הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הקרנה משולבת של ספריית shRNA לזיהוי גורמים המווסתים פנוטיפ עמידות לתרופות

2.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63383

⸱

17 ביוני 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Haematology, Christian Medical College, 2Department of Biotechnology, Thiruvalluvar University, 3Centre for Stem Cell Research, Christian Medical College

במאמר זה

סיכום

בדיקת הפרעות RNA בתפוקה גבוהה (RNAi) באמצעות מאגר של shRNA לנטי-ויראליים יכולה להיות כלי לאיתור מטרות קטלניות סינתטיות רלוונטיות מבחינה טיפולית בממאירות. אנו מספקים גישת סינון shRNA משולבת כדי לחקור את האפקטים האפיגנטיים בלוקמיה מיאלואידית חריפה (AML).

תקציר

הבנת מנגנוני המניע הרלוונטיים מבחינה קלינית של עמידות נרכשת לכימותרפיה היא חיונית להבהרת דרכים לעקוף את העמידות ולשפר את ההישרדות בחולים עם לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML). לחלק קטן מהתאים הלוקמיים ששורדים את הכימותרפיה יש מצב אפיגנטי מפויס לסבול עלבון כימותרפי. חשיפה נוספת לכימותרפיה מאפשרת לתאים אלה המתמידים בתרופות להגיע למצב אפיגנטי קבוע, מה שמוביל לביטוי גנים משתנה, וכתוצאה מכך להתרבותן של אוכלוסיות עמידות לתרופות אלה ובסופו של דבר למחלה חוזרת או עקשן. לכן, זיהוי אפנון אפיגנטי המחייב הישרדות של תאים לוקמיים עמידים לתרופות הוא קריטי. אנו מפרטים פרוטוקול לזיהוי מודולטורים אפיגנטיים המתווכים את ההתנגדות לציטרבין האנלוגי הנוקלאוזידי (AraC) באמצעות סינון ספריית shRNA משולבת בקו תאי AML עמיד לציטרבין שנרכשו. הספרייה מורכבת מ-5,485 מבנים של shRNA המכוונים ל-407 גורמים אפיגנטיים אנושיים, מה שמאפשר סינון גורמים אפיגנטיים בתפוקה גבוהה.

מבוא

אפשרויות טיפוליות בלוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) נותרו ללא שינוי במשך כמעט חמשת העשורים האחרונים, כאשר ציטרבין (AraC) ואנתרציקלין הם אבן הפינה לטיפול במחלה. אחד האתגרים להצלחת הטיפול ב-AML הוא עמידותם של תאי גזע לוקמיים לכימותרפיה, מה שמוביל להישנות המחלה 1,2. ויסות אפיגנטי ממלא תפקיד חיוני בפתוגנזה של סרטן ובעמידות לתרופות, ומספר גורמים אפיגנטיים התגלו כמטרות טיפוליות מבטיחות 3,4,5. מנגנוני ויסות אפיגנטיים משפיעים על התפשטות והישרדות תחת חשיפה מתמשכת לתרופות כימותרפיות. מחקרים בממאירות שאינה המטולוגית דיווחו כי חלק קטן מהתאים המתגברים על השפעת התרופה עוברים שינויים אפיגנטיים שונים, וכתוצאה מכך הישרדותם של תאים אלה 6,7. עם זאת, תפקידם של גורמים אפיגנטיים בתיווך עמידות נרכשת לציטרבין ב-AML לא נחקר.

סינון בתפוקה גבוהה הוא גישה לגילוי תרופות שצברה חשיבות עולמית עם הזמן והפכה לשיטה סטנדרטית בהיבטים שונים לזיהוי מטרות פוטנציאליות במנגנונים תאיים, ליצירת פרופיל מסלולים וברמה המולקולרית 8,9. מושג הקטלניות הסינתטית כולל את האינטראקציה בין שני גנים שבהם ההפרעה של כל אחד מהגנים לבדה היא בת קיימא, אך של שני הגנים גורמת בו זמנית לאובדן הכדאיות10. ניצול קטלניות סינתטית בטיפול בסרטן יכול לסייע בזיהוי ואפיון מכניסטי של אינטראקציות גנטיות סינתטיות קטלניות חזקות11. אימצנו גישה קומבינטורית של בדיקת shRNA בתפוקה גבוהה עם קטלניות סינתטית כדי לזהות את הגורמים האפיגנטיים האחראים לעמידות ציטראבינית נרכשת ב-AML.

לוקמיה חריפה המונעת על ידי טרנסלוקציה כרומוזומלית של גן הלוקמיה המעורבת (MLL או KMT2A) ידועה כקשורה להישרדות לקויה בחולים. התוצרים הכימריים המתקבלים של סידור מחדש של גנים מסוג MLL , כלומר חלבוני היתוך MLL (MLL-FPs), יכולים להפוך תאי גזע/אב המטופויאטיים (HSPCs) לפיצוצים לוקמיים עם מעורבות של גורמים אפיגנטיים מרובים. הרגולטורים האפיגנטיים הללו מהווים רשת מורכבת המכתיבה את תחזוקת תוכנית הלוקמיה, ולכן עלולים ליצור מטרות טיפוליות פוטנציאליות. בהקשר זה, השתמשנו בקו התאים MV4-11 (המכיל את גן ההיתוך MLL MLL-AF4 עם מוטציית FLT3-ITD; המכונה MV4-11 P) כדי לפתח את קו התאים העמיד לציטראבין שנרכש, המכונה MV4-11 AraC R. קו התאים נחשף למינונים הולכים וגדלים של ציטרבין עם החלמה לסירוגין מהטיפול התרופתי, הידוע כחופשת סמים. הריכוז המעכב החצי-מקסימלי (IC50) הוערך על ידי בדיקת ציטוטוקסיות במבחנה .

השתמשנו בספריית ה-shRNA האפיגנטית המאוגנת (ראו טבלת חומרים) המונעת על ידי מקדם hEF1a עם עמוד שדרה pZIP lentiviral. ספריה זו כוללת shRNA המכוונים ל-407 גורמים אפיגנטיים. לכל גורם יש 5-24 shRNA, עם סך של 5,485 shRNA, כולל חמישה shRNA בקרה שאינם ממוקדים. פיגום ה-miR-30 "UltrmiR" שעבר שינוי עבר אופטימיזציה לביוגנזה של shRNA ראשוני יעיל ולביטוי12,13.

קווי המתאר של הניסוי הזה מתוארים באיור 1A. הפרוטוקול הנוכחי מתמקד בסינון RNAi באמצעות ספריית shRNA של גורמים אפיגנטיים בקו התאים MV4-11 AraC R (איור 1B), קו תאי השעיה. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לסנן כל ספרייה ממוקדת בכל קו תאים עמיד לתרופות לפי בחירתו. יש לציין כי פרוטוקול ההתמרה יהיה שונה עבור תאים חסידיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

עקוב אחר הנחיות הוועדה המוסדית לבטיחות ביולוגית (IBSC) והשתמש במתקן המתאים לטיפול בנגיף הלנטי (BSL-2). כוח אדם צריך להיות מאומן כראוי בטיפול וסילוק של lentivirus. פרוטוקול זה עוקב אחר הנחיות הבטיחות הביולוגית של המכללה הרפואית הנוצרית, ולורה.

1. בחירת המקדם החזק ביותר להשגת ביטוי מתמשך וממושך של ה- shRNA

הערה: חיוני לבצע ניסוי התמרה באמצעות וקטורים לנטי-ויראליים עם מקדמים שונים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים כדי לזהות את המקדם המספק ביטוי יציב וארוך טווח של shRNA בקו התאים שנבחר לניסוי. המקדמים הנפוצים ביותר למטרה זו הם hEF1α (גורם התארכות אנושי 1α), hCMV (ציטומגלווירוס אנושי) ומקדמי SSFV (נגיף יוצר מיקוד בטחול) המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) (איור 2A).

  1. בצע את ספירת התאים באמצעות שיטת ההדרה הכחולה של טריפאן. השעו את תאי MV4-11 AraC R במדיום RPMI של 10% (RPMI עם 10% FBS בתוספת 100 פניצילין U/mL ו-100 סטרפטומיצין U/mL) המכילים 8 מיקרוגרם/מ"ל פוליברן. זרע 1 x 106 תאים ב 1.5 מ"ל של בינוני / באר של צלחת שש באר במשולש.
  2. הוסיפו כמויות שונות של לנטי-וירוסים מרוכזים (לדוגמה, 10 μL, 20 μL ו-40 μL, תלוי בטיטר של נגיפי הלנטי-וירוסים) לכל באר. סובבו בעדינות את הצלחת כדי לערבב את התכולה.
  3. בצע ספינפקציה על ידי צנטריפוגה ב 920 x g ב 37 °C במשך 90 דקות.
  4. מיד לדגום את הצלחות בחממת CO2 (5% CO2 ב 37 מעלות צלזיוס).
  5. שימו לב לביטוי ה-GFP לאחר 48 שעות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להבטיח התמרה מוצלחת.
  6. כימת את ביטוי ה-GFP על ידי ציטומטריית זרימה לאחר 72 שעות כדי להעריך את יעילות ההעתקה.
  7. תרבית את התאים במשך שבועיים בסך הכל ועקוב אחר ביטוי ה- GFP מעת לעת על ידי ציטומטריה של זרימה. הירידה בביטוי GFP הנמדדת על ידי עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת ואחוז תאי ה-GFP+ מצביעה על השתקת מקדם.
  8. מיין את תאי ה-GFP+ ביום ה-10 ותרבית את התאים במשך שבוע לאחר המיון. בדוק את הביטוי GFP מעת לעת במהלך התרבות.
  9. השתמש בתאים הלא מתורגמים כדי להגדיר את השער. אוכלוסייה שמעבר לסולם 1 x 101 לכיוון ימין על ציר ה-x נחשבת לאוכלוסייה חיובית עבור GFP.
  10. בחר את המקדם המציג ביטוי מתמשך של GFP בתרבית הממושכת של התאים.

2. הכנת ספריית shRNA של גורם אפיגנטי אנושי לנטיוויראלי מרוכז

  1. תרבית 293T תאים (במספר מעבר נמוך עם קצב התפשטות טוב) בשלוש מנות תרבית תאים של 10 ס"מ עם 8 מ"ל של 10 מ"ל בינוני DMEM (DMEM עם 10% FBS המכיל 100 פניצילין U/ml ו-100 U/ml סטרפטומיצין) בכל צלחת.
  2. ברגע שהתאים מגיעים למפגש של 60%, החליפו את המדיום במדיום שלם.
  3. הכינו את תערובת הטרנספקציה (כמתואר בטבלה 1) המכילה מדיום ללא סרום, אריזות לנטי-ויראליות (psPAX2) ופלסמיד מעטפת (pMD2.G), פלסמידי ספרייה מרוכזים, ולבסוף, את ריאגנט הטרנספקציה.
  4. הקש על התערובת כדי לערבב אותה היטב ולדגום בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
  5. מוסיפים את תערובת הטרנספקציה לתאי 293T ומערבבים בעדינות על ידי מערבולת הצלחות. דגירה של הצלחות בחממת CO2 (5% CO2 ב-37 מעלות צלזיוס). שנה את המדיום לאחר 24 שעות.
  6. לאחר 48 שעות, בדקו אם יש ביטוי GFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להבטיח יעילות גבוהה של טרנספקציה בתאי 293T.
  7. אספו את חומרי העל של הנגיף לאחר 48 שעות, 60 שעות ו-72 שעות ואחסנו אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הוסיפו מדיום טרי (8 מ"ל) בכל נקודת זמן לאחר איסוף הנגיף.
  8. מאגר את הווירוס סופרנאטים. הנפח הכולל של הווירוסים המאוגדים יהיה: ~ 8 מ"ל / צלחת x 3 אוספים = ~ 24 מ"ל / צלחת; ~ 24 מ"ל / צלחת x 3 צלחות = ~ 72 מ"ל מתוך 3 צלחות.
  9. סנן את הווירוסים המאוגדים באמצעות מסנן 0.4 מיקרומטר.
  10. לקבלת טיטר גבוה של וירוסים, לרכז את הווירוסים המאוגדים על ידי ultracentrifugation. העבר את ה-supernatant של הנגיף המסונן לשני צינורות 70 Ti (32 מ"ל/שפופרת) וצנטריפוגה ב-18,000x גרם למשך שעתיים עם תאוצה איטית והאטה. השתמש ברוטור וצנטריפוגה מראש עד 4 °C (75 °F).
  11. מוציאים את הצינורות מהצנטריפוגה בעדינות ומסירים את הסופרנאטנט לחלוטין.
  12. באמצעות micropipette, בעדינות resuspened את הכדור ב 400 μL של DMEM (ללא FBS ואנטיביוטיקה). דגירה על הקרח במשך שעה אחת וערבבו את הכדורים משני הצינורות.
  13. Aliquot את הווירוסים ומקפיא ב -80 מעלות צלזיוס.
    הערה: יש לשמור את הצינורות והווירוסים על הקרח בשלבים 2.10.-2.13. הימנעו מהקצפה תוך כדי החייאה חוזרת של הנגיף עם המדיום הפשוט. המדיום צריך להישמר ב 4 מעלות צלזיוס.
  14. חישוב הריכוז (x) של הנגיף כדלהלן:
    נפח כולל לפני ריכוז = 72 מ"ל (72,000 μL)
    נפח לאחר ריכוז = 400 μL
    הריכוז = 72,000/400 = 180x

3. הערכת יעילות ההתמרה של לנטי-וירוסים

  1. מתמרים תאי 293T עם הנגיף המרוכז בכמויות שונות (2 μL, 4 μL, 8 μL) כדי לאשר את ההכנה המוצלחת של lentiviruses.
    הערה: אם וירוסים מרוכזים מראים יעילות התמרה גבוהה (>50%) בכמויות קטנות (1-2 μL), מומלץ לדלל את הנגיף המרוכז בכמויות הרצויות (100x עד 75x).
  2. דיללו את הנגיף המרוכז ל-100x באמצעות DMEM (ללא FBS ואנטיביוטיקה) כדי לבצע ניסויי טיטרציה בקו התאים MV4-11 AraC R.
  3. זרע 1 x 106 תאים (MV4-11 AraC R קו תאים ב 1.5 מ"ל של 10% RPMI בינוני המכיל 8 מיקרוגרם / מ"ל פוליברן) בבאר אחת של צלחת שש בארות. הכן ארבע בארות להמרה עם כמויות שונות של וירוסים.
  4. הוסף ארבעה כרכים שונים (לדוגמה, 1 μL, 1.5 μL, 2 μL ו- 2.5 μL) של וירוסים 100x.
  5. בצע ספיניקציה על ידי צנטריפוגה של הלוח ב 920 x g במשך 90 דקות ב 37 °C (64 °F).
  6. לאחר 72 שעות, יש למדוד את אחוז תאי ה-GFP+ לפי ציטומטריית זרימה.
  7. קבע את נפח הווירוסים כדי להשיג יעילות התמרה של 30%. יעילות התמרה נמוכה זו נועדה להבטיח שילוב של shRNA יחיד לכל תא.

4. התמרה של ספריית shRNA אפיגנטית משולבת בקו התאים העמידים לתרופות

  1. שמור על קו תאי המטרה MV4-11 AraC R בצפיפות של 0.5 x 106 תאים/מ"ל. ודא שהתאים נמצאים בשלב הצמיחה האקספוננציאלי בתרבית.
  2. חשב את מספר התאים שיילקחו לניסוי כדלהלן בהתבסס על מספר האינטגרנטים הנגיפיים.
    מספר התאים הנדרשים להתמרה = 5,485 (מספר shRNA) × 500 (ייצוג shRNA מתקפל) / 0.25 (MOI) = 10,982,000 ~ 11 x10 6 תאים
  3. Resuspend 1.1 x 107 תאים ב 16 מ"ל של 10% RPMI בינוני.
  4. מוסיפים פוליברן (8 מיקרוגרם/מ"ל) ומערבבים היטב. לאחר מכן, הוסף את נפח הווירוסים הנדרש כדי לקבל יעילות התמרה של 30% כפי שחושב בסעיף הקודם.
  5. זרעו את כל התאים על צלחת בת שש בארות בצפיפות של 1 x 106 תאים/1.5 מ"ל של 10% מדיום RPMI לבאר.
  6. צנטריפוגה את הצלחת במשך 90 דקות ב 920 x g ב 37 °C (64 °F).
  7. הדגירו את הצלחת למשך הלילה בחממת CO2 (5% CO2 ב-37 מעלות צלזיוס).
  8. לאחר 24 שעות, לשנות את המדיום ולהעביר את התאים המתומרים לבקבוק T-75.
  9. לאחר 48 שעות, בדוק את ה- GFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להבטיח התמרה מוצלחת.
  10. לאחר 72 שעות, הוסיפו את אחוז תאי ה-GFP+ על ידי ציטומטריית זרימה.

5. העשרת תאים חיוביים ל-GFP

הערה: הרחב את התאים המתומרים על-ידי עיבודם בצפיפות של 0.5 x 106 תאים/מ"ל למשך 5-7 ימים. תאים אלה הם אוכלוסייה מעורבת של מומרים ולא מתורגמים, שנבחרו על סמך GFP על ידי מיון, כפי שצוין בשלב הבא.

  1. בצע מיון זרימה של תאים שעברו התמרה GFP+ כאשר הגדרות מיון הזרימה מוגדרות כטוהר גבוה ותפוקה נמוכה. השתמש בתאים הלא מתורגמים כדי להגדיר את השער. אוכלוסייה שמעבר ל-1 x 102 ימינה נחשבת לאוכלוסייה חיובית.
  2. אספו את התאים הממוינים ב-5% RPMI (RPMI עם 5% FBS בתוספת 100 פניצילין U/mL ו-100 U/mL סטרפטומיצין).
  3. תרבית את התאים הממוינים במדיום RPMI של 10%.
  4. לאחר 72 שעות, בצע את ההערכה שלאחר המיון של אחוז תאי GFP+ כדי להבטיח יעילות מיון >95%.
    הערה: הקפד לקבל ~ 3-5 x 106 GFP תאים חיוביים לאחר המיון כדי לקבל ייצוג של 450x עד ~ 500x של ספריית shRNA.

6. בדיקת נשירה לזיהוי גורמים אפיגנטיים המתווכים עמידות לתרופות

  1. תרבית ספריית ה-shRNA העבירה תאים ב-10% RPMI למשך עד 5 ימים. שמור בהקפאה של התאים המתומרים לניסויים עתידיים, במידת הצורך, לפני הטיפול התרופתי.
  2. צנטריפוגה 1 x 107 תאים בכפילויות ב 280 x g במשך 5 דקות ב 25 °C (76 °F). השליכו את הסופרנטנט, ואחסנו את הכדורים בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס. דגימות אלה ישמשו כהפניה הבסיסית לספריית ה-shRNA האפיגנטית.
  3. תרבית את התאים המתומרים הנותרים ככפילויות (R1 ו-R2), שכל אחד מהם נשמר בספירת תאים המספקת ייצוג של פי 500 של הספרייה.
  4. טפלו באחד הכפילויות עם התרופה (10 μM cytarabine) (R2) והשני ללא טיפול תרופתי (R1).
  5. שנה את המדיום עבור הצלוחיות עם ובלי התרופה כל 72 שעות. חזור על השינוי הבינוני פי 3 לחשיפה מצטברת לתרופות של 9 ימים.
  6. לאחר 9 ימים של טיפול תרופתי, בדוק את הכדאיות של התאים על ידי שיטת ההדרה הכחולה של טריפאן.
  7. צנטריפוגה את התאים הנותרים ב 280 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. בצעו החייאה של התאים ב-PBS סטרילי ושטפו את התאים. צנטריפוגה ב 280 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  8. השליכו את חומר העל ואחסנו את הכדורים בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס לצורך מיצוי דנ"א.

7. הגברה של ה-shRNA המשולבים על ידי PCR

  1. חלץ דנ"א מתאי הבסיס המתומרים (T) (שלב 6.2.) ומהתאים שטופלו בתרופה (R2) ולא טופלו בתרופה (R1).
  2. בדוק את ריכוז הדגימה באמצעות פלואורומטר.
  3. חשב את כמות הדנ"א הנדרשת עבור PCR כדלקמן:
    5,485 (לא. של shRNAs) × 500 (ייצוג shRNA) × 1 x 6.6−12 (g/דיפלואיד גנום) = 15 מיקרוגרם של DNA
  4. הכפיפו את הדגימות לסבב הראשון של PCR.
    הערה: תערובת תגובת ה-PCR מתוארת בטבלה 2 עם תנאי הרכיבה התרמית. פרטי הפריימרים מובאים בטבלה משלימה 1.
  5. הגדר תגובות מרובות המכילות 850 ננוגרם של דנ"א לכל צינור (בסך הכל 43 תגובות).
    הערה: הסיבוב הראשון של PCR מגביר את אזורי האגף של ה-shRNA וכתוצאה מכך גודל אמפליקון של 397 bp.
  6. אגד את מוצרי ה-PCR וטהרו את מוצרי ה-PCR באמצעות 3-4 עמודות של ערכת טיהור ג'ל/PCR סטנדרטית.
    הערה: הפרטים מפורטים בטבלה 3.
  7. אלקט את המכפלה ב-50 μL של חיץ מכל עמודה ואגד את ה-elutes.
  8. לכמת את הדנ"א ולאחסן אותו בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס.
    הערה: הריאגנטים מסומנים בטבלה 4 עם תנאי הרוכב התרמי. ה-PCR בסיבוב השני משתמש בפריימרים עם רצף INDEX הנדרש לריבוב ב-NGS בתא זרימה יחיד. לכן, כל מדגם צריך להיות מתויג עם אינדקס אחר. רצפי פריימרים מופיעים בטבלה משלימה 1.
  9. הגדר ארבע תגובות עם 500 ננוגרם של מוצר ה-PCR העיקרי בנפח תגובה כולל של 50 μL עבור כל דגימה ובקרה השלילית.
  10. טען את כל המוצר לאלקטרופורזה באמצעות ג'ל אגרוז TBE 2% ואשר את גודל הפס באמצעות סולם מולקולרי של 1 קילובייט. גודלו של האמפליקון הוא 399 bp.
  11. דמיינו את מוצרי ה-PCR במערכת תיעוד הג'ל.
  12. הוציאו את הרצועה הספציפית וטהרו באמצעות ערכת טיהור ג'ל.
    הערה: חישובים לטיהור באמצעות הערכה מופיעים בטבלה 3.
  13. Elute בכרך סופי של 30 μL של מאגר elution. הריכוז המשוער של כל אלואנט יהיה סביב 80-90 ננוגרם/מיקרול עם נפח כולל של 30 מיקרול'.

8. ריצוף וניתוח נתונים מהדור הבא

  1. רוצף את המוצר המטוהר בג'ל משלב 7.13. על רצף מהדור הבא (למשל, אילומינה) כדי לקבל את ספירת הקריאה עבור ה-shRNA המדולדלים.
  2. חתוך את רצפי המתאמים של קריאות FastQ שנוצרו באמצעות ערכת הכלים Fastx (גרסה 0.7).
  3. יישר את הקריאות המסוננות לרצפי ייחוס באמצעות יישור קשת Bowtie עם הפרמטר של מתן אפשרות לשני אי-התאמות. ודא שאורך הקריאה לאחר חיתוך המתאם הוא סביב 21 bp.
  4. טען את הקבצים באמצעות תוכנית Samtools (גרסה 1.9). השתמש באפשרות Flagstat וחשב את סיכום היישור.
  5. טען את קבצי fastQ החתוכים בתוכנת CRISPRCloud2 (CC2) (https://crispr.nrihub.org/) יחד עם רצפי ה- shRNA הייחוסים בצורה של קבצי FASTA ובצע את הניתוח בהתאם להוראות.
    1. לחץ על הקישור התחל ניתוח ב- CC2.
    2. בחר את סוג המסך כמסכי הישרדות ונשירה. הגדר את מספר הקבוצות והקלד את השם עבור כל קבוצה.
    3. העלה את ספריית ההפניות בתבנית קובץ FASTA. הנתונים המועלים מעובדים. לחץ על כתובת ה- URL של הפלט כדי לקבל את התוצאות.
      הערה: תוכנה זו משתמשת במודל בטא-בינומי עם מבחן t של סטודנט שונה כדי למדוד הבדלים ברמות sgRNA/shRNA, ואחריו בדיקת ההסתברות המשולבת של פישר כדי להעריך את המשמעות ברמת הגן. הוא מחשב את השינויים הכוללים המשוערים של יומן2 (Log2Fc) של shRNA עבור הגורמים האפיגנטיים בין הדגימות המטופלות (מועשרות/מדולדלות) לבין הדגימות הלא מטופלות (הבסיס) עם "ערכי p" ו-"FDR".
  6. ודא שערך ה- FDR הוא "שלילי" עבור מסך נשירה ו-"חיובי" עבור מסך הישרדות.
    הערה: CC2 היא פלטפורמת ניתוח לספירת הקריאות וחישוב ייצוג הקפל (העשרה או דלדול) של shRNA בין דגימות.
  7. זהה את ה-shRNA המועשר והמדולדל באופן משמעותי (FDR <0.05) מתוצאות ה-CC2.
    הערה: ישנם 5-24 shRNA נגד כל גורם. בדוק את ערכי ה- FDR עבור כל אחד מה- shRNAs; שקול את ה- FDR, שהוא <0.01, וקח ממוצע עבור ה- shRNA שנבחרו. קחו למשל את 40 הלהיטים המובילים. התוויית הגרף עבור הגורמים שנבחרו בהתבסס על ערכים שליליים של Log2Fc או FDR. ודא של-shRNA שאינם ממוקדים יש גם ערכי FDR משמעותיים כדי להבטיח את האותנטיות של הנתונים מכיוון שהם משמשים כ-shRNA בקרה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

זרימת העבודה הכוללת של הסינון מתוארת באיור 1A. ציטוטוקסיות במבחנה של MV4-11 AraC R (48 שעות) גילתה שה-IC50 לציטרבין ב-MV4-11 AraC R גבוה יותר מה-MV4-11 P (איור 1B). קו תאים זה שימש במחקר כמודל לסינון הגורמים האפיגנטיים האחראים לעמידות לציטראבין.

איור 2A מראה את המפות הווקטוריות הליניאריות של pZIP עם שלושה מקדמים שונים: hEF1α (גורם התארכות אנושי 1α), hCMV (נגיף ציטומגלווירוס אנושי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרעות RNA (RNAi) נמצאות בשימוש נרחב למחקרי גנומיקה פונקציונליים, הכוללים בדיקות siRNA ו-shRNA. היתרון של shRNA הוא שהם יכולים להיות משולבים בווקטורים של פלסמידים ולשלב אותם בדנ"א הגנומי, וכתוצאה מכך ביטוי יציב, ולכן, פגיעה ממושכת יותר של ה-mRNA של המטרה. הקרנה משולבת של ספריית shRNA היא חזקה וחסכונית בהשוואה למסכים המערכים הקונבנציונליים (siRNA). זיהוי החיוניות של סוג מסוים של חלבונים במסך רחב-גנום יכול להיות מסורבל. גישות סינון ממוקדות יכולות לחשוף את החיוניות של חלבונים בודדים להישרדות תאים סרטניים או לעמידות לתרופות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים ואין להם מה לחשוף.

תודות

מחקר זה ממומן בחלקו על ידי מענק המחלקה לביוטכנולוגיה BT/PR8742/AGR/36/773/2013 ל-SRV; והמחלקה לביוטכנולוגיה של הודו BT/COE/34/SP13432/2015 והמחלקה למדע וטכנולוגיה, הודו: EMR/2017/003880 עד P.B. RVS ו-P.B. נתמכים על ידי Wellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118 ו-IA/S/15/1/501842, בהתאמה. S.D. נתמך על ידי מלגת CSIR-UGC, ו- S.I. נתמך על ידי מלגת מחקר בכירה של ICMR. אנו מודים לאבהירופ באגצ'י, לסנדיה ראני ולצוות מתקן הליבה של CSCR Flow Cytometry על עזרתם. אנו מודים גם ל- MedGenome Inc. על העזרה בריצוף בתפוקה גבוהה ובניתוח נתונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ריאגנטים
100 bp סולם היפר סולםBIOLINEBIO-33025
1kb סולם היפר סולםBIOLINEBIO-33056
אגרוזלונזה Seachekm50004
בטאין (5 מ"מ)סיגמאB03001VL
חומצה בוריתQualigens12005
תרבית תאים פלסטיקקורנינגכיישום
ציטוזין ובטא;-D-arabinofuranoside הידרוכלורידSigmaC1768-500MG
DMEMMP BIO
DMSOWak Chemie GMBHCryosure DMSO 10 מ"ל
EDTASigmaE5134
אתידיום ברומידSigmaE1510-10 מ"ל
סרום בקר עובריThermo Fisher Scientific16000044
ערכת טיהור ג'ל/PCRMACHEREY-NAGELREF  740609.50
Gibco- RPMI 1640תרמו פישר מדעי23400021
חומצה אצטית קרחוניתתרמוQ11007
hCMV GFP פלסמידטרנסמידטרנסומיקס בחירת מקדם KIT
hEF1a GFPlasmidTransomicsTransOmics בחירת מקדם KIT
HEK 293TATCCCRL-11268
קו תאים HL60ATCCCCL-240
KOD Hot Start PolymeraseMerck71086
Molm13 קו תאיםאלן וייסברג, מכון הסרטן דנה פרבר, בוסטון, MA, ארה"במכון הסרטן דנה פרבר, בוסטון, MA, ארה"ב
קו תאים MV4-11ATCCCRL-9591
פניצילין סטרפטומיציןתרמו פישר סיינטיפיק
psPAX2 ו- pMD2.GAddgeneAddgene פלסמיד מס' 12260 & Addgene פלסמיד מס' 12259
Qubit dsDNA HS ערכת בדיקהInvitrogenREF Q32854
SFFV  GFP PlasmidTransomicsTransOmics בחירת מקדם ערכת
shERWOOD-UltrmiR shRNA ספריית מ- TransomicsTransomicsCat No. TLH UD7409; פריט מספר: A116. V 132.14
Trans-IT-LTI MirusMirus Mirusמספר קטלוגי: MIR2300
TrisMP Biomedicals0219485591
Trypan BlueSigma-AldrichT8154-100ML
צינורות צנטריפוגה אולטרהבקמן קולטר  103319
<חזק>ציוד
5% CO2 חממהתרמו פישר
BD Aria III סדרן תאיםבקטון דיקינסון
בקמן קולטר אופטימה L-100K- אולטרה-צנטריפוגהבקמן קולטר
צנטריפוגהתרמו מולטיגוג 3SR+
מערכת הדמיה ChemiDoc ( מערכת Fluro Chem M)Fluro Chem
Leica AF600Leica
מיקרוסקופ אורZeiss Axiovert 40c
NanodropThermo Scientific
Qubit 3.0 פלואורומטרInvitrogen
Thermal CyclerBioRad
91233354 מעבדת 15140122

מקורות

  1. Döhner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
  2. De Kouchkovsky, I., Abdul-Hay, M. Acute myeloid leukemia: A comprehensive review and 2016 update. Blood Cancer Journal. 6 (7), 441(2016).
  3. Zuber, J., et al. RNAi screen identifies Brd4 as a therapeutic target in acute myeloid leukaemia. Nature. 478 (7370), 524-528 (2011).
  4. Shi, J., et al. The Polycomb complex PRC2 supports aberrant self-renewal in a mouse model of MLL-AF9;NrasG12D acute myeloid leukemia. Oncogene. 32 (7), 930-938 (2013).
  5. Chen, C. -W., et al. DOT1L inhibits SIRT1-mediated epigenetic silencing to maintain leukemic gene expression in MLL-rearranged leukemia. Nature Medicine. 21 (4), 335-343 (2015).
  6. Li, F., et al. In vivo epigenetic CRISPR screen identifies Asf1a as an immunotherapeutic target in Kras-mutant lung adenocarcinoma. Cancer Discovery. 10 (2), 270-287 (2020).
  7. Balch, C., Huang, T. H. -M., Brown, R., Nephew, K. P. The epigenetics of ovarian cancer drug resistance and resensitization. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 191 (5), 1552-1572 (2004).
  8. Carnero, A. High throughput screening in drug discovery. Clinical and Translational Oncology. 8 (7), 482-490 (2006).
  9. Lal-Nag, M., et al. A high-throughput screening model of the tumor microenvironment for ovarian cancer cell growth. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 494-506 (2017).
  10. O'Neil, N. J., Bailey, M. L., Hieter, P. Synthetic lethality and cancer. Nature Reviews Genetics. 18 (10), 613-623 (2017).
  11. Hoffman, G. R., et al. Functional epigenetics approach identifies BRM/SMARCA2 as a critical synthetic lethal target in BRG1-deficient cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3128-3133 (2014).
  12. Fellmann, C., et al. An optimized microRNA backbone for effective single-copy RNAi. Cell Reports. 5 (6), 1704-1713 (2013).
  13. Knott, S. R. V., et al. A computational algorithm to predict shRNA potency. Molecular Cell. 56 (6), 796-807 (2014).
  14. Papaemmanuil, E., et al. Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
  15. Vidal, S. J., Rodriguez-Bravo, V., Galsky, M., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J. Targeting cancer stem cells to suppress acquired chemotherapy resistance. Oncogene. 33 (36), 4451-4463 (2014).
  16. Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הקרנה משולבת של ספריית shRNA לזיהוי גורמים המווסתים פנוטיפ עמידות לתרופות
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.