מאמר שיטה

תנועתיות של מולקולות בודדות ואשכולות של קינסין-5 Cin8 דו-כיווני מטוהרים מתאי S. cerevisiae

2.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63425

⸱

2 בפברואר 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Ben-Gurion University of the Negev, Israel, 2Department of Biotechnology Engineering, Ben-Gurion University of the Negev, Israel

במאמר זה

הודעת תיקון

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

סיכום

קינסין-5 Cin8 המיטוטי הדו-כיווני מצטבר באשכולות המתפצלים ומתמזגים במהלך תנועתיותם. הצטברות באשכולות משנה גם את המהירות והכיווניות של Cin8. כאן מתואר פרוטוקול לבדיקות תנועתיות עם Cin8-GFP מטוהר וניתוח תכונות תנועתיות של מולקולות בודדות ואשכולות של Cin8.

תקציר

מנועי הקינזין-5 הדו-קוטביים המיטוטיים מבצעים פונקציות חיוניות בדינמיקת הציר. מנועים אלה מציגים מבנה הומו-טטרמרי עם שני זוגות של תחומים מוטוריים קטליטיים, הממוקמים בקצוות מנוגדים של המתחם הפעיל. ארכיטקטורה ייחודית זו מאפשרת למנועי kinesin-5 להצליב ולהחליק זה מזה מיקרוטובולים של צירים אנטי-פאראליים (MTs), ובכך לספק את הכוח המכוון כלפי חוץ המפריד בין מוטות הציר. בעבר, מנועי kinesin-5 האמינו להיות באופן בלעדי פלוס-סוף מכוון. עם זאת, מחקרים אחרונים גילו כי מספר מנועי קינזין-5 פטרייתיים מכוונים מינוס-קצה ברמת המולקולה הבודדת ויכולים לשנות כיוון בתנאי ניסוי שונים. Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 הוא דוגמה לחלבון מוטורי דו-כיווני כזה: בתנאי חוזק יוני גבוהים מולקולות בודדות של Cin8 נעות בכיוון המינוס-קצה של ה-MTs. כמו כן, הודגם כי Cin8 יוצר אשכולות תנועתיים, בעיקר בקצה המינוס של ה-MTs, ואשכולות כאלה מאפשרים ל-Cin8 לשנות כיוון ולעבור תנועתיות מכוונת איטית, בתוספת קצה. מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט לכל שלבי העבודה עם kinesin-5 Cin8 המתויג על-ידי GFP, החל מביטוי יתר של חלבונים בתאי S. cerevisiae וטיהורו ועד לבדיקת תנועתיות של מולקולה אחת במבחנה . שיטה חדשה שפותחה כאן מסייעת להבדיל בין מולקולות בודדות לאשכולות של Cin8, בהתבסס על עוצמת הפלואורסצנציה שלהם. שיטה זו מאפשרת ניתוח נפרד של תנועתיות של מולקולות בודדות ואשכולות של Cin8, ובכך מספקת את אפיון התלות של תנועתיות Cin8 בגודל האשכול שלו.

מבוא

מספר רב של אירועי תנועתיות בתוך תאים אאוקריוטים מתווכים על ידי תפקודם של חלבונים מוטוריים מולקולריים. מנועים אלה נעים לאורך חוטי השלד הציטוסקטליים, חוטי האקטין והמיקרוטובולים (MTs), וממירים את האנרגיה הכימית של הידרוליזה של ATP לכוחות קינטיים ומכניים הנדרשים להנעת תנועתיות ביולוגית בתוך התאים. S. cerevisiae Cin8 מבוסס MT הוא חלבון מוטורי דו-קוטבי, הומו-טרמרי קינזין-5, אשר מצליב ומחליק MTs צירים זה מזה1. Cin8 מבצע פונקציות חיוניות במהלך מיטוזה, בהרכבת ציר 2,3,4 והתארכות ציר במהלךאנפאזה 5,6,7. בעבר הוכח כי Cin8 הוא מנוע דו-כיווני, המחליף כיווניות בתנאי ניסוי שונים. לדוגמה, בתנאי חוזק יוני גבוה, מנועי Cin8 בודדים נעים לעבר הקצה התחתון של ה- MTs, בעוד שבאשכולות, במבחני גלישה MT מרובי מנועים, ובין MTs אנטי-פאראליים, מנועי Cin8 נעים בעיקר לעבר הקצוות החיוביים של MTs 8,9,10,11,12 . ממצאים אלה היו מאוד לא צפויים בגלל כמה סיבות. ראשית, Cin8 נושא את התחום המוטורי הקטליטי שלו בתחום האמינו-טרמינוס, ובעבר האמינו שמנועים כאלה מכוונים אך ורק ל-plus-end, בעוד ש-Cin8 הוכח כמינוס-קצה המכוון ברמת המולקולה הבודדת. שנית, מנועי קינסין נחשבו לחד-כיווניים, או מינוס-קצה או פלוס-סוף מכוון, בעוד ש-Cin8 הוכח כדו-כיווני, בהתאם לתנאי הניסוי. לבסוף, בגלל כיוון ה-MT בציר המיטוטי, התפקיד הקלאסי של מנועי קינסין-5 בהפרדת מוטות ציר במהלך מכלול הציר ואנאפאזה B יכול להיות מוסבר רק על ידי תנועתיות מכוונת פלוס-קצה שלהם על ה-MTs שהם מצליבים 1,13. בעקבות הדיווחים הראשונים על הדו-כיווניות של Cin8, כמה מנועי קינסין אחרים הודגמו כדו-כיווניים 14,15,16, מה שמצביע על כך שהתנועתיות הדו-כיוונית של מנועי קינסין עשויה להיות נפוצה יותר ממה שסברו קודם לכן.

בעבר דווח כי בתאים, Cin8 נע גם באופן דו-כיווני8, מה שתומך ברעיון שהתנועתיות הדו-כיוונית של חלק ממנועי קינסין-5 חשובה לתפקודים התוך-תאיים שלהם. בנוסף, מכיוון ששלושת מנועי הקינזין-5 שדווחו כדו-כיווניים הם מתאים פטרייתיים, הוצע לאחרונה תפקיד אפשרי לדו-כיווניות של מנועי קינסין-5 בתאים כאלה10. על פי מודל זה, במיטוזה סגורה של תאים פטרייתיים, שבה המעטפת הגרעינית אינה מתפרקת במהלך מיטוזה, מנועי קינסין-5 מספקים את הכוח הראשוני המפריד בין קטבי הציר לפני הרכבת הציר. כדי לבצע משימה זו, לפני הפרדת מוטות הציר, מנועי קינזין-5 מתמקמים ליד מוטות הציר, על ידי תנועתיות מכוונת מינוס-קצה שלהם על MTs גרעיניים בודדים. ברגע שהם נמצאים במיקום זה, מנועי kinesin-5 מקבצים, מחליפים כיווניות, לוכדים ומקשרים MTs צולבים מעמודי ציר שכנים. לאחר מכן, מנועי kinesin-5 מספקים את ההפרדה הראשונית של הקטבים על ידי תנועתיות מכוונת פלוס-קצה על ה-MTs שהם מצליבים. על פי דגם זה, הן תנועתיות מכוונת מינוס-קצה על MTs בודדים והן תנועתיות מכוונת פלוס-קצה על MTs מקושרים צולבים במהלך החלקה אנטי-פראלית נדרשים למנועי קינסין-5 פטרייתיים כדי לבצע את תפקידם בהרכבת ציר 1,13.

המטרה הכוללת של השיטה המתוארת היא להשיג קינסין-5 Cin8 פטרייתי בעל טוהר גבוה, ולבצע מבחני תנועתיות של מולקולה בודדת (איור 1) תוך ניתוח נפרד של התנועתיות של מולקולות בודדות ואשכולות של Cin8. ההפרדה בין מולקולות בודדות לאשכולות חשובה מכיוון שאחד הגורמים שהוכחו כמשפיעים על הכיווניות של Cin8 הוא הצטברותו באשכולות על MTs10,12. מבחני תנועתיות חלופיים, כגון מבחני החלקה על פני השטח של MT ומבחני הזזת MT אינם מספקים מידע לגבי פעילותם של חלבונים חד-מנועיים17,18. שיטות הבדיקה והניתוח החזקות של תנועתיות מולקולה בודדת המתוארות כאן יושמו בהצלחה כדי לאפיין היבטים שונים של מנועי קינסין-5, Cin8 ו- Kip1 10,11,12,14,19,20.

כאן מוצג פרוטוקול מפורט לביטוי יתר וטיהור של Cin8, פילמור של MTs ובדיקת תנועתיות של מולקולה אחת. יתר על כן, מתוארים גם הניתוחים להבחנה בין מולקולות בודדות לאשכולות של Cin8, ולקביעת מהירויות מנוע בודדות ואשכולות על ידי ניתוח תזוזה ממוצעת (MD) וניתוח תזוזה ריבועית ממוצעת (MSD). פרוטוקול זה נועד לסייע לחוקרים לדמיין את כל שלבי ההליכים ולסייע בפתרון בעיות מסוג זה של בדיקות.

figure-introduction-1
איור 1: ייצוג סכמטי של מבחן תנועתיות המולקולה הבודדת. MTs פלואורסצנטיים ביוטינילטיביים מחוברים לפני השטח של הזכוכית, מצופה באבידין המקיים אינטראקציה עם הביוטינילציה-BSA המחוברת לפני השטח. החץ הירוק מייצג את כיוון התנועה של מולקולות Cin8 בודדות בתנאי חוזק יוני גבוהים. +/- מייצגים את הקוטביות של MT. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת מאגרים וריאגנטים

  1. מאגרי
    1. -תערובת נשירה של Leu aa: מערבבים 2 גרם כל אחד של אדנין, אורצ'יל, טריפטופן, היסטידין, ליזין ומתיונין ומאחסנים בטמפרטורת החדר.
    2. מדיום סלקטיבי של שמרים עם ראפינוז (1 ליטר): מערבבים 6.7 גרם של בסיס חנקן שמרים (עם אמוניום גופרתי), 2 גרם של תערובת נשירה של Leu aa, ו-20 גרם של רפינוז במים מזוקקים כפולים על ידי ערבוב (ללא חימום) עד להמסה מלאה. באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר, סנן את התמיסה לבקבוק סטרילי.
    3. מאגר ליזיס: הכינו 25 מ"ל של תמיסה במים מזוקקים משולשים (TDW) המורכבים מ-50 mM Tris, צינורות של 30 mM, 500 mM KCl, 10% גליצרול, 1.5 mM β-mercaptoethanol, 1 mM MgCl2, 0.1 mM ATP ו-0.1% Triton X-100. התאם את ה-pH ל-8 באמצעות 6 M HCl.
    4. מאגר Elution: הכן 10 מ"ל של תמיסה ב- TDW המורכבת מ- 50 mM Tris, צינורות 30 mM, 500 mM KCl, 350 mM imidazole, 10% גליצרול, 1.5 mM β-mercaptoethanol, 1 mM MgCl2, 0.1 mM ATP ו- 0.1% Triton X-100. התאם את ה-pH ל-7.2 באמצעות 6 M HCl.
    5. מאגר P12: הכן 10 מ"ל של תמיסה ב- TDW המורכבת מצינורות 12 mM, 1 mM EGTA ו- 2 mM MgCl2. התאם את ה-pH ל-6.9 באמצעות NaOH של 10 M.
    6. חיץ BRB80: הכן 50 מ"ל של תמיסה המורכבת מצינורות 80 mM, 1 mM EGTA ו- 2 mM MgCl2 במים אולטרה-פוריים. התאם את ה-pH ל-6.9 באמצעות NaOH של 10 M.
    7. חיץ טובולין כללי (GTB): הכן 50 מ"ל של תמיסה המורכבת מצינורות 80 mM, 0.5 mM EGTA ו- 2 mM MgCl2 במים אולטרה-אפורים. התאם את ה-pH ל-6.9 באמצעות NaOH של 10 M.
    8. פתרון Tris-Pipes: הכן 40 מ"ל של תמיסת 1M Tris-0.6 M Pipes על ידי ערבוב של 6.055 גרם של Tris ו- 9.07 גרם של צינורות ב- TDW והתאם את ה- pH ל- 7.2 באמצעות 6 M HCl. הבא את הנפח הסופי ל- 50 מ"ל עם TDW.
      הערה: מאגרי P12, BRB80 ו- Tris-Pipes משמשים להכנת פתרונות מלאי לבדיקת תנועתיות. ניתן להכין מאגרים אלה בכמויות גדולות, לדחוס אותם בצינורות של 1.5 מ"ל, להקפיא את ההצמדה ולאחסן אותם בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
  2. מלאי פתרונות לבדיקת תנועתיות
    1. טובולין (10 מ"ג מ"ל-1): ממיסים 1 מ"ג של טובולין ליופיליזציה ב-100 μL של חיץ טובולין כללי קר (4 מעלות צלזיוס) (GTB). הצמד-הקפא 1 μL aliquots ולאחסן אותם ב -80 °C (80 °F).
    2. טובולין ביוטינילציה (1 מ"ג מ"ל-1): ממיסים 20 מיקרוגרם של טובולין ליופילי ב-20 מיקרול' של GTB קר. הצמד-הקפא 1 μL aliquots ולאחסן אותם ב -80 °C (80 °F).
    3. רודמין שכותרתו טובולין (1 מ"ג מ"ל-1): ממיסים 20 מיקרוגרם של טובולין ליופילי ב-20 מיקרול' של GTB קר. הקפיאו הצמד 0.5 μL aliquots ואחסנו אותם בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
    4. GMPCPP (10 μM): GMPCPP מתקבל מהספק כפתרון מימי של 100 μL ומאוחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. להפשיר את הבקבוקון עם GMPCPP על הקרח. מכינים 1 μL aliquots, הצמד-להקפיא ולאחסן אותם ב -80 °C (80 °F).
    5. ATP: הכינו תמיסת 500 μL של 100 mM ATP ב-0.5 M Tris buffer (pH 8). הקפיאו הצמד 2 μL aliquots ואחסנו אותם בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
    6. MgCl2: הכינו תמיסת 1 מ"ל של 200 mM MgCl2 במאגר P12. אחסן 5 μL aliquots ב -20 °C (76 °F).
    7. קזאין: הכינו תמיסת 1 מ"ל של 5 מ"ג מ"ל-1 קזאין במאגר BRB 80. הקפיאו הצמד 10 μL aliquots ואחסנו אותם בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
    8. D-גלוקוז: הכינו תמיסה של 1 מ"ל של 1 M D-גלוקוז במאגר P12. אחסן 10 μL aliquots ב -20 °C (76 °F).
    9. גלוקוז אוקסידאז: הכן תמיסה של 1 מ"ל של 10 מ"ג מ"ל-1 גלוקוז אוקסידאז ב-P12 buffer. הקפיאו הצמד 2 μL aliquots ואחסנו אותם בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
    10. קטלאז: הכינו תמיסת 1 מ"ל של קטלאז 0.8 מ"ג מ"ל-1 ב-P12 buffer. הקפאה מהירה של 2 μL aliquots ואחסנה בטמפרטורה של -20 °C (75 °F).
    11. Dithiothreitol (DTT): הכינו תמיסת 1 מ"ל של 1 M DTT במאגר P12 במכסה אדים. הקפיאו הצמד 10 μL aliquots ואחסנו אותם בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
    12. קריאטין פוספט: הכינו תמיסה של 1 מ"ל של קריאטין פוספט 1 M במאגר P12. הקפיאו הצמד 2 μL aliquots ואחסנו אותם בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
    13. קריאטין פוספוקינאז: מכינים תמיסה של 1 מ"ל של 5 מ"ג מ"ל-1 קריאטין פוספוקינאז ב-0.25 M גליצילגליצין, pH 7.4. הקפיאו הצמד 2 μL aliquots ואחסנו אותם בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
    14. EGTA: הכינו תמיסת EGTA של 100 mM במים אולטרה-פוריים ואחסנו אותה בטמפרטורת החדר.
    15. KCl: הכינו תמיסת KCl של 1 M במים אולטרה-אפורים ואחסנו אותה בטמפרטורת החדר.
  3. מאגר תנועתיות ותערובת תגובות
    1. מאגר תנועתיות (MB) עם 145 mM KCl, 2x מלאי: הכן 1 מ"ל של 2x מלאי של מאגר התנועתיות על ידי ערבוב 100 μL של תמיסת Tris-Pipes מוכנה מראש, 20 μL של 100 mM EGTA, 290 μL של KCl, ו 590 μL של TDW. שמור את החיץ על הקרח.
    2. תערובת תגובות תנועתיות: הכינו את תערובת תגובת התנועתיות לפי טבלה 1 ואחסנו אותה על קרח.
נפחמניותשם המגיב
50 מיקרולפי 2MB (משלב 1.3.1)
40 μL-TDW
1 μL100 mMATP
1 μL200 mMMgCl2
2 μL5 מ"ג/מ"לקזאין
1 μL1 מ'גלוקוז
1 μL1 מ'DTT
1 μL10 מ"ג/מ"לגלוקוז אוקסידאז
1 μL8 מ"ג/מ"לקטלאז
1 μL1 מ'פוספוקריאטין
1 μL5 מ"ג/מ"לקריאטין פוספוקינאז
100 μLסך

טבלה 1.

2. ביטוי יתר וטיהור של Cin8 מתאי S. cerevisiae

  1. לגדל תאי S. cerevisiae המכילים את הפלסמיד לביטוי יתר של Cin8-GFP-6His לשלב הגדילה האקספוננציאלי (OD600 = 0.6-0.8) ב-1 L של מדיום סלקטיבי של שמרים בתוספת 2% רפינוז (ראה שלב 1.1.2) ב-28 °C12.
  2. לגרום Cin8-GFP-6הבעת יתר על ידי תוספת של 2% גלקטוז. עקוב אחר צמיחת תרביות השמרים על ידי מדידת ספיגה של 600 ננומטר.
  3. חמש שעות לאחר הוספת גלקטוז, לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה ב 4,000 x g במשך 15 דקות ב 4 ° C, להשעות את התאים במאגר lysis ו להקפיא בנוזל N2.
    הערה: ניתן לאחסן תאים קפואים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לשימוש נוסף או לקרקע מיידית בנוזל N2.
  4. טוחנים את התאים הקפואים בנוזל N2 באמצעות טיט מקורר ומזיק. מוסיפים נוזל N2 במהלך הטחינה כדי לשמור על התמציות קפואות. זה בדרך כלל דורש 4-5 פעמים של הוספת Nנוזלי 2.
  5. עקוב אחר תזה של תאים על ידי תצפית תחת ניגודיות פאזה או מיקרוסקופ DIC.
  6. להפשיר את תאי הקרקע והצנטריפוגה ב 21,000 x g במשך 30 דקות ב 4 °C (64 °F). טען את הסופרנטנט על עמודת זרימת כבידה מלאה ב-2 מ"ל של Ni-NTA ושיווי משקל מראש עם חיץ ליזיס. תנו לסופר-נאטאנט לזרום החוצה דרך העמודה.
  7. שטף את העמודה עם חמישה כרכים של עמודה של מאגר ליזיס, ולאחר מכן עם חמישה כרכים של עמודה של מאגר ליזיס בתוספת 25 mM imidazole.
  8. Elute Cin8-GFP-6His עם מאגר אלוטיון (ראה שלב 1.1.4).
  9. נתחו את הדגימות המושתקות על ידי פיצול SDS-PAGE, ולאחר מכן את הכתם הכחול של Coomassie וניתוח כתמים מערביים שנבדקו עם נוגדן α-GFP19.
  10. אסוף את השברים המכילים Cin8-GFP-6His (שלבים 2.8 ו- 2.9). יתר על כן, טהרו אותם על ידי כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל (SEC) בקצב זרימה של 0.5 מ"ל min-1 ומגבלת לחץ עמודה של 1.5 MPa, עם ניטור סימולטני של הספיגה ב-280 ננומטר ופליטת הפלורה של GFP עם עירור ב-488 ננומטר (איור 2A).
  11. אסוף את השברים המתאימים לטטרמר Cin8-GFP ונתח אותם לפי SDS-PAGE וכתם מערבי (ראו שלב 2.9) (איור 2B).
  12. הערך את ריכוז החלבון באמצעות ספקטרופוטומטריה או מבחנים ביוכימיים כגון בדיקת ברדפורד, בדיקת BCA וכו '.
  13. Aliquot את השברים שנבחרו, להקפיא הצמדה בנוזל N2, ולאחסן עד לשימוש ב -80 °C (80 °F). ניתן להשתמש בדגימות חלבון מטוהרות אלה במשך 6 חודשים.
    הערה: Cin8-GFP מתבטא יתר על המידה ומטוהר מזן S. cerevisiae חסר פרוטאז המכיל פלסמיד של 2 מיקרומטר עבור Cin8-GFP-6הבעת יתר של מקדם הגלקטוז, LGY 4093: MATα, leu2-3,112, reg-1-501, ura3-52, pep4-3, prb1-1122, gal1, pOS7 (2μ, LEU2, P GAL1-CIN8-GFP-6HIS). זן השמרים והפלסמיד זמינים על פי בקשה.

figure-protocol-1
איור 2: טיהור Cin8-GFP. (A) הכרומטוגרמה של אי הכללת הגודל של Ni-NTA מטוהרת Cin8-GFP, עם זיהוי פלואורסצנטי רציף של GFP באמצעות עירור ופליטה של 488 ננומטר במהירות של כ-510 ננומטר. הטטרמר Cin8-GFP עולה על כ-10 מ"ל מעמודת ה-SEC (מסומנת בחץ). (B) ג'ל SDS-PAGE מוכתם ב-Coomassie (למעלה) וכתם מערבי α-GFP (למטה) של שברים Cin8-GFP שהודבקו מ-SEC. הדגימות בנתיבים הן כדלקמן: M - סמן משקל מולקולרי, Ni2+- Ni-NTA מטוהר דגימת Cin8-GFP שנטענת בעמודת ה-SEC, שברים GF: שבר המתאים לאליטיון Cin8-GFP SEC כפי שמסומן בלוח A. החץ מימין מסמן את גודלו של המונומר Cin8-GFP (צפוי בדף ה-SDS). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

3. בדיקת תנועתיות של מולקולה בודדת עם Cin8 המטוהר

  1. פילמור של ביוטין ורודמין המסומנים MTs, מיוצב עם GMPCPP.
    1. התחל פילמור MT על ידי ערבוב הרכיבים הבאים בצינור 1.5 מ"ל: 1 μL של 10 מ"ג / מ"ל חלבון טובולין, 1 μL של 1 מ"ג / מ"ל טובולין ביוטינילט, 0.5 μL של 1 מ"ג / מ"ל טובולין מסומן ברודמין, 1 μL של 10 mM GMPCPP, ו 6.5 μL של חיץ טובולין כללי (GTB). דגירה של התערובת למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    2. לאחר פילמור MT, הוסיפו 80 μL של GTB חם (37 מעלות צלזיוס), ערבבו בזהירות וצנטריפוגה ב-16,500 x גרם למשך 20 דקות.
    3. השליכו את ה-supernatant ותלו מחדש את הכדור בזהירות על ידי צנרת למעלה ולמטה עם 50 μL של GTB חם. אחסנו את המתלים בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס.
    4. בחנו את ה-MTs באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות תעלת הרודמין של 647 ננומטר (איור 3A).
      הערה: כדי להשיג MTs בעלי תווית פלואורסצנטית ביולוגית, תגובת הפולימריזציה מכילה טובולין ללא תווית, כמו גם טובולין שעבר ביוטינילציה וסומן פלואורסצנטי. בפרוטוקול זה נעשה שימוש בטובולין המסומן ברודמין, אך ניתן להשתמש גם במצומדים פלואורסצנטיים אחרים.
  2. הרכבת תא זרימה
    1. הרכיבו תא זרימה על ידי הצבת ארבע רצועות של סרט דו-צדדי (כ-4 ס"מ x כ-3 מ"מ) על שקופית זכוכית דביקה מתקדמת (מקבילה לקצה הארוך יותר ו-3-4 מ"מ זה מזה) כדי ליצור שלושה 'נתיבים' בין פסי הקלטת. הסר את נייר המגן מרצועות סרטים והנחכיסוי סילאני 10 על רצועות הקלטת כדי ליצור שלושה תאי זרימה בנפח של ~ 10 μL.
  3. שיתוק MT למשטח המצופה אבידין (איור 1)
    1. מצפים את הכיסויים המסולעים על ידי חדירה עם 15 μL של 1 מ"ג/מ"ל ביוטילציה-שור אלבומין בסרום (b-BSA, מומס ב-GTB) לתוך תא הזרימה באמצעות מיקרופיפט. לאחר 5 דקות, לשטוף את החדר עם 80 μL של GTB.
    2. לאחר מכן, כמו בשלב 3.3.1, הכנס לתוך תא הזרימה 15 μL של 1 מ"ג / מ"ל אבידין (מומס ב- GTB) הנקשר ל- b-BSA. לאחר 5 דקות, לשטוף את החדר עם 80 μL של GTB.
    3. העבירו את משטח הכיסוי הסיליאני באמצעות 20 μL של 1% פולוקסאמר. לאחר 3 דקות, לשטוף עם 80 μL של GTB.
    4. חברו MTs שעברו ביוטינילציה (שלב 3.1) לכיסוי המצופה b-BSA-avidin על ידי החדרת 20 μL של MTs המדוללים בדרך כלל ל-1:20 ב-GTB. דגירו את המגלשות במצב הפוך, כלומר, כאשר הכיסוי פונה כלפי מטה בתא לחות כהה (למשל, צלחת פטרי המכילה נייר טישו רטוב) למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף עם 200 μL של GTB.
    5. החל 30 μL של תערובת תגובות תנועתיות (ראה שלב 1.3.2) על תא הזרימה.
    6. דיללו את מנועי ה-Cin8-GFP (שלב 2.13) ב-20 μL של תערובת תגובות תנועתיות (ראו טבלה 1) (בדרך כלל לריכוז סופי של 5-10 מיקרומטר). החל אותם על תא הזרימה ומיד דמיין את תנועת המנועים לאורך ה- MTs.
  4. הדמיית תנועתיות מוטורית
    הערה: קשירת MT ותנועתיות המנועים נוטרו באמצעות מיקרוסקופ הפוך אפיפלואורסצנטי המצויד במנורת קשת כספית, מטרת צמצם מספרית של 100x/1.4, ושתי מערכות מסנן פס פס פלואורסצנטיות, אחת עם אורך גל של 647 ננומטר (עבור רודמין) והשנייה עם אורך גל של 488 ננומטר (עבור GFP).
    1. הניחו טיפת שמן טבילה על מטרת המיקרוסקופ. הניחו את תא הזרימה על במת המיקרוסקופ הפלואורסצנטי כאשר הכיסוי כלפי מטה פונה אל המטרה.
    2. הפעל את ערוץ הרודמין כדי להתמקד ב- MTs המחוברים למשטח הכיסויים ורכוש את התמונה עם חשיפה של 20 אלפיות השנייה באמצעות תוכנת Micro-Manager ImageJ-Fiji21.
    3. הפעילו את ערוץ ה-GFP ורכשו 90 תמונות בהילוך מהיר עם מרווח של 1 שניות וחשיפה של 800 אלפיות השנייה, לניתוח תנועתיות Cin8-GFP.

figure-protocol-2
איור 3: MTs ו-MT מאוגדים ב-Cin8-GFP. (A) תמונות משני שדות (משמאל ומימין) עבור MTs שעברו פולימר בעקבות הפרוטוקול המתואר בשלב 3.1 ומצולמות עם מטרה של פי 100 כמתואר בשלב 3.4. (B) תמונות משני שדות (משמאל ומימין) עבור Cin8-GFP (לוחות תחתונים, המסומנים בחצים) המחוברים ל- MT המוצג בלוחות העליונים. סרגל קנה מידה: 4 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

4. ניתוח תנועתיות

הערה: בצע את כל ניתוח התמונות וצור קימוגרפיות באמצעות תוכנת ImageJ-Fiji.

  1. יצירת קימוגרף
    1. פתח את סרט קיטועי הזמן ואת תמונת השדה MT המתאימה. סנכרן שני חלונות אלה על-ידי בחירה באפשרות הבאה: ניתוח כלי > > סינכרון Windows.
    2. הדגש MT אחד באמצעות האפשרות קו מפולח והשתמש בכרטיסיה ניתוח > Multi Kymograph כדי לקבל קימוגרפיה.
  2. קביעת גודל האשכול של Cin8-GFP (כלומר, מספר מולקולות Cin8 באשכול)
    1. בצע את חיסור הרקע ואת התיקון לתאורה לא אחידה באמצעות האפשרות 'הפחתה > רקע של תהליך '. הגדר את רדיוס הכדור המתגלגל ל- 100 פיקסלים ובדוק את האפשרות פרבולואיד מחליק .
    2. עקוב אחר עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת של מנוע Cin8-GFP ספציפי שאינו תנועתי (איור 3B) כפונקציה של זמן בתוך מעגל של רדיוס של 4 פיקסלים באמצעות תוסף TrackMate של תוכנת ImageJ-Fiji על-ידי בחירה באפשרות הבאה: תוספים > מעקב > TrackMate >-LoG Detector > Simple Lap Tracker.
    3. חזור על שלב 4.2.2 עבור מנועי Cin8-GFP שונים. התוויית עוצמת הפלואורסצנציה של מנועי Cin8-GFP השונים כפונקציה של הזמן.
      הערה: אסטרטגיה ניסיונית למדידת גודל האשכול - כלומר, מספר מולקולות Cin8 באשכול - קובעת בסיס לניתוח תנועתיות הקשורה לאשכולות Cin8. הלבנת תמונות של GFP המחוברת ל-Cin8 משמשת לקביעת התרומה של מולקולות GFP בודדות לעוצמה הכוללת של צבירי Cin8. לדוגמה, עוצמות הפלואורסצנציה יורדות בשלבים של כ-50 יחידות שרירותיות (a.u.), כאשר כל שלב מייצג ככל הנראה את ההלבנה הפוטו-אקונומית של מולקולת GFP אחת (איור 4A). מאחר ש-Cin8 הוא חלבון מוטורי הומו-טטרמרי, הוא מכיל ארבע מולקולות GFP. לפיכך, כל מנועי ה-Cin8 בעלי עוצמה ≤-200 a.u. צפויים להיות מולקולות Cin8 טטרמריות בודדות. בעקבות שיטה זו, טווחי העוצמה של הפלואורסצנציה המוטורית של Cin8 מוקצים כ-<200, 200-400 ו->400 עבור מולקולות Cin8 בודדות, זוגות של מולקולות Cin8 (דימר של טטרמר Cin8) ואוליגומרים של Cin8, בהתאמה12.
  3. ניתוח התפלגות העוצמה עבור מנועי Cin8-GFP
    1. מדוד את עוצמת הפלורציה הממוצעת של כל מנועי Cin8-GFP הפלואורסצנטיים במסגרת הראשונה של רצף קיטועי הזמן באמצעות תוסף TrackMate ב- ImageJ-Fiji כמתואר בשלב 4.2.2.
    2. היסטוגרמה של העוצמות הממוצעות של Cin8-GFP עם גודל סל של 20 a.u. והתאם את השיא העיקרי של ההיסטוגרמה לעקומת גאוס (איור 4B).
      הערה: ניתוח התפלגות העוצמה משלים את קביעת גודל האשכול עבור מנועי Cin8-GFP מניסויי הפוטו-הלבנה. עקומת גאוס המותאמת להיטוגרמה של התפלגות העוצמה עבור אוכלוסיית Cin8-GFP מגיעה לשיאה בטמפרטורה של כ-125 a.u., מה שעולה בקנה אחד עם העוצמה הממוצעת של מולקולות Cin8 טטרמריות בודדות המכילות אחת, שתיים, שלוש או ארבע מולקולות GFP פלואורסצנטיות (לא מולבנות), כאשר כל מולקולת GFP פלואורסצנטית תורמת כ-50 a.u. לפיכך, באמצעות שיטת התפלגות עוצמה זו, ניתן לחשב גם את התרומה של מולקולת GFP אחת, אשר ניתן להשתמש בה עוד יותר כדי להקצות את גודל האשכול של מולקולות Cin8-GFP.

figure-protocol-3
איור 4: פרופיל הלבנה של Cin8-GFP והתפלגות העוצמה. (A) הלבנת תמונות של GFP בארבעה מנועי Cin8-GFP שונים. צעדי הלבנת תמונות יחידים, שכל אחד מהם מייצג ככל הנראה את ההלבנה הפוטו-אקונומית של GFP אחד, מובילים לירידה בעוצמת הפלואורסצנציה של ~50 a.u. (B) התפלגות העוצמה של מנועי Cin8-GFP במסגרת הראשונה של רצף קיטועי זמן (inset). שיא גאוס (כחול) שמרכזו כ-125 a.u מייצג מולקולות Cin8-GFP בודדות. שיא זה מציג את העוצמה הממוצעת של טטרמרים Cin8 בודדים עם מולקולות GFP פלואורסצנטיות אחת, שתיים, שלוש או ארבע מולקולות GFP פלואורסצנטיות, כאשר כל מולקולת GFP תורמת ~ 50 a.u. לעוצמה הכוללת (כלומר, (50 + 100 + 150 + 200) / 4 = 125). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

  1. מעקב אחר תנועתיות מולקולות Cin8-GFP לאורך מסלולי MT
    1. חתוך את ה- MT לניתוח ברצף קיטועי הזמן של מסגרות מוקלטות על-ידי הדגשתו באמצעות הכלי מלבן ולאחר מכן בחירה בתמונה > חיתוך.
    2. בחר חלקיק Cin8-GFP פלואורסצנטי לניתוח. רשום את קואורדינטות החלקיקים בכל מסגרת (נקודת זמן) של רצף חלוף הזמן באמצעות אפשרויות כלי הנקודה והמדד . בצע הקלטה דומה של קואורדינטות עבור חלקיקים פלואורסצנטיים אחרים ברצף קיטועי הזמן.
    3. הקצה גודל צביר לכל חלקיקי Cin8-GFP שנבדקו במסגרת הראשונה של הופעתם, כמתואר בשלב 4.2.
  2. ניתוחי תזוזה ממוצעת (MD) ותזוזה ריבועית ממוצעת (MSD)
    1. מהקואורדינטות של תנועות Cin8-GFP שנקבעו בשלב 4.4, חישבו את התזוזות של Cin8-GFP בכל נקודת זמן ביחס לקואורדינטות הראשוניות, תוך שימוש במשוואה לחישוב המרחק בין שתי נקודות עם קואורדינטות נתונות:
      figure-protocol-4
      כאשר, dt הוא התזוזות של Cin8-GFP בזמן t, xt ו- yt הן הקואורדינטות המתאימות בזמן t. x0 ו- y0 הן הקואורדינטות המתאימות של Cin8-GFP ב- t = 0.
    2. חשב מתוך ערכי תזוזה אלה את התזוזה עבור כל מרווחי הזמן האפשריים עבור חלקיק Cin8-GFP ספציפי. חזור על ההליך עבור כל חלקיקי Cin8-GFP שנבדקו.
    3. התווה את התזוזה הממוצעת (MD) של כל חלקיקי Cin8-GFP שנבדקו לעומת מרווח זמן ובכפוף להתאמה ליניארית, MD = v x t + c. השיפוע של התאמה זו (v) מייצג את המהירות הממוצעת של חלקיקי Cin8-GFP תנועתיים.
      הערה: באופן זה, ניתן לחשב בנפרד את המהירות הממוצעת של כל מולקולות Cin8-GFP השייכות לכל גודל אשכול, תוך אפיון בנפרד של תנועתיות של גדלי אשכולות שונים. בנוסף לניתוח MD, ניתוח תזוזה בריבוע ממוצע (MSD) יכול להתבצע גם על ידי כריעת ערכי התזוזה המחושבים בשלבים 4.5.1 ו- 4.5.2. ערכי MSD משורטטים לעומת מרווח זמן ומותאמים לעקומה הפולינומית MSD = v2 x t2 + 2D x t + c, מה שנותן את הפרמטר הנוסף D, שהוא מקדם הדיפוזיה של תנועת Cin8-GFP. ניתוח MD צריך להתבצע על קוטביות המסומנת MTs 8,10, בעוד שעבור ניתוח MSD הידע על קוטביות MT אינו הכרחי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מטרת הניסוי היא לחקור את מאפייני התנועתיות של החלבון המוטורי הדו-כיווני Cin8 בגדלים שונים של צבירים ב-MTs בודדים. תנועתיות מייצגת של Cin8-GFP ניכרת גם מהקימוגרפים באיור 5A, שם מוצג המיקום המרחבי של המנוע לאורך זמן.

לצורך ניתוח תכונות תנועתיות של Cin8-GFP, ראשית, גודל הצביר מוקצה (שלב 4.3) לכל חלקיק תנועתי Cin8-GFP המחובר ל- MT, ולאחר מכן המיקום של חלקיקי Cin8 שנבדקו נמצא במעקב כפונקציה של הזמן (שלב 4.4). עבור כל קטגוריית גודל אשכול, >40 מסלולים של Cin8-GFP בודד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בעבודה זו מוצג פרוטוקול לבדיקת תנועתיות של מולקולה בודדת עם קינזין-5 Cin8 דו-כיווני וניתוח תנועתיות. ה-Cin818 באורך מלא, כולל אות הלוקליזציה הגרעינית המקומי (NLS) במסוף C טוהר מהמארח המקומי S. cerevisiae. מכיוון שה-Cin8 הוא חלבון מוטורי גרעיני, שחיקה של תאי S. cerevisiae תחת חנקן נוזלי נמצאת כשיטה היעילה ביותר לתסיסת תאים. לאחר תזה, על ידי שילוב של זיקה מתכתית וכרומטוגרפיה של הרחקת גודל, מתקבל Cin8 טהור ביותר, החשוב למבחני התנועתיות של מולקולה אחת. בעבר דווח כי ישנם הבדלים בין תכ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענק הקרן הישראלית למדע (ISF-386/18) ומענק הקרן הלאומית למדע (BSF-2019008), שהוענק ל- L.G.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אדניןFORMEDIUMDOC0230
ATPסיגמאA7699
ביוטינילאט-BSAסיגמאA8549
קזאיןסיגמאC7078
קטלאז (C40)סיגמאC40
קריאטין-קינאזסיגמאC3755
דיתיותרייטול (DTT)סיגמאD0632
EDTASigmaE5134
EGTASigmaE4378
סט מסנני פלואורסצנטי עבור GFPChromaET-EGFP (FITC/Cy2)
עבור רודמיןכרומה 49004: ET-CY3/TRITC
מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוךZeissAxiovert 200M
GalactoseTivan BiotechGAL02
גלוקוזSigmaG8270
גלוקוז אוקסידאזSigmaG7141
גליצרולסיגמאG5516
גליציל גליציןMerckG0674
GMPCPPJana BioscienceNu-405L
GTBשלדציטוBST01-010
GTPSigmaG8877
HistidineDuchefa BiochemieH0710.0100
תוכנת ImageJ-FIJIhttps://imagej.net/plugins/trackmate/גרסה 2.1.0/1.53c; Java 1.8.0_172 [64 סיביות] עבור Windows 10
ImidazoleSigmaI0125
InstantBlue Coomassie כתם חלבוןAbcamab119211
עדשתZeiss100x/1.4 שמן DIC אובייקטיב
ליזיןFORMEDIUMDOC0161
מגנזיום כלורידסיגמאM8266
מתיוניןDuchefa BiochemieM0715.0100
מצלמת NeoAndor TechnologiessCMOS
LifeA2666
Ni-NTA AgaroseInvitrogenR901-15
צינורות פוספו-קריאטיןSigmaP1937
SigmaP1851
חומצה פלורונית F-127 (פולוקסמר)SigmaP2443
אשלגן כלוריSigmaP9541
RaffinoseTivan BiotechRAF01
גודל אי הכללה כרומטוגרפיה intumentGE HealthcareAKTA ספקטרופוטומטר טהור
ThermoFisher ScientificNanoDrop
Superose-6 10/300 GLGE Healthcare17-5172-01
TrisRoshe10708976001
Triton X-100SigmaT8787
טריפטופןDuchefa BiochemieT0720.0100
חלבון טובוליןציטוT240
טובולין, שלד ציטוטיני ביוטיניT333P
טובולין, שלד ציטו רודמין TRITCTL530M
UracilSigmaU0750-100G
בסיס חנקן שמריםFORMEDIUMCYN0401S
&-GFP נוגדןSanta Cruz BiotechnologySC8036
β-mercaptoethanolSigmaM3148
49002: סט מסנני פלואורסצנטי NeutraAvidin שלד

מקורות

  1. Singh, S. K., Pandey, H., Al-Bassam, J., Gheber, L. Bidirectional motility of kinesin-5 motor proteins: structural determinants, cumulative functions and physiological roles. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (10), 1757-1771 (2018).
  2. Hoyt, M. A., He, L., Totis, L., Saunders, W. S. Loss of function of Saccharomyces cerevisiae kinesin-related CIN8 and KIP1 is suppressed by KAR3 motor domain mutations. Genetics. 135 (1), 35-44 (1993).
  3. Saunders, W. S., Hoyt, M. A. Kinesin-related proteins required for structural integrity of the mitotic spindle. Cell. 70 (3), 451-458 (1992).
  4. Hoyt, M. A., He, L., Loo, K. K., Saunders, W. S. Two Saccharomyces cerevisiae kinesin-related gene products required for mitotic spindle assembly. Journal of Cell Biology. 118 (1), 109-120 (1992).
  5. Gerson-Gurwitz, A., et al. Mid-anaphase arrest in S. cerevisiae cells eliminated for the function of Cin8 and dynein. Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (2), 301-313 (2009).
  6. Fridman, V., Gerson-Gurwitz, A., Movshovich, N., Kupiec, M., Gheber, L. Midzone organization restricts interpolar microtubule plus-end dynamics during spindle elongation. EMBO Reports. 10 (4), 387-393 (2009).
  7. Movshovich, N., et al. Slk19-dependent mid-anaphase pause in kinesin-5-mutated cells. Journal of Cell Science. 121 (15), 2529-2539 (2008).
  8. Gerson-Gurwitz, A., et al. Directionality of individual kinesin-5 Cin8 motors is modulated by loop 8, ionic strength and microtubule geometry. Embo Journal. 30 (24), 4942-4954 (2011).
  9. Roostalu, J., et al. Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling. Science. 332 (6025), 94-99 (2011).
  10. Shapira, O., Goldstein, A., Al-Bassam, J., Gheber, L. A potential physiological role for bi-directional motility and motor clustering of mitotic kinesin-5 Cin8 in yeast mitosis. Journal of Cell Science. 130 (4), 725-734 (2017).
  11. Goldstein-Levitin, A., Pandey, H., Allhuzaeel, K., Kass, I., Gheber, L. Intracellular functions and motile properties of bi-directional kinesin-5 Cin8 are regulated by neck linker docking. eLife. 10, 71036(2021).
  12. Pandey, H., et al. Drag-induced directionality switching of kinesin-5 Cin8 revealed by cluster-motility analysis. Science Advances. 7 (6), 1687(2021).
  13. Pandey, H., Popov, M., Goldstein-Levitin, A., Gheber, L. Mechanisms by which kinesin-5 motors perform their multiple intracellular functions. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6420(2021).
  14. Fridman, V., et al. Kinesin-5 Kip1 is a bi-directional motor that stabilizes microtubules and tracks their plus-ends in vivo. Journal of Cell Science. 126, 4147-4159 (2013).
  15. Edamatsu, M. Bidirectional motility of the fission yeast kinesin-5, Cut7. Biochemical and Biophysical Research Communications. 446 (1), 231-234 (2014).
  16. Popchock, A. R., et al. The mitotic kinesin-14 KlpA contains a context-dependent directionality switch. Nature Communications. 8, 13999(2017).
  17. Bodrug, T., et al. The kinesin-5 tail domain directly modulates the mechanochemical cycle of the motor domain for anti-parallel microtubule sliding. eLife. 9 (9), 51131(2020).
  18. Gheber, L., Kuo, S. C., Hoyt, M. A. Motile properties of the kinesin-related Cin8p spindle motor extracted from Saccharomyces cerevisiae cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (14), 9564-9572 (1999).
  19. Pandey, H., et al. Flexible microtubule anchoring modulates the bi-directional motility of the kinesin-5 Cin8. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 6051-6068 (2021).
  20. Shapira, O., Gheber, L. Motile properties of the bi-directional kinesin-5 Cin8 are affected by phosphorylation in its motor domain. Scientific Reports. 6, 25597(2016).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Britto, M., et al. Schizosaccharomyces pombe kinesin-5 switches direction using a steric blocking mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), 7483-7489 (2016).
  23. Kapitein, L. C., et al. Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5. Journal of Cell Biology. 182 (3), 421-428 (2008).
  24. Furuta, K., Edamatsu, M., Maeda, Y., Toyoshima, Y. Y. Diffusion and directed movement in vitro motile properties of fission yeast kinesin-14 Pkl1. Journal of Biological Chemistry. 283 (52), 36465-36473 (2008).
  25. Katrukha, E. A., et al. Probing cytoskeletal modulation of passive and active intracellular dynamics using nanobody-functionalized quantum dots. Nature Communications. 8, 14772(2017).
  26. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  27. Jakobs, M. A. H., Dimitracopoulos, A., Franze, K. KymoBulter, a deep learning software for automated kymograph analysis. eLife. 8, 42288(2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תיקון


Formal Correction: Erratum: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells
Posted by JoVE Editors on 6/09/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells. The Authors section was updated.

One of the author names was updated from:

Roy Abraham

to:

Roy Avraham

תגיות

Kinesin 5Cin8Size Exclusion ChromatographySaccharomyces CerevisiaeGFP

מאמרים קשורים