NTA.
   1. מעבירים את תמיסת 58 Fe-Tf לעמוד חיתוך במשקל מולקולרי (חיתוך של 30 kDa) וצנטריפוגה ב-2,500 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
   2. שטפו את העמוד ב-10 מ"ל של חיץ העמסת טרנספרין 1x וצנטריפוגה ב-2,500 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על הכביסה והצנטריפוגה, בצע שטיפה מלוחה עם 10 מ"ל של מלח, וצנטריפוגה ב 2,500 × גרם במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
7. חישוב הריכוז של ⁵⁸Fe-Tf.
   הערה: בשל תוספת של ^{עודף 58}Fe בשלב 1.5.2, נניח שכל הטרנספרין הוא דיפרי. כמו 500 מ"ג של apo-Tf שימש, ~ 500 מ"ג ⁵⁸Fe-Tf הופק בשלב 1.5.4.
   1. מדוד את הנפח שהתאושש מהצנטריפוגה לאחר שטיפת המלח בשלב 1.6.2.
   2. חלקו 500 מ"ג בנפח שהתאושש כדי לקבוע את הריכוז (במ"ג/מ"ל) של תמיסת ^{Fe-Tf 58}.
8. לעקר את תמיסת ^{Fe-Tf 58}באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר; יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.
   הערה: ⁵⁸תמיסת Fe-Tf שימשה בין שבוע לארבעה שבועות לאחר ההכנה.

2. הגדרת הריונות עכבר מתוזמנים

1. יש להשתמש בעכברים בני 6 עד 8 שבועות. יש להניח את בעלי החיים על תזונה דלת ברזל (ברזל 4 ppm) או צ'או סטנדרטי (ברזל 185 ppm) במשך שבועיים לפני ההזדווגות ולשמור על בעלי חיים בתזונה המתאימה לאורך כל ההריון.
2. אפשרות 01: אשר הריון לפי עלייה במשקל ב- E7.5.
   1. להקים כלובי רבייה מרובים. עבור כל כלוב, לשלב 2 נקבות עם זכר אחד לילה; היום שלמחרת שבו בעלי חיים מופרדים נחשב יום עוברי (E)0.5. שקלו את הנקבות ב-E7.5 כדי לקבוע אם בהריון. להזדווג שוב עם נקבות שלא עלו במשקל.
      הערה: ב- WT C57BL/6, עלייה במשקל של 1 גרם ב- E7.5 היא אינדיקטור טוב להריון. שיטה זו מבטיחה כי ההשתלה התרחשה במסגרת זמן מסוימת של 16 שעות, ומאפשרת טיפול סינכרוני בכל בעלי החיים שנכנסו להריון באותה תקופת הזדווגות.
3. אפשרות 02: לאשר הריון על ידי בדיקות תקע.
   1. שלבו 2 נקבות עם זכר אחד ובצעו בדיקות תקע יומיות כדי לקבוע אם התרחשה התלקחות.
      הערה: שיטה זו עלולה לגרום להריונות מדשדשים, ונוכחות של תקע אינה מבטיחה הריון.

3. מתן ⁵⁸Fe-Tf לווריד לעכברות הרות E17.5

1. הכן ⁵⁸Fe-Tf משלב 1.8 להזרקה.
   1. הכן ⁵⁸תמיסת Fe-Tf ב 35 מ"ג / מ"ל במלח; להזריק 100 μL לכל עכבר.
   2. מלאו מזרק אינסולין ב-100 מיקרון מתוך ^{תמיסת Fe-Tf 58}.
      הערה: כל מנה מכילה 3.5 מ"ג של Fe-Tf ^{אנושי 58}Fe-Tf (5 מיקרוגרם מתוך ⁵⁸Fe).
2. הרדמת עכבר בהריון באמצעות איזופלורן.
   1. השתמש בווסת איזופלורן עם תא.
   2. השתמש בהגדרות הבאות: 5% איזופלורן, 2 ליטר למ"ל של O 2,₂ דקות.
   3. ודא שהעכבר מורדם על ידי חיפוש חוסר תגובה לצביטת בוהן.
   4. יש למרוח חומר סיכה לעיניים על פני השטח של העין ולהניח את העכבר על כרית חימום.
3. לאט ובזהירות להזריק את תמיסת ⁵⁸Fe-Tf לתוך הסינוס הרטרו-מסלולי.
4. אפשר לעכבר להתאושש מהרדמה; אין להשאיר את בעל החיים ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על משענת החזה.
5. שש שעות לאחר ההזרקה, להרדים נקבות הרות E17.5 על ידי מנת יתר איזופלורן.
   1. בצע ניקור לב כדי exsanguinate העכבר כצורה של המתת חסד משנית.
   2. הצמידו את כפות הרגליים למטה עם מחטים לייצוב.
6. לאסוף את השליה ואת כבדי העובר.
   1. באמצעות מלקחיים סטריליים ומספריים דיסקציה, להסיר בזהירות את הרחם מן העכבר ההרה. חתכו יחידת שליה עוברית שליה, הכוללת עובר יחיד ושליה בשק מי השפיר המוקף בחלק מהרחם.
   2. בזהירות לחתוך דרך הרחם ואת שק מי השפיר מבלי להפריע לעובר ואת השליה.
   3. מקלפים בחזרה את שק מי השפיר ומסירים את העובר והשליה.
   4. חותכים את חבל הטבור.
   5. כתם את העובר ואת השליה על ניגוב משימה נקייה כדי להסיר את עודף מי השפיר.
   6. רשום את המשקולות של השליה כולה.
   7. חותכים כל שליה לשניים בעזרת סכין גילוח, מניחים כל חצי בצינור של 2.0 מ"ל, ומקפיאים בחנקן נוזלי.
      הערה: מכיוון ^ש-58Fe אינו דורש אמצעי זהירות מיוחדים לטיפול וסילוק, ניתן להשתמש במחצית אחת של השליה למדידת ⁵⁸Fe ובמחצית השנייה לכל ניתוח אחר, כולל כמות של קולטן טרנספרין (TFR1) וביטוי פרופורטין (FPN) על ידי כתם מערבי ו- qPCR.
   8. כדי לאסוף כבדי עובר, הקריבו את העובר: השתמשו בסכין גילוח כדי לערוף את העובר במהירות.
      הערה: ב- E17.5, יש להרדים את כל העוברים ברחם בנפרד, גם אם הם אינם משמשים במחקר.
   9. הצמידו את העובר לייצוב, והותירו את הבטן חשופה.
   10. באמצעות מספריים לנתיחה, מבצעים חתך קטן במקום בו מחובר חבל הטבור, מכניסים קצה אחד של מספריים הדיסקציה לתוך החתך, ומבצעים חתך מישורי חציוני לכיוון מישור הקורונה כ-1/4 אינץ'. לאחר מכן, בצע חיתוכי מישור רוחביים כדי לחשוף את הכבד העוברי.
   11. השתמש מלקחיים כדי להסיר את הכבד העוברי.
   12. רשום את המשקלים של כל כבדי העובר.
   13. מניחים את כל כבדי העובר בצינורות של 2 מ"ל ומקפיאים אותם בחנקן נוזלי.
       הערה: לחלופין, ניתן להשתמש רק בחלק מכבד העובר למדידת ⁵⁸Fe אם יש צורך בניתוחים נוספים. שימוש בצינורות 2.0 מ"ל מאפשר הומוגניזציה טובה יותר של רקמות מאשר צינורות 1.5 מ"ל.
7. לאחסן את הרקמות ללא הגבלת זמן ב -80 מעלות צלזיוס.

4. רקמות תהליך לניתוח ברזל כמותי על ידי ICP-MS

1. מעבדים את השליה ואת כבדי העובר לכמות של ברזל nonheme.
   1. הפשרת חצאי שליה וכבד עוברי שלם, ושקילת חצאי שליה (ראה שלב 3.6.12 לרישום משקל כבד עוברי).
   2. הוסף 400 μL של תמיסת משקעי חלבון (0.53 N HCl, 5.3% TCA).
   3. הומוגניזציה של הרקמה באמצעות הומוגנייזר חשמלי.
   4. דגירה של הדגימות ב 100 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.
   5. מצננים את הדגימות במים בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.
   6. פתח את הכובעים כדי לשחרר לחץ, ולאחר מכן סגור שוב את הצינורות.
   7. צנטריפוגה ב-17,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לפסולת רקמות.
   8. העבירו בזהירות את הסופרנטנט לצינור חדש המסומן.
   9. שלח דוגמאות לניתוח ICP-MS.
2. מעבדים את השליה ואת כבדי העובר לכמות של ברזל הם.
   הערה: לאחר מיצוי של ברזל nonheme בשלב 1, הברזל שנותר בגלולה הוא בעיקר heme.
   1. רשום את המשקל של כל כדור משלב 4.1.7.
   2. לעכל את הכדורים ב-10 מ"ל של 70% HNO₃ מרוכזים בתוספת 1 מ"ל של 30% H 2 O₂
      הערה: התייעץ עם הליבה או המרכז של ICP-MS כדי למטב את עוצמת הקול של HNO₃ עבור מחקרים ספציפיים; הנפח יהיה תלוי בחלקו במשקל המדגם.
   3. מחממים את הדגימות ל-200 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
   4. שלח את הדגימות לניתוח ICP-MS.
      הערה: אם אין צורך בהבחנה בין מקורות ברזל heme ו- nonheme ונמדד רק ברזל כולל, ניתן לעכל רקמה שלמה ב- HNO₃ כצעד ראשון.

5. ניתוח נתונים

הערה: הנתונים מ-ICP-MS סופקו כריכוזים ^{של 56 Fe ו-58}Fe ב-ng/mL או mg, ppb (טבלה 1). ⁵⁶ Fe הוא איזוטופ הברזל הנפוץ ביותר בטבע, ומדידתו משקפת הצטברות ברזל בשליה/עובר לאורך כל ההריון, בעוד שמדידת ⁵⁸Fe משקפת ברזל שהועבר במהלך 6 שעות לאחר ההזרקה.

1. הפחת את השפע הטבעי של 58 Fe (0.28% מסך Fe) מהערכים הנמדדים ^{של 58}Fe.
2. חישוב סה"כ ^{nonheme 58}Fe.
   1. חשב את סך כל הברזל הלא-המי בכבד העובר (ng) על-ידי הכפלת ריכוז הברזל (ng/mL) המחושב בשלב 5.1 בנפח (mL) במהלך העיבוד הראשוני בשלב 4.1.2 כדי להעריך את סך ^{הכל 58}Fe.
   2. חשב את כמות הברזל בכל השליה על ידי לקיחת המשקל הכולל של השליה הנמדדת בשלב 3.6.6 וחלוקתה במשקל השליה המעובדת בשלב 4.1.1. הכפל ערך זה בסך כל הברזל nonheme (ng) המחושב בשלב 5.2.1 כדי לקבל את התוכן הכולל nonheme ⁵⁸Fe של השליה.
3. חישוב סה"כ ^{heme 58}Fe.
   1. יש לחשב את סך ^{ה-heme 58}Fe על ידי הכפלת ריכוז הברזל (ng/mg) המחושב בשלב 5.1 במשקל הכדור (במ"ג) הנמדד בשלב 4.2.1.
   2. לאחר מכן, חלקו את המשקל הכולל של השליה שנמדד בשלב 3.5.1 במשקל כדור השליה שנמדד בשלב 4.2.1. הכפל ערך זה בסך כל ברזל heme (ng) המחושב בשלב 5.3.1 כדי לקבל תוכן heme ⁵⁸Fe הכולל של השליה.
4. סכמו את הערכים המחושבים nonheme ו- ^{heme 58}Fe כדי לקבוע את תכולת הברזל הכוללת עבור כל רקמה.

איור 1: סיכום חזותי של שלבים בפרוטוקול . (A) הכנת ⁵⁸Fe-transferrin. (ב) ניהול In vivo של ⁵⁸Fe-transferrin. (ג) איסוף ואחסון רקמות. (D) עיבוד השליה וכבד העובר לכמות של מיני מתכות על ידי ICP-MS. קיצורים: Fe = ברזל; NTA = חומצה ניטרילוטריאצטית; Tf = טרנספרין; PPS = תמיסת משקעי חלבון; Sup = סופרנטנט; TCA = חומצה טריכלורואצטית; ICP-MS = ספקטרומטריית מסת פלזמה מצומדת אינדוקטיבית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

תוצאות

מחקר מוקדם יותר שהשתמש באיזוטופים יציבים של ברזל למדידת הובלת ברזל הראה כי מחסור אימהי בברזל הביא לירידה בוויסות של יצואנית ברזל השליה, FPN⁴. FPN היא יצואנית הברזל היחידה הידועה ליונקים, והיעדר FPN במהלך הפיתוח גורם למוות עוברי לפני E9.5²⁹. כדי לקבוע אם הירידה שנצפתה בביטוי FPN תורגמה פונקציונלית לירידה בהובלת ברזל השליה, ⁵⁸Fe-Tf הוזרק תוך ורידי לסכרים בהריון, וברזל בשליה ובעובר כומת בנוכחות מחסור בברזל אימהי.

כדי להבין כיצד הובלת ברזל...

דיון

ברזל חשוב לתהליכים ביולוגיים רבים, ותנועתו והפצתו בגוף הן דינמיות ומווסתות מאוד. איזוטופים יציבים מברזל מספקים חלופה עקבית ונוחה לאיזוטופים רדיואקטיביים להערכת הדינמיקה של הומאוסטזיס ברזל. שלב קריטי בפרוטוקול הוא מעקב אחר כל המשקלים והנפחים של הרקמות. ברזל הוא יסוד ולכן לא ניתן לסנתז אותו או לפרק אותו. לכן, אם כל המשקולות והנפחים נרשמים בקפידה, ניתן להסביר את כל הברזל בתוך המערכת על ידי חישוב. כפי שתואר, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להבחין בין מקורות ברזל heme ו nonheme. עם זאת, אם הבחנה זו בין צורות ברזל אינה הכרחית ורק סך ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
58Fe-ברזל מתכת	Trace Sciences International	Fe-58
Amicon מסנן צנטריפוגלי אולטרה-15, צינורות צנטריפוגה 30 kDa	Millipore Sigma	UFC903024
, 15 מ"ל	Fisher Scientific	14-959-49B
, 50 מ"ל	Millipore Sigma	CLS430829
צנטריפוגה, Sorvall Legend Micro 17 מיקרוצנטריפוגה	פישר סיינטיפיק	75002432
צנטריפוגה, Sorvall Legend RT
מגבים עדינים למשימות	פישר סיינטיפיק	06-666
דיאטה: חסר ברזל (4 חל"מ ברזל)	Envigo Teklad	TD.80396
דיאטה: צ'או סטנדרטי (ברזל 185 חל"מ)	PicoLab	5053
חיתוך מספריים עם קצה חיתוך 30 מ"מ	VWR	25870-002
מלקחיים באורך 4-1/2 אינץ'	McKesson	157-469
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
הומוגנייזר, Bio-Gen PRO200	PROScientific	01-01200
אפו-טרנספרין אנושי (apo-Tf)	Celliance	4452-01	כבר לא זמין, חלופה: Millipore 616419
חומצה הידרוכלורית (HClפישר	סיינטיפיק	A144S-500
מי חמצן (H<תת>2O2), תמיסה של 35 wt.% במים	Cole-Parmer	EW-88216-36
מזרקי אינסולין, BD Lo-Dose U-100	Fisher Scientific	14-826-79
Isoflurane	VETone	502017
Isoflurane vaporizor	Summit פתרונות הרדמה
בלוק חום מתכת	מיקרו פישר סיינטיפיק
עם מכסה בורג שטוח	VWR	16466-064
צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל שמירה נמוכה	פישר סיינטיפיק	02-681-320
צינורות מיקרוצנטריפוגה 2.0 מ"ל שמירה נמוכה	פישר סיינטיפיק	02-681-321
יחידת מסנן מזרק Millex-GP, 0.22 ומיקרו; m, polyethersulfone, 33 מ"מ,	Millipore Sigma	SLGP033RS
חומצה ניטרילוטריאצטית (NTA)	Sigma	72560-100G
מחט 25 גרם x 5/8 אינץ' שימוש כללי היפודרמי	Fisher Scientific	14-826AA
רצועות pH, פלסטיק pH5.0-9.0	Fisher Scientific	13-640-519
סכיני גילוח 0.22 מ"מ	VWR	55411-050
משקל (גרם)	מטלר טולדו	PB1502-S
סולם (מ"ג)	Mettler Toledo	Balance XS204
נתרן ביקרבונט (NaHCO3)	Sigma	S5761-500G
נתרן כלורי (NaCl)	Fisher Scientific	S671-3
נתרן הידרוקסיד (NaOH)	Fisher Scientific	SS266-1
מזרק סטרילי, קצה החלקה (1 מ"ל)	Fisher Scientific	309659
חומצה טריכלורואצטית (TCA)	Fisher Scientific	A322-500
Software
ImageLab	Bio-Rad
SigmaPlot	Systat