מאמר שיטה

שיטת פרפוזיה טרנסקרדיאלית הניזונה מכוח הכבידה לניתוח היסטולוגי של מערכת העצבים המרכזית של העכבר

DOI:

10.3791/63386

⸱

21 בינואר 2022

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, State University of New York Upstate Medical University, 2Department of Neurology, State University of New York Upstate Medical University, 3Department of Neuroscience and Physiology, State University of New York Upstate Medical University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוצגת שיטת זלוף נוחה הניזונה מכוח הכבידה לניתוח היסטולוגי של מערכת העצבים המרכזית של העכבר. זיהוי אימונופלואורסצנטי של α-סינוקלאין זרחני מודגם במודל עכברי של מחלת פרקינסון. עבודה זו גם מתארת באופן מקיף את ההעתקה, הנתיחה, הקפאת/הטבעת רקמות ושלבי חתך קפואים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הניתוח ההיסטולוגי של דגימות המוח וחוט השדרה שבודדו מעכברים הוא פרקטיקה נפוצה להערכת הפתולוגיה במערכת מודל זו. כדי לשמור על המורפולוגיה של רקמות עדינות אלה, זה שגרתי לתת מקבע כימי כגון paraformaldehyde באמצעות שימורים של הלב בבעלי חיים מרדימים (זלוף טרנסקרדיאלי). זלוף טרנסקרדיאלי של לב העכבר הסתמך באופן מסורתי על שימוש במשאבות פריסטלטיות או לחץ אוויר כדי לספק הן את הפתרונות המלוחים והן את הפתרונות המקבעים הדרושים לתהליך זה. כחלופה נגישה בקלות לשיטות אלה, עבודה זו מדגימה את השימוש בשיטה הניזונה מכוח הכבידה של אספקה מתכלה המשתמשת בחומרים הזמינים ברוב חנויות החומרה.

כדי לאמת את שיטת הזלוף החדשה הזו, עבודה זו מדגימה את כל השלבים הבאים הדרושים לזיהוי רגיש של α-סינוקלאין זרחני הן במוח והן בחוט השדרה. בשלבים אלה נכללים כריתה של רקמות המוח וחוט השדרה הקבועות, הקפאה/הטבעה מהירה וקריו-כריתה של הרקמות, והכתמה אימונופלואורסצנטית. מכיוון ששיטה זו גורמת למסירה של כל הגוף של המקבע, היא עשויה לשמש גם להכנת רקמות אחרות שאינן נוירונים לניתוח היסטולוגי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אפיון היסטולוגי של פתולוגיה במערכת העצבים המרכזית של העכבר (CNS) היא טכניקה שגרתית המשמשת במחקרים על ניוון עצבי. כאשר רקמות עצביות מתפרקות במהירות לאחר המוות, נהוג להעביר מקבע כימי כגון פרפורמלדהיד לרקמות CNS כדי לשמר את המורפולוגיה שלהן 1,2. קיבוע כימי יכול להתבצע באמצעות פרפוזיה של כל הגוף עם תמיסה מקבעת או באמצעות בידוד של רקמות וטבילתן בתמיסה מקבעת (המכונה "קיבוע טיפה"). פרפוזיה היא השיטה המועדפת להעברה מקבעת, שכן קיבוע טיפה עשוי שלא לאפשר חדירה מהירה של הפתרון המקבע למבני CNS עמוקים 3,4,5. יתר על כן, מכיוון שקשה להסיר את חוט השדרה הלא מרוסק מעמוד השדרה, העברת התמיסה המקבעת באמצעות זלוף מאפשרת שימור באתרו של האנטומיה המיקרוסקופית והגסה של חוט השדרה ומקשיחה את הרקמה כדי למזער את הנזק במהלך ההסרה.

אספקת המאגר ופתרונות הקיבוע הדרושים לקיבוע מתבצעת בדרך כלל באמצעות משאבות זמינות מסחרית או לחץ אוויר. אספקת כוח הכבידה של perfusate עשויה לשמש כחלופה להעברת המשאבה מהסיבות הבאות: (1) העברת משאבה או לחץ אוויר עשויה במקרים מסוימים לדרוש מהמשתמש לשמור באופן ידני על הלחץ במערכת לאורך כל הזלוף. ניתן לשמור על מסירת כוח המשיכה של perfusate ללא התערבות המשתמש. (2) ניתן לבנות מנגנון פרפוזט המועבר על ידי כוח הכבידה בעלות נמוכה למשתמש על ידי השגת חומרים הזמינים מספקים מדעיים סטנדרטיים. עבודה זו מתארת כיצד לבנות מכשיר פיזור כבידה פשוט באמצעות בקבוקי שטיפה וצינורות ויניל. באמצעות מודל עכברי של מחלת פרקינסון, עבודה זו מדגימה את היעילות של מערכת זו בהחדרת רקמות המוח וחוט השדרה לפני בידודם לצורך חתך קפוא. עבודה זו מתארת באופן מקיף את כל השלבים, הטכניקות והחומרים הדרושים כדי לנתח את הרקמה הקבועה מתוך החיה, להקפיא/להטביע ולהקריך במהירות את הרקמה, ולזהות את נוכחותם של α-סינוקלאין זרחניים הן במוח והן בחוט השדרה באמצעות מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית עקיפה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנתונים ושלבי הניסוי המוצגים בפרוטוקול זה נוצרו באמצעות עכברי C57BL/6J. כל השיטות המערבות בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית של אוניברסיטת מדינת ניו יורק.

1. בניית מנגנון פרפוזיה ופלטפורמת דיסקציה

  1. כפי שניתן לראות באיור 1, קצצו את הקשיות הפנימיות משני בקבוקי שטיפה של 500 מ"ל על-ידי חיתוך הסומק הזה לצד הפנימי של מכסה ההברגה באמצעות סכין גילוח חדה. חותכים חור מרובע בגודל 4 ס"מ על 4 ס"מ בתחתית כל בקבוק חיץ. חותכים חור קטן בתחתית כל בקבוק כדי לאפשר מעבר של מיקרוספטולה כפופה מפלדת אל-חלד.
  2. צור עיקול בצורת "S" במיקרו-מרחביות כך שניתן יהיה להשתמש בהן כווים לתליית בקבוקי החיץ. הכנס את המיקרוספטולות הכפופות לתוך הפתחים המתאימים בבקבוקי החיץ.
  3. חותכים שני צינורות באורך 25 ס"מ ומחברים אותם בחוזקה עם שקעי הקש החיצוניים של הבקבוק. חבר את הקצוות של צינורות אלה יחד עם מחבר Y. חותכים 2 מ' של צינורות ומחברים אותם לקצה החופשי של מחבר Y.
  4. מוציאים את הבוכנה מהמזרק 1 מ"ל וחותכים את המזרק במרחק של כ-6 ס"מ מקצה המזרק. חותכים את המזרק על ידי ניקוד תחילה של הפלסטיק באמצעות סכין גילוח ולאחר מכן הצמדה חדה של פלסטיק המזרק.
  5. הכנס את הפנים החתוכות של המזרק לקצה החופשי של צינורות הפלסטיק. הכנס לעומק מספיק כדי להבטיח אטימה הדוקה.
    הערה: חשוב שכל החיבורים בתוך מנגנון הזלוף יהיו הדוקים מספיק כדי למנוע דליפה. במקרה של חיבורים רופפים, ניתן למקם ולהדק מהדק צינורות נירוסטה קטנים בצמתים לפי הצורך כדי להבטיח אטימה הדוקה במידת הצורך.
  6. סמן בקבוק חיץ אחד כ - PFA ובקבוק אחד כ - PBS (מאגר). יש למדודכ-1/3 מהאורך הרחק מפתח הבקבוק ולצייר קו סביב היקף הבקבוק בנקודה זו כדי לציין את רמת המילוי המתאימה של התמיסות המחורצות.
  7. יש ליישר ולאחר מכן ליצור לולאה בתוך מהדק נייר גדול שיכול להתאים סביב היקף הצינורות. הניחו את הלולאה הזו סביב הצינורות רק קרובים למזרק.
  8. הניחו גוש קלקר בגודל מתאים במגש הזכוכית. מניחים את קצוות הצינור לתוך גוש הקלקר כדי להדביק את הצינורות.
  9. באמצעות מגבות נייר, הגבירו את הקצה הקדמי של מגש הזכוכית בכ-2 ס"מ.
    הערה: פעולה זו תמקם את העכבר בערך ב-20° של מיקום Trendelenburg (הטיה לאחור) כדי לאפשר הדמיה קלה יותר של הסרעפת במהלך הנתיחה ולעודד ניקוז של נוזלים במהלך זלוף.

תרשים הגדרת זלוף PBS-PFA; מערכת דו-קווית להובלת נוזלים בניסויים ביולוגיים
איור 1: דיאגרמה המתארת את מנגנון הזלוף המורכב. קיצורים: PBS = מלוחים בעלי מאגר פוספט; PFA = paraformaldehyde. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

2. הכנת פתרון פרפורמלדהיד (PFA)

הערה: יש להכין תמיסת PFA טרייה ביום ההזלפה ולהשליך אותה בסוף הזלוף במיכל פסולת ייעודי לפני השלכתו על ידי כוח אדם מיומן. פרוטוקול זה מייצר תמיסת PFA של 1 ליטר מתוך 4%, שמספיקה כדי להחדיר כ-4 עכברים. PFA הוא רעיל מאוד, ויש להקפיד על הימנעות משאיפה או מגע ישיר עם העור בצורה האבקה או הנוזלית. לכן רוב שלבי ההכנה מבוצעים תוך לבישת כפפות, משקפי מגן ומעיל מעבדה מתחת למכסה אדים.

  1. יש לשטוף 1 ליטר באמצעות מים מזוקקים ולמלא בכ-800 מ"ל של 18 mΩ דרגה מולקולרית-ביולוגית H2O.
  2. מחממים את הכוס של H2O במיקרוגל למשך 3 דקות או עד שטמפרטורת המים מגיעה ל-65 מעלות צלזיוס. מניחים על צלחת חימום/ערבוב שנשמרה במכסה אדים.
  3. יש לשטוף מוט ערבוב במים מזוקקים ולהניחו במים החמים. התחילו את המערבל והפכו את הצלחת החמה לחום בינוני. ודא כי טמפרטורת המים אינה עולה על 70 °C (70 °F).
  4. יש ללבוש מסכה כירורגית, כפפות, משקפי מגן ומעיל מעבדה ולמדוד 40 גרם של אבקת PFA. יוצקים את האבקה הזו למים המחוממים.
  5. באמצעות פיפטת העברה, הוסף כמה טיפות של 5 M NaOH לפתרון. אפשרו לאבקת ה-PFA להתמוסס באופן מלא. אם האבקה לא התמוססה במלואה לאחר מספר דקות, הוסיפו טיפות של 5 M NaOH לפי הצורך.
  6. לאחר שכמעט כל ה-PFA נמס (ייראה מעט עכור), הפסיקו את הערבוב/חימום והוסיפו מיד 100 מ"ל של 10x מלוחים עם חיץ פוספט (PBS). לבסוף, יש להעלות את המים לסימן 1 ליטר על הכוס באמצעות 18 mΩ דרגה מולקולרית-ביולוגית H2O. מכסים את הכוס בניילון נצמד ומניחים אותו במקפיא של -20 מעלות צלזיוס עד שהתמיסה מגיעה לטמפרטורת החדר (כ-45 דקות).
  7. כיול מד pH באמצעות התקנים המתאימים. בזמן שהכוס נמצאת על צלחת ערבוב, מדוד את ה-pH של התמיסה והוסף HCl עד שה-pH מגיע ל-7.4. במידת הצורך, הוסף 5 M NaOH כדי להגדיל את ה- pH אם הוא נמוך מדי.
  8. חברו בקבוקון ואקום כדי לשאוב אבק והניחו משפך Büchner קרמי נקי עם נייר מסנן בבקבוקון. הפעילו את השואב והרטיבו את נייר הסינון באמצעות פיפטת העברה מלאה בתמיסת 4% PFA.
  9. מוזגים באיטיות את תמיסת ה-PFA של 4% על נייר הסינון עד שכל הפתרון מסונן.
  10. העבירו את התמיסה המסוננת למיכל נקי ומוגן באור ואחסנו אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש (אחסנו לא יותר מ-24 שעות).

3. פרפוזיה "ללא משאבה" טרנסקרדיאלית

  1. במכסה האדים, הניחו גוש חיתוך קלקר במגש זכוכית. ודא כי בלוק הניתוח כולל 5-6 מחטים קצרות לריסון העכבר במהלך הניתוח ו -2 מחטים ארוכות לתמיכה בצינורות הזלוף.
  2. יש לשטוף את מנגנון הזלוף באמצעות מים מזוקקים. אפשרו לכל המים להתנקז לפני תליית מנגנון הזלוף. תלו את בקבוקי ההזלפה 1 מ' מעל החיה המחוררת (עבור עכבר 20-30 גרם).
  3. הכן תמיסה לא סטרילית של 1x PBS באמצעות 10x PBS מדולל עם 18 mΩ רמה מולקולרית-ביולוגית H2O.
  4. כפי שמוצג באיור 2, הידקו את הקו הראשי של מנגנון הזלוף באמצעות המוסטאט. מהדק את קו ה-PFA עם עוד המוסטאט.
    הערה: חסימה עם המוסטאטים מרובים עשויה להיות נחוצה לכל שורה כדי למנוע לחלוטין זרימה.
  5. מלאו את מיכל המאגר ב-1x PBS בטמפרטורת החדר.
  6. מקם את קצה המזרק של מנגנון הזלוף בכוס כדי לאסוף חיץ פסולת ולהסיר את ההמוסטאט החותם את הקו הראשי (איור 2, משמאל).
  7. אפשרו ל-PBS לזרום דרך הקו תוך הסרת אוויר כלוא על ידי הקשה נמרצת על דפנות הצינור.
  8. לאחר שכל האוויר הוסר מהמאגר ומהקווים הראשיים, יש לחסום את הזרימה על ידי הצבת המוסטאט על הקו הראשי.
  9. הסר את ההמוסטאט מקו ה-PFA ואפשר ל-PBS לזרום באופן מדרדר עד לבקבוק ה-PFA תוך הקשה על בועות כלשהן בקו ה-PFA (איור 2, באמצע). המשיכו לאפשר ל-PBS להיכנס לקו ה-PFA עד שניתן יהיה לראות את ה-PBS ממש מעל פתח הבקבוק. חסום את קו ה- PFA עם hemostat כדי לעצור את הזרימה לתוך בקבוק ה- PFA.
  10. חברו את מחט עירוי הפרפר למזרק הזלוף ושטפו את ה-PBS דרך הקו (על ידי פתיחת הקו הראשי של המוסטאט) כדי להסיר בועות ממזרק הזלוף. סגור את המוסטאט של הקו הראשי.
  11. ודא שבקבוק ה-PBS מלא כעת בערךב-1 /3 rd של PBS. במידת הצורך, יש לשטוף את ה-PBS דרך הקו הראשי או למלא יותר PBS לתוך בקבוק המאגר עדל-1 /3 מקיבולתו המלאה.
  12. לאחר שכל הבועות הוסרו מה-PBS, ה-PFA והקווים הראשיים, מלאו את בקבוק ה-PFA ב-4% תמיסת PFA בטמפרטורת החדר עד לסימן השחור שעל הבקבוק (בערך 1/3rd מלא) (איור 2, מימין).

תרשים מערכת כרומטוגרפיה להפרדת ממס; תהליך זרימה רב-שלבי עם כוסות.
איור 2: הכנת מנגנון הזלוף לניתוח זלוף. ראשית, סגרו את קו ה-PFA hemostat ופתחו את ההמוסטאט בקו PBS ובקו הראשי. מלא PBS והסר בועות מקו PBS ומהקו הראשי. לאחר מכן, מלאו את קו ה-PFA ב-PBS על ידי פתיחת ההמוטט בקו ה-PFA וסגירת ההמוטט בקו הראשי. הסר בועות בשורת ה-PFA. לבסוף, סגרו את ההמוסטאט על קו ה-PFA כאשר ה-PBS מגיע לפתח בקבוק ה-PFA. מלאו את בקבוק ה-PFA 1/3rd מלא ב-PFA. ודא שרמת ה- PBS בבקבוק ה- PBS מלאה ב- 1/3rd ומלאה ב- PBS או מנקזים PBS על ידי פתיחת הקו הראשי hemostat במידת הצורך. קיצורים: PBS = מלוחים בעלי מאגר פוספט; PFA = paraformaldehyde. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

  1. היכונו לניתוח שאינו הישרדותי על ידי ניקוי המכשירים הבאים במים ואחריהם 70% אתנול: מספריים גדולים, מספריים עדין לניתוח, מלקחיים עדינים, מלקחיים מעוקלים עדינים.
  2. הכינו את ההרדמה על ידי הנחת מגבונים נטולי אבק בצינור חרוטי של 50 מ"ל. במכסה אדים, משרים היטב את המגבונים נטולי האבק באיזופלורן ומניחים את הצינור הפתוח הפוך בכוס של 500 מ"ל. ודא שאין איזופלורן נוזלי בתחתית הכוס ומשליך כל איזופלורן נוזלי לפני הצבת עכבר בכוס.
  3. מניחים את העכבר בכוס ומניחים ניילון נצמד על הפתח כדי להתחיל בהרדמה.
  4. יש לבצע הרדמה עד שהעכבר מפסיק לנשום (כדקה ו-30 שניות).
  5. כאשר הנשימה נעצרה, מיד להסיר את העכבר מן הכוס ולהחליף את המכסה על צינור חרוטי 50 מ"ל.
  6. בדוק שהעכבר מורדם מספיק על ידי שימוש ברפלקס צביטה של הבוהן. אם החיה אינה מורדמת מספיק, יש לתת יותר איזופלורן כמתואר בשלב 3.15.
  7. בעבודה מהירה, הניחו את העכבר על גוש הקלקר והצמידו את כפות הרגליים החוצה באמצעות ארבע מחטים קצרות (למשל, מחטי מזרק 22 גרם).
  8. הרמת עור הבטן עם מלקחיים העור, השתמש במספריים הגדולים כדי לחתוך את דופן הבטן. יש לוודא כי לא נחתכו איברי בטן!
  9. ממשיכים את חתך הבטן בצורה מעולה לכיוון הכבד. נתקו את הכבד מדופן הבטן הקדמית והמשיכו את החתך הראשוני בצורה מעולה לכיוון הסרעפת. עצרו את החתך הזה כ-1 ס"מ נחות מהסרעפת. הקפידו לוודא שהכבד לא נחתך!
  10. המשיכו את החתך הראשוני לרוחב כלפי מעלה לכיוון הצד הימני והשמאלי של הסרעפת כדי ליצור חתך בצורת "Y" (איור 3A).
  11. כאשר החתך מגיע לסרעפת, בצעו חור בסרעפת באמצעות מספריים עדינים וחתכו את הצלעות בצד ימין של החיה. חותכים את הצלעות בערך באמצע הדרך לבית השחי הימני.
  12. בצע חתך דומה אך ארוך יותר דרך הצד השמאלי של הסרעפת כמעט כל הדרך אל בית השחי השמאלי.
  13. לשקף את דופן החזה ולהצמיד אותו לגוש הקלקר.
  14. במידת הצורך, נתחו את השומן מסביב ללב כדי לחשוף את החדר השמאלי. זהה את החדר השמאלי על סמך הצבע הבהיר יחסית בהשוואה לחדר הימני.
  15. לאחר זיהוי החדר השמאלי, החזק את הלב יציב באמצעות לחץ קל עם המלקחיים המעוקלים העדינים. פתח את ההמוסטאט של הקו הראשי כדי לאפשר ל- PBS לזרום דרך המחט. מיד לנקב את החדר השמאלי ולהבטיח כי המחט מוכנסת לא יותר מ 0.5 ס"מ לתוך החדר. למשוך את המחט מעט במידת הצורך.
    הערה: מיקום מדויק של המחט בחדר השמאלי מצוין על ידי זרימה מדרדרת של דם לתוך צינורות המחט. חשוב לוודא שהמחט לא מוחדרת עמוק מדי לחדר. זה יכול לגרום לזרימה מדרדרת דרך הוורידים הריאתיים או לנקב את המחיצה הבין חדרית.
  16. הניחו את צינורות הפרפר על X המיוצר בקלקר באמצעות שתי מחטים גדולות של 18 גרם.
    הערה: זה קריטי מכיוון שהוא ימנע את התנועה של מחט הפרפר בתוך הלב במהלך הזלוף.
  17. זהה את הווריד הנבוב התחתון קאווה כשהוא יוצא מהכבד והעתק אותו באמצעות המספריים המנתחים העדינים (איור 3B). לחלופין, פתחו את האטריום הימני עם מספריים.
  18. פתחו מיד את הקו הראשי כדי לאפשר לזלוף PBS להתחיל (איור 3C).
  19. הבטיחו שה-PBS מתנקז מגוש הקלקר אל תוך מגש הזכוכית שמתחתיו. אם זה לא קורה, התאימו מחדש את זווית המגש או את בלוק הקלקר כדי לאפשר ניקוז של נוזלים לתוך מגש הזכוכית.
  20. יש להמשיך בזלוף PBS עד שהנוזל הזורם מתוך הווריד הנבוב התחתון נקי מדם (כ-3 דקות).
    הערה: מיקום נכון של המחט בלב יגרום לניקוי חזותי של הדם מהכבד, אשר יהפוך מאדום לצבע קש. אם זה לא קורה, זה עשוי להיות מתוקן על ידי מיקום מחדש של מחט עירוי בתוך החדר השמאלי. ניתן לבצע חתך קטן בבסיס הזנב הגחוני כדי להעריך את איכות הזלוף. זלוף תקין יגרום ל-PBS ברור לזרום מתוך החתך בבסיס הזנב.
  21. בעבודה מהירה, לחסום את קו PBS עם hemostat ולפתוח את קו PFA.
  22. אפשרו ל-PFA לחלחל במשך כמה דקות עד שהזנב מתחיל להתכרבל. ברגע שהזנב מתחיל להתכרבל, התחילו טיימר של 50 דקות. אם הזנב אינו מתכרבל לאחר 5 דקות של פרפוזיית PFA, התחילו טיימר של 50 דקות עבור זלוף ה-PFA.
  23. עקוב אחר רמת ה- PFA בבקבוק באופן רציף לאורך כל הזלוף כדי להבטיח שהרמה לא תרד נמוך מדי. מלאו יותר PFA בבקבוק אם המפלס יורד מתחת ל-2 ס"מ מעל מכסה הבקבוק.

שלבי ניסוי זלוף עכברים: קנולציה של לב, חתך IVC, תרשים עירוי תמיסה.
איור 3: דיאגרמה המתארת פרפוזיה טרנסקרדיאלית. (A) דופן הבטן נחתכת תחילה, ולאחר מכן שני חתכים המצביעים לרוחב לעבר בית השחי ויוצרים "Y". (B) לאחר הכניסה לחלל בית החזה וחשיפת הלב, המחט מועברת לחדר השמאלי. לאחר מכן, IVC או אטריום ימני הוא transected כדי לאפשר ניקוז של perfusates לאחר שהם הסתובבו דרך הגוף. ה-IVC נחתך עדיף על הסרעפת. (ג) נוהל למתן תנינים. קיצור = IVC = vena cava נחות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

  1. לאחר שחלפו 50 דקות, חסמו את הקו הראשי עם המוסטאט ומשכו את המחט מהחדר השמאלי.
    הערה: העכבר כולו נוקשה בשלב זה וכעת ניתן למקם אותו במיכל מסומן של 4% PFA למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. בשלב זה, ניתן לנתח את רקמות ה- CNS ולהניח אותן בנפרד במשך הלילה. בעבודה זו, העכבר כולו ממוקם בקיבוע מכיוון שהדבר מקצר את המרווח בין קיבוע למיקום ב- 4 °C (7 °F). זה גם מונע כל עיוות מכני אפשרי של רקמת עצבים שעלול להתרחש אם בעלי חיים מנותחים מראש לפני השלמת קיבוע הלילה.

4. כריתת CNS

  1. הכן את המכשירים הבאים לנתיחה על ידי שטיפה במים ואחריה 70% אתנול: מספריים, מלקחיים, מלקחיים מעוקלים, מלקחיים עדינים מעוקלים, מלקחיים עדינים ישרים, מספריים עדינים עדינים.
  2. תייג ארבעה צינורות לכל עכבר כדלקמן ומלא בסוכרוז סטרילי 20%: מזהה עכבר, מוח 1, מזהה עכבר, מוח 2, מזהה עכבר, מותני, מזהה עכבר, צוואר הרחם.
  3. מוציאים את העכבר מתמיסת ה-PFA ומייבשים אותו במגבת נייר כדי להסיר עודפי PFA.
  4. באמצעות המספריים הגדולים, להסיר את ראש העכבר על ידי חיתוך בצוואר.
  5. מקם את הגוף בתמיסת ה- PFA. שמור על הראש כדי לנתח את המוח מהגולגולת.
  6. כדי לנתח את המוח, התחילו בכך שתחזירו את עור הגולגולת קדימה כדי לחשוף את כל הגולגולת (איור 4A).
  7. בצע חתך רדוד לתעלה השמיעתית תוך שימוש במספריים המנתחים העדינים כדי להיכנס לגולגולת
  8. ממשיכים את החתך הזה לאורך הסינוס הרוחבי עד שהגולגולת נחתכת כל הדרך בין שתי התעלות השמיעתיות.
  9. בצע חתך בניצב לחתך הקודם לאורך הסדק האורכי עד לחלק הרוסטרלי ביותר של הגולגולת (בערך בין העיניים).
  10. באמצעות המלקחיים המעוקלים המחודדים, משקפים את הגולגולת לרוחב כדי לחשוף את המוח הקדמי. ממשיכים להסיר את הגולגולת עד שכל המוח הקדמי, כולל נורות חוש הריח, נחשפות.
  11. התחילו לנתח את האזור הקאודלי של הגולגולת על ידי ביצוע חתך דרך העצם העורפית ולאט לאט המשיכו את החתך הזה כלפי מטה לכיוון הפורמן מגנום.
  12. שיקפו את שתי פיסות הגולגולת לרוחב כדי לחשוף את המוח הקטן ואת גזע המוח באופן קאודלי (איור 4B).
  13. השתמשו במלקחיים המעוקלים האולטרה-דקים כדי להפריד בין נורות חוש הריח לבין הגולגולת הקדמית ולהתחיל לקלף את המוח הרחק מבסיס הגולגולת החל מהפקעות של חוש הריח.
  14. כאשר המוח מתקלף מבסיס הגולגולת, השתמש במלקחיים דקים במיוחד כדי לחתוך את עצבי הגולגולת ולאפשר את הסרת המוח.
  15. המשיכו לקלף את המוח מבסיס הגולגולת עד שכל המוח השלם יוסר (איור 4C,D).
  16. חותכים את המוח לשניים לאורך הסדק האורכי כדי להפריד בין ההמיספרה הימנית לשמאלית (איור 4E,F).
  17. מקם חצי כדור אחד במוח 1 צינור ואת ההמיספרה השנייה בצינור המוח 2 . אחסנו את הצינורות האלה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שהמיספרות במוח ישקעו (בערך במשך הלילה).

דיסקציה של מוח עוברי; דוגמאות מסומנות A-F; מחקר אנטומי; מוטות סולם 1 ס"מ; השוואה.
איור 4: הסרת מוח קבוע. (B) מוח חשוף בתוך הגולגולת. (C) מוח מבודד (היבט הגבי). (D) מוח מבודד (היבט גחוני). (E) ההמיספרה השמאלית (היבט רוחבי). (F) ההמיספרה השמאלית (היבט מדיאלי). סרגלי קנה מידה = 1 ס"מ (E ו- F). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

  1. כדי לנתח את חוט השדרה, הסר את גוף העכבר מה- PFA והכתים אותו יבש.
  2. הניחו את העכבר על גוש ניתוח קלקר במצב נוטה והצמידו את הכפות לתוך הבלוק באמצעות ארבע מחטים.
  3. התחל את הניתוח על ידי חיתוך העור לאורך קו האמצע של העכבר מהצוואר לזנב כדי לחשוף את כל הישבן.
  4. לשקף את השריר ואת החיתולית על הגב כדי לחשוף את החלק האחורי של עמוד החוליות.
  5. החל מהחוליות הגולגולתיות ביותר, השתמשו במספריים המנתחים העדינים כדי לחתוך את הלמינה תוך הימנעות מחוט השדרה (איור 5A).
  6. מניחים את המלקחיים המעוגלים האולטרה-דקים מתחת ללמינה ומושכים כלפי מעלה כדי לשבור את החוליות כדי לחשוף את חוט השדרה (איור 5B).
  7. השתמש במלקחיים המעוקלים כדי לשקף את החוליות השבורות ולחשוף את האזורים הצדדיים ביותר של חוט השדרה.
  8. המשך בתהליך זה עבור החוליות הבאות על ידי הצבת המלקחיים המעוגלים האולטרה-דקים מתחת ללמינה ושבירת החוליות. המשיכו לשבור חוליות עד שכל עמוד השדרה הצווארי ועמוד השדרה החזי ייחשפו (איור 5C).
  9. המשיכו לחשוף את חוט השדרה עד לקצה חוט השדרה המותני (איור 5D).
  10. באמצעות סכין גילוח חדה, חותכים כל הדרך דרך חוט השדרה האמצעי.
  11. באמצעות המלקחיים המעוקלים האולטרה-דקים, מעבירים את עצבי עמוד השדרה לרוחב מעמוד השדרה ואת החיתולית הקדמית לחוט השדרה כדי להפריד את חוט השדרה הצווארי באיטיות מעמוד השדרה החוליתי.
  12. המשיכו לנתח את חוט השדרה הצווארי עד שהוא משתחרר מהחוליות (איור 5E). מניחים את חוט השדרה הצווארי-מידתוראקי בצינורית שכותרתה צוואר הרחם. אחסנו את הצינורית הזו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שחוט השדרה הצווארי ישקע (בערך במשך הלילה).
  13. המשך לשבור את חוליות החזה עד לסוס הקאודה כמפורט בשלבים 4.22 עד 4.25. כאשר סוס הקאודה נחשף, השתמשו בסכין גילוח חדה כדי לחתוך את חוט השדרה 1 ס"מ מתחת לחוט השדרה המותני (איור 5F).
  14. נתחו את חוט השדרה המותני הרחק מהחוליות כפי שמתואר בשלבים 4.26-4.27. מכניסים את חוט השדרה של סוס הקאודה המותני-בינוני לתוך הצינור המסומן במותני. אחסנו צינור זה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שחוט השדרה המותני ישקע (בערך בן לילה).
  15. כאשר כל הרקמות שקעו ב 20% סוכרוז, להעביר אותם צינורות מסומנים של 30% סוכרוז עד שהם שקעו או במשך 3 ימים.
    הערה: רקמות עמוד השדרה לעתים קרובות אינן שוקעות ב 30% סוכרוז.

רצף דיסקציה המראה תהליך מיצוי עצבים; מדרגות המסומנות A-H, תצוגות תקריב, שימוש באזמל.
איור 5: הסרה של מקטעי חוט שדרה קבועים. (B) מיקום מלקחיים מעוקלים לשבירת חוליות בודדות. (C) עמוד השדרה הצווארי החשוף. (D) עמוד שדרה צווארי, בית חזה ומותני חשוף. (E) הסרת עמוד השדרה הצווארי לאחר חיתוך עצבי עמוד השדרה. (F) חיתוך עמוד השדרה העצתי. (G) עמוד שדרה צווארי מבודד. (H) עמוד שדרה מותני מבודד. פסי קנה מידה = 1 ס"מ (G ו- H). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

5. הטבעת OCT ואחסון רקמות

  1. עבור כל עכבר, תייג ארבעה קריומולדים בצורת מלבנים: מזהה עכבר, חצי הכדור הימני, תאריך ההטבעה; מזהה עכבר, חצי כדור שמאלי, תאריך ההטבעה; מזהה עכבר, צוואר הרחם, תאריך ההטבעה; מזהה עכבר, מותני, תאריך ההטבעה.
  2. הקימו מיכל קלקר ותלו מתכת מעל המיכל.
  3. מלאו את מיכל הקלקר בחנקן נוזלי בערך באמצע הדרך. מלאו את המתכת ב-2-מתילבוטאן טרי בערך באמצע הדרך.
    הערה: 2-מתילבוטאן הוא רעיל, נדיף מאוד ודליק. יש להקפיד להימנע משאיפה על ידי ביצוע הצעדים הבאים במכסה אדים והרחק ממקורות בעירה.
  4. הורידו באיטיות את המתכת לתוך החנקן הנוזלי והימנעו מכל התזה של החנקן הנוזלי לתוך המתכת.
  5. אפשרו ל-2-מתילבוטאן להתחיל לקפוא. בזמן שה-2-מתילבוטאן קופא, מוציאים את הרקמה הרצויה מתמיסת 30% הסוכרוז ומטשטשים אותה על מגבון נטול אבק.
  6. ממקמים את הרקמה בקריומולד כאשר האזור הרוסטרלי מכוון לכיוון החלק העליון (ללא תווית) של העובש.
  7. במשורה יוצקים מדיום אופטימלי להטבעת טמפרטורת חיתוך (OCT) על הרקמה בקריומולד, תוך שימוש במספיק רק כדי לכסות את הרקמה לחלוטין. הימנע משימוש מוגזם ב- OCT מכיוון שהדבר עלול לגרום לפיצוח. הסר את כל הבועות מה- OCT.
  8. כאשר 2-מתילבוטאן קפוא כיסה באופן מלא את המשטח הפנימי של המתכת, יש לטבול באופן מלא את הקרימולד בפאזה הנוזלית העליונה 2-מתילבוטאן במשך 12 שניות. לאחר 12 שניות, הניחו את הקריומולד לניקוז בריבוע רדיד אלומיניום מסומן ועטפו את כל הקריומולד. מיד הניחו את הקרימולד העטוף על קרח יבש והימנעו מהפשרה. ודא שה-OCT/cryomold הקפואים מכוסים תמיד בקרח יבש.
  9. חזור על שלבים 5.6 עד 5.8 עבור כל הרקמות. מניחים את הרקמה של עכבר אחד בשקית ניילון קטנה ואטומה ולאחר מכן לתוך מיכל אטום ובטוח לקריו. אחסנו את המיכל הזה במקפיא העמוק בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לחיתוך החלקים.

6. קריוזקציה

  1. לפני ההקפאה, יש לוודא כי טמפרטורת תא הקריוסטט וראש הדגימה מוגדרים להגדרות המתאימות.
    הערה: טמפרטורת תא של -20 מעלות צלזיוס, טמפרטורת ראש דגימה של -20 מעלות צלזיוס, ועובי מקטע של 30 מיקרומטר משמשים לחיתוך מקטעי מוח. לחיתוך מקטעי חוט השדרה, נעשה שימוש בטמפרטורת תא של -23 מעלות צלזיוס, טמפרטורת ראש דגימה של -30 מעלות צלזיוס ועובי מקטע של 30 מיקרומטר. חשוב לציין כי יהיה צורך להתאים את הגדרות הקריוסטט (במיוחד טמפרטורת ראש הדגימה) במהלך החתך כדי לטפל בבעיות באיכות הרקמה. בדרך כלל, טמפרטורת ראש הדגימה יורדת כדי לתקן את מריחת הרקמה. לעומת זאת, טמפרטורת ראש הדגימה מוגברת כדי לתקן עבור סלסול רקמות מוגזם.
  2. הסר את בלוק ה- OCT הרצוי מהמקפיא של -80 °C והנח את בלוק cryomold / OCT הלא מרוסק בתא cryostat.
  3. אפשרו לבלוק ה-OCT להתאקלם לטמפרטורת התא למשך 30 דקות.
  4. מנקים צ'אק עם 70% אתנול ומנגבים אותו לייבוש עם מגבון נטול אבק. מניחים את הצ'אק המנוקה בתא הקריוסטט ויוצרים עיגול בגודל של OCT בגודל מטבע על הצ'אק. אפשרו ל-OCT לקפוא (כ-1-2 דקות).
  5. כאשר ה-OCT קפא, הניחו נקודה בגודל אפונה של OCT טרי על הצ'אק והניחו מיד את בלוק ה-OCT של הרקמה על הצ'אק. ודא שהרקמה מאונכת באופן מושלם לצ'אק לפני שה- OCT קופא לחלוטין.
    הערה: באופן כללי, האזור הרוסטרלי ביותר במוח ממוקם לכיוון הצ'אק כך שהחתך מתחיל מהקצה הקאודלי. עבור חוט השדרה, בדרך כלל, האזור הקאודלי ביותר ממוקם על הצ'אק כך שהחתך מתחיל מהקצה הרוסטרלי.
  6. כאשר ה-OCT התקשה, הניחו יותר OCT סביב בסיס בלוק ה-OCT כדי לשמש כתמיכה מבנית במהלך החתך. כאשר תמיכה זו התקשתה מעט, הניחו את הצ'אק על ראש הדגימה ואפשרו לבלוק ה-OCT להגיע לטמפרטורה של ראש הדגימה למשך 30 דקות.
  7. מניחים להב מיקרוטום במחזיק הלהב ומנקים את צלחת האנטירול. התאימו את מרחק צלחת האנטי-רול כדי לוודא שהרקמה עוברת ממש מתחת לצלחת במהלך החתך. לקבלת מידע נוסף על המיקום הנכון של צלחת האנטירול, עיין במדריך cryostat.
  8. לאחר שגוש OCT התאקלם לטמפרטורת ראש הדגימה, התחילו לקצץ את בלוק ה-OCT עד שיגיעו לרקמה. כאשר הרקמה נראית לעין, עברו מחיתוך לחתך והתחילו לחתוך מקטעים של 30 מיקרומטר. הזז הצידה את לוחית האנטירול, ובאמצעות שקופית מיקרוסקופ, הרם את הקטע.
  9. ממשיכים לחתוך ולאסוף קטעים עד להסתפק במיקום האנטומי של החלקים או שכל הרקמה נחתכה. יש להניח את המגלשות לייבוש בטמפרטורת החדר למשך 1-3 ימים. לאחר הייבוש, מניחים את המגלשות בקופסת החלקה ומניחים קופסה זו בשקית ניילון אטומה. תייג את השקית עם מזהה העכבר ופרטי הרקמות לפני הצבת המגלשות במקפיא העמוק של -80 מעלות צלזיוס.

7. צביעה אימונופלואורסצנטית

  1. להפשיר את המגלשות למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
  2. מניחים את השקופיות בצנצנת החלקה אופקית ושוטפים את החלקים 3 פעמים ב- PBS במשך 10 דקות כל שטיפה בטמפרטורת החדר על שייקר.
  3. הכן מאגר חסימה (2% BSA + 0.3% Triton-X-100 ב- 1x PBS). השתמש בכ-1 מ"ל לכל שקופית.
  4. צרו תא לח על ידי הוספת מים לקרקעית. הניחו את המגלשות עם הפנים כלפי מעלה בצורה אופקית ואל תאפשרו להן להתייבש. הוסיפו 1 מ"ל של מאגר חסימה לכל שקופית ודגרו למשך שעה אחת לפחות בטמפרטורת החדר.
  5. הכן תמיסת נוגדנים ראשונית על ידי דילול הנוגדן העיקרי במאגר נוגדנים (0.7% BSA + 0.3% Triton-X-100 ב- 1x PBS).
    הערה: עבור הנוגדן α-סינוקלאין הזרחני, נעשה שימוש בגורם דילול של 1:500.
  6. הוסף 200-300 μL של תמיסת נוגדנים ראשונית לכל שקופית. יש לכסות בכיסוי כדי לפזר את הנוגדן ולדגום בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.
  7. למחרת, הסירו את המגלשות מהתא הלח והניחו אותן בצנצנת קופלין אנכית מלאה ב-1x PBS כדי לאפשר לכיסוי ליפול. עשו זאת עבור כל שקופית בנפרד והיזהרו שלא להפריע לחלק הרקמה בעת הסרת הכיסוי.
  8. מניחים את השקופיות בצנצנת החלקה אופקית ושוטפים את החלקים 3 פעמים ב- PBS במשך 10 דקות כל שטיפה בטמפרטורת החדר על שייקר.
    הערה: יש לבצע את כל הצעדים הבאים כאשר האורות כבויים כדי למנוע הלבנת תמונה של הפלואורופור!
  9. הכן את תמיסת הנוגדן המשני על ידי דילול הנוגדן המשני במאגר נוגדנים.
    הערה: לזיהוי α-סינוקלאין זרחני, נעשה שימוש במשני אנטי-ארנב המצומד ל-Alexa 488 עם מקדם דילול של 1:500 במאגר נוגדנים (0.7% BSA + 0.3% Triton-X-100 ב-1x PBS).
  10. הניחו את המגלשות אופקית בתא הלח והוסיפו 200-300 μL של תמיסת נוגדנים משנית לכל שקופית. יש לכסות בכיסוי כדי לפזר את הנוגדן. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות לפחות.
  11. הסירו את המגלשות מהתא הלח והניחו אותן בצנצנת קופלין אנכית מלאה ב-1x PBS כדי לאפשר לכיסוי ליפול. עשו זאת עבור כל שקופית בנפרד והיזהרו שלא להפריע לחלק הרקמה בעת הסרת הכיסוי.
  12. מניחים את השקופיות בצנצנת החלקה אופקית ושוטפים את החלקים 3 פעמים ב- PBS במשך 10 דקות כל שטיפה בטמפרטורת החדר על שייקר.
  13. יש לייבש את צד המגלשות על מגבת ולנער את עודפי ה-PBS.
  14. הוסף 3 טיפות של מדיום הרכבה לכל שקופית. הוסיפו את הכיסוי ודחפו בעדינות את הבועות החוצה עם זוג מלקחיים על ידי לחיצה על הכיסוי לפני ההדמיה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זלוף באיכות גבוהה מצביע על היעדר דם בכבד, בחוט השדרה ובמבנים עמוקים של מערכת העצבים המרכזית (איור 4C ואיור 5G,H). דם שמור מתחת לדורה מאטר (לדוגמה, בתוך הסינוסים הוורידיים) או בין הדורה מאטר לגולגולת לא היה בעייתי מכיוון שדם זה אינו נמצא בתוך הפרנכימה המוחית. הדם שנראה באיור 4A ממוקם בין הגולגולת לחומר הדורה ולכן אינו בעייתי או מרמז על זלוף באיכות ירודה. המוח הטרי וחוט השדרה רכים למדי ונפגעים בקלות במהלך הטיפול. רקמות קבועות כראוי, לשם השוואה, הן מוצקות. כדי להעריך את איכות הרקמה ואת שימור המורפולוגיה של רקמות בשיטת זלוף זו, עבודה זו מדגימה את זיהוי α-סינוקלאין זרחני בחוט השדרה האמצעי והמותני של עכבר בן 15 חודשים ועכבר בן 7 חודשים המבטא את A53T האנושי α-סינוקלאין (איור 6).

המוטציה A53T מיוצגת יתר על המידה בחולים עם מחלת פרקינסון אוטוזומלית דומיננטית (PD). יתר על כן, α-סינוקלאין אנושי עם מוטציית A53T יכול לשחזר רבות מהתכונות של מחלת פרקינסון אנושית כאשר הן מבוטאות בעכברים 6,7. זרחון של α-סינוקלאין בשאריות Serine 129 הוכח ב-in vivo וב-in vitro כדי לגרום לצבירה α-סינוקלאין8. גופי לוי הם הממצא ההיסטולוגי הקלאסי הקיים בחולים עם מחלת פרקינסון או דמנציה של גוף לוי9. רוב α-סינוקלאין הנמצא בגופי לוי הוא זרחן ב-Serine 12910,11. כתוצאה מכך, הצטברות של α-סינוקלאין זרחני משמש כסמן לחומרה ההיסטולוגית של הפתולוגיה של PD. המחקר הנוכחי מצא כי α-סינוקלאין זרחני מצטבר ברמה גבוהה משמעותית בעכברים סימפטומטיים בני 15.5 חודשים ביחס לעכברים אסימפטומטיים בני 7 חודשים המבטאים α-סינוקלאין אנושיים מסוג A53T. זה עולה בקנה אחד עם דיווחים המתארים העשרה של ציטופתולוגיה בקרניים הקדמיות של חוט השדרה ובמוח האמצעי של עכברים אלה. 6 מכאן, מסיק כי שיטת הזלוף הפשוטה המתוארת כאן מספקת קיבוע באיכות גבוהה של רקמות CNS לאפיון היסטולוגי במורד הזרם.

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית; α-synuclein A53T, מוח אמצעי, עמוד שדרה מותני; DAPI, מכתים PS129.
איור 6: תווית עבור α-סינוקלאין זרחני ברקמות של המוח האמצעי וחוט השדרה המותני ממודל עכברי של מחלת פרקינסון. העכבר המשותק בן ה-15.5 חודשים (בן 15.5 חודשים) מושווה לעכבר הבריא בן ה-7 חודשים. שני העכברים מבטאים גרסה מוטנטית מוטעית (A53T) של α-סינוקלאין אנושית הגורמת לפתולוגיה דמוית פרקינסון. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר (לוחות עליונים) ו- 50 מיקרומטר (לוחות תחתונים). קיצור: α syn-A53T = מוטציה A53T של α-סינוקליין; DAPI = 4',6-diamidino-2-פנילינדול; PS129 = סרין 129 זרחני של α-סינוקלאין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מתארת את השלבים הקריטיים לביצוע זלוף טרנסקרדיאלי. בעת בניית מנגנון הזלוף (פרוטוקול סעיף 1), חשוב להשתמש בצינורות גמישים מספיק כדי להיות חסום לחלוטין על ידי hemostat. ייתכן שחלק מהצינורות הנוקשים לא יהיו חסומים מספיק על ידי המוסטאט, ועדיין עשויים לאפשר ל-PFA לדלוף לתוך הקו הראשי במהלך פיזור ה-PBS הראשוני. בעת הכנת תמיסת ה-PFA של 4%, חשוב לוודא שה-pH הוא פיזיולוגי (7.4). מכיוון שהכנת תמיסת ה-PFA כוללת חימום ל-65 מעלות צלזיוס, יש לקרר את התמיסה בחזרה ל-25 מעלות צלזיוס לפני מדידת ה-pH מכיוון שזו הטמפרטורה שבה ה-pH מכויל על המונה.

בעת ביצוע החתך הראשוני לתוך הבטן, יש לנקוט בזהירות כדי למנוע חתך של איברי הבטן (פרוטוקול סעיף 2). כאשר מנתחים בצורה מעולה לכיוון הסרעפת, חשוב להימנע מחתך של הכבד כפי שהוא נפוץ עבור הכבד להיות דבק עם דופן הבטן הקדמית. כדי להתגבר על כך, הכבד מנותח בזהירות ובבוטות מהקיר הקדמי לפני שהוא ממשיך בחתך לעבר הסרעפת. כאשר נכנסים לחלל החזה דרך הסרעפת, חשוב להימנע מחתך של הלב, כלי הדם הגדולים והריאה. כדי להימנע מכך, קצה המספריים נשמר באופן שטחי ובזווית חריפה עם בית הצלעות.

הנתיחה הראשונית לחשיפת הלב אורכת כ-2 דקות מהחתך הראשוני. צפוי כי במהלך תקופה זו, קצת אוויר נכנס לקצה מחט הפרפר. הכנסת אוויר זה למחזור הדם של העכבר תניב זלוף באיכות ירודה. לכן, זה קריטי כי הקו הראשי נפתח PBS הוא שוטף דרך המחט מיד לפני תותח של הלב כדי להסיר בועות אוויר. באופן אידיאלי, הלב משומר בעוד טפטוף PBS קטן זורם דרך קצה המחט כדי להבטיח היעדר מוחלט של אוויר בעת ניקוב LV.

כאשר המחט נכנסת ל- LV, אסור לה להעמיק כל כך כדי להכניס את קצה המחט לחדר הימני (RV). מיקום המחט ב-RV או מעבר למסתם המיטרלי יגרום ל"אינפלציה" מיידית של הריאות בעת הפעלת הזלוף. זה לא רצוי, ויש למשוך מעט את המחט כדי להבטיח מיקום LV. אם המחט ממוקמת כראוי, הריאות יישארו שטוחות לאורך כל הזלוף. כאשר זלוף הוא יזם, הוא ציין לפעמים כי נוזל ברור הוא מגיח מן הפה הפתוח של החיה. זה בדרך כלל בגלל לחץ זלוף כי הוא גבוה מדי או בשל חוסר מיקום של המחט בתוך הלב. החוקרים משערים כי לחצי זלוף גבוהים גורמים לפזרנות של הפרפוזט ממיטת הנימים העורקית ולזרימה מדרדרת של PBS דרך עץ הסימפונות אל תוך הוושט וחלל הפה.

יש להוריד את לחץ הזלוף על ידי הפחתת רמת ה-PBS בבקבוק ה-PBS או על ידי הורדת גובה בקבוק ה-PBS. לחלופין, אם המחט מונחת עמוק מדי לתוך החדר השמאלי, היא עשויה לעבור דרך המסתם המיטרלי ולהעביר את המחט לאטריום השמאלי. זה עלול לגרום לזרימה מדרדרת דרך הוורידים הריאתיים ולפזרנות של חדירה לתוך העורקים, כפי שתואר לעיל. ניקוי יסודי של הדם ממערכת הדם באמצעות PBS חשוב במיוחד כדי למנוע קישור צולב של מרכיבי הדם המושרה על ידי קיבוע וכתוצאה מכך חסימה של כלי הדם עם זלוף קבוע לאחר מכן. הסילוק מוערך ביעילות על ידי שינוי צבע של הכבד וזרימת PBS מחתך בבסיס הזנב הגחוני. פינוי הדם הוא בדרך כלל להשלים על ידי 3 דקות של זלוף עם PBS; עם זאת, אם סימנים חזותיים של אישור מתרחשים בזמנים קצרים יותר, אז fixative הוא הציג מוקדם יותר מ 3 דקות. זמני פינוי ארוכים יותר אינם מומלצים מכיוון שפיזור מתעכב מקבע מוביל לממצאים במבנה עדין CNS1.

כאשר PFA מנוהל, חשוב לעקוב אחר רמת פתרון ה- PFA בבקבוק ה- PFA. מלאו את בקבוק ה-PFA אם רמת ה-PFA יורדת לפחות מ-4 ס"מ מעל פיו של בקבוק ה-PFA. לאחר השלמת הזלוף, יש לשטוף היטב את מנגנון הזלוף במים מזוקקים. זה חשוב מכיוון ש-PFA שיורי בקו הראשי יזהם את זילוף ה-PBS הראשוני ב-PFA ויגרום לזלוף באיכות ירודה. לבסוף, מחטי פרפר 25 גרם מומלצות בדרך כלל לעכברים בוגרים בגודל ממוצע בטווח של 20-30 גרם. עם זאת, עכברים גדולים או קטנים יותר עשויים לדרוש מחטי מד מעט גדולות יותר או קטנות יותר בנוסף להתאמת הבקבוקים המקבעים כדי לספק קצבי זרימה אופטימליים.

עבור דיסקציה של CNS והטמעת OCT (פרוטוקול סעיף 3), מקובל שרקמות חוט השדרה אינן שוקעות לחלוטין ב-30% סוכרוז. לכן רקמות אלה נשארות בסוכרוז במשך יומיים ולאחר מכן מוטבעות ב- OCT, ללא קשר אם הן שוקעות או לא. כאשר מקפיאים רקמות ב-OCT, ייתכן שרקמות מסוימות עלולות להיסדק כאשר הן ממוקמות בקירור 2-מתילבוטאן. זה נפוץ יותר עם המוח ובדרך כלל מתרחשת כאשר יותר מדי OCT ממוקם על הרקמה. כדי להימנע מכך, הניחו רק מספיק OCT כדי לכסות את משטחי הרקמה לפני הקפאה מיידית. בפרוטוקולים מסוימים, פיצוח נפוץ פחות למרות טבילה מוחלטת ב- OCT. זה בדרך כלל נובע משיטת הקפאה איטית יותר, למשל בעת שימוש ב-2-מתילבוטאן מקורר קרח יבש או הנחת הקריומולד על גוש קרח יבש ישירות. 2-מתילבוטאן מקורר בחנקן נוזלי מועדף בעבודה זו מכיוון שקצב ההקפאה מהיר יותר באופן משמעותי ועשוי לשמר טוב יותר את המורפולוגיה של הרקמות מאשר שיטות הקפאה איטיות יותר.

בעת הפשרה של הרקמה (פרוטוקול סעיף 4), חשוב להימנע ממחזורי הפשרה מרובים של הקפאה. לכן, זה אופטימלי לחתוך את כל החלקים מגוש OCT יחיד כדי לקבל אזור מוח מסוים לניתוח במקום להפשיר ולהפשיר מחדש אזורים נבחרים. אם זה לא בר קיימא, לאחר קבלת כמה קטעים, משתמשים יכולים להקפיא מחדש ולאחסן את בלוקי OCT במקפיא העמוק של -80 מעלות צלזיוס 1-2 פעמים נוספות לשימוש עתידי.

היתרונות העיקריים של שיטה זו על פני משאבה מסורתית יותר או אספקת לחץ אוויר של perfusate הם כדלקמן: (1) עלות נמוכה ונגישות של מנגנון הזלוף. (2) המשתמשים אינם צריכים לשמור באופן ידני על הלחץ במנגנון הזלוף לאורך כל הזלוף. (3) לחץ פרפוזיה נמוך ועקבי יותר מחלופות זולות אחרות לזלוף כגון באמצעות אספקת מזרקים. על פי משוואת ברנולי, מחושב כי מנגנון הזלוף הניזון מכוח הכבידה שנבנה כאן ישמור על לחץ פרפוזיה של כ-73 מ"מ כספית כאשר בקבוקי הפרפוזט ממוקמים בגובה של מטר אחד ביחס למחט. בהתחשב בכך שזה נמוך משמעותית מלחץ הדם הסיסטולי של בעלי חיים אלה, לחץ זלוף זה הוא ככל הנראה נמוך מספיק כדי למנוע קרע בכלי הדם12.

המחברים השתמשו עד כה בהצלחה במערכת זלוף זו כדי לזהות נוכחות של α-סינוקלאין זרחני במודל עכברי של מחלת פרקינסון. במהלך תקופה זו, לא נתקלו במגבלות משמעותיות בשיטת זלוף זו שאינן קיימות בשיטת אספקת זילוף משאבה. המגבלה העיקרית של טכניקה זו היא האופי הגוזל זמן של פרפוזיה לעומת קיבוע טיפה. טכניקה זו עדיפה על קיבוע טיפה שכן פרפוזיה גורמת לחדירה עמוקה יותר של מקבעים למבני מערכת העצבים המרכזית. מגבלה שנייה של טכניקה זו היא שהיא דורשת מיומנות כירורגית מסוימת כדי לבצע, שכן הלב חייב להיות משומר במהירות לאחר הכניסה לחלל בית החזה. עם זאת, עם ניסיון, משתמשים מאומנים יכולים באופן שגרתי canulating את הלב בתוך דקה אחת של החתך הראשוני לתוך הבטן.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים על היעדר אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לשיאוון וואנג, ליאם קוין וג'ייסון גרלון על עזרתם בפיתוח פרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH AG061204 ו- AG063499.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2-מתילבוטן (ACS מוסמך), פישר כימיקלפישר סיינטיפיק03551-4
Andwin Scientific Tissue-Tek O.C.T CompoundFisher ScientificNC1029572
Artman Instruments 4.5 אינץ' ישר Castroveijo מספריים קפיצייםאמזוןB0752XHK2X"מספריים עדינים"
BD שימוש כללי ומחטים היפודרמיות PrecisionGlide, 18 גרםפישר סיינטיפיק14-826-5D
BD שימוש כללי ודיוקמחטים היפודרמיות גלישה, 22 גרםפישר סיינטיפיק14-826B
מסנני מזרק קורנינג PESפישר סיינטיפיק09-754-29
Cytiva HyClone פוספט חוצץ מלח (PBS), 10xפישר סיינטיפיקSH30258
פלקון 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטייםפישר סיינטיפיק14-432-22
Fisher BioReagents בקר סרום אלבומין (BSA) אבקה ללא פרוטאזפישר סיינטיפיקBP9703100
פישרברנד מעוקל בינוני נקודה מלקחיים לשימוש כלליפישר סיינטיפיק16-100-110אינץ' מלקחיים מעוקלים
פישרברנד מעוקל דק מאוד דיוק קצה מלקחייםפישר סיינטיפיק16-100-123" מלקחיים עדינים מעוקלים"
פיפטות העברה חד פעמיות של פישרברנדפישר סיינטיפיק13-711-9AM
פישרברנד דיוק גבוה ישר מחודד אולטרה דק פינצטה/מלקחייםפישר סיינטיפיק12-000-122"מלקחיים עדינים ישרים"
פישרברנד מיקרו מרית עם קצוות מעוגליםפישר סיינטיפיק21-401-5
משפכי בוכנר פורצלן פישרברנד עם צלחות מחוררות קבועותפישר סיינטיפיקFB966J
פישרברנד פרימיום כיסוי זכוכית, 24 x 50פישר סיינטיפיק12-548-5M
פישרברנד מלקחיים רקמות פרימיום 1X2 שיניים 5 אינץ'. פלדה גרמניתפישר סיינטיפיק13-820-074"מלקחיים לעור"
פישרברנד צלוחיות סינון כבדות לשימוש חוזרפישר סיינטיפיקFB3002000
פישרברנד מספריים חיתוך סטנדרטיותפישר סיינטיפיק08-951-20"מספריים לניתוח"
פישרברנד מזרקים סטריליים לשימוש חד פעמיפישר סיינטיפיק14-955-464
פישרברנד המוסטט נעילה ישרפישר סיינטיפיק16-100-115
פישרברנד סופרפרוסט פלוס מיקרוסקופ שקופיותפישר סיינטיפיק12-550-15
פישרברנד ערכות צינורות ויניל ומחברים, 1/4 אינץ'.פישר סיינטיפיק14-174-1C
פישרברנד מעגלי נייר סינון איכותיים מחוזקים רטובפישר סיינטיפיק09-790-12F
פישרברנד Y מחבר עם 1/4 אינץ'. מזהה - פוליפרופילן - QCFisher Scientific01-000-686
Garvey Economy להב חותך קצה יחידאמזוןB001GXFAEQ
עז נגד ארנב IgG (H+L) נוגדן משני, DyLight 488ThermoFisher Scientific35552
מהדק מהדק אידיאלי מהדק בלחץ גבוה FisherScientific14-198-5A"מהדקי צינור"
IMEB, Inc Sakura Accu-Edge להבי מיקרוטום בפרופיל נמוך, ניתן לחלוקהפישר סיינטיפיקNC9822467
Kawasumi 25 מד סט איסוף דם מכונף סטנדרטיפישר סיינטיפיק22-010-137"מחט פרפר"
קימברלי-קלארק מקצועי Kimtech Science Kimwipes מגבי משימות עדינים, 1 רובדיפישר סיינטיפיק06-666
בדיקות מולקולריות ProLong יהלום Antifade Mountant עם DAPIFisher ScientificP36962
Nalgene צר פה הזכות לדעת בקבוקי כביסה LDPEThermoFisher Scientific2425-0506"בקבוקי חיץ"
עט PAPabcamab2601
Paraformaldehyde מערכותמיקרוסקופיה אלקטרונית19210
ייבוש זכוכית פיירקס כלים, 34.9 x 24.9 x 6 ס"מפישר סיינטיפיק15-242D
נוגדן רקומביננטי אנטי-אלפא-סינוקלאין (פוספו S129) [EP1536Y]abcamab51253
נתרן הידרוקסידסיגמא-אולדריץ'221465-2.5 ק"ג
שתייה מנירוסטה 18 אונקיותאמזוןB0039PPO9U
סוכרוז לביולוגיה מולקולרית CAS: 57-50-1US ביולוגיS8010
Triton X-100US BiologicalT8655
Vetone Fluriso Isoflurane USPMWI בריאות בעלי חיים502017
" גרגירית

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tao-Cheng, J. H., Gallant, P. E., Brightman, M. W., Dosemeci, A., Reese, T. S. Structural changes at synapses after delayed perfusion fixation in different regions of the mouse brain. Journal of Comparative Neurology. 501 (5), 731-740 (2007).
  2. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564(2012).
  3. McFadden, W. C., et al. Perfusion fixation in brain banking: a systematic review. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 146(2019).
  4. Lamberts, R., Goldsmith, P. C. Fixation, fine structure, and immunostaining for neuropeptides: perfusion versus immersion of the neuroendocrine hypothalamus. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 34 (3), 389-398 (1986).
  5. Adickes, E. D., Folkerth, R. D., Sims, K. L. Use of perfusion fixation for improved neuropathologic examination. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 121 (11), 1199-1206 (1997).
  6. Giasson, B. I., et al. Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein. Neuron. 34 (4), 521-533 (2002).
  7. Martin, L. J., et al. Parkinson's disease alpha-synuclein transgenic mice develop neuronal mitochondrial degeneration and cell death. Journal of Neuroscience. 26 (1), 41-50 (2006).
  8. Fujiwara, H., et al. alpha-Synuclein is phosphorylated in synucleinopathy lesions. Nature Cell Biology. 4 (2), 160-164 (2002).
  9. Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson's disease. Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).
  10. Anderson, J. P., et al. Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease. Journal of Biological Chemistry. 281 (40), 29739-29752 (2006).
  11. Kahle, P. J., et al. Hyperphosphorylation and insolubility of alpha-synuclein in transgenic mouse oligodendrocytes. EMBO Reports. 3 (6), 583-588 (2002).
  12. Mattson, D. L. Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice. American Journal of Hypertension. 14, 405-408 (2001).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Gravity PerfusionTranscardial PerfusionMouse Central Nervous SystemHistologic AnalysisParaformaldehyde FixationBrain DissectionSpinal Cord DissectionImmunofluorescent StainingCryosectioningAlpha Synuclein Detection

מאמרים קשורים