מאמר שיטה

פיתוח של Organoids מן בלוטת יותרת המוח עכבר כמו מודל במבחנה כדי לחקור ביולוגיה של תאי גזע בלוטת יותרת המוח

DOI:

10.3791/63431

⸱

25 בפברואר 2022

 ,  , 
1Laboratory of Tissue Plasticity in Health and Disease, Cluster of Stem Cell and Developmental Biology, Department of Development and Regeneration, Leuven Stem Cell Institute, KU Leuven (University of Leuven)

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בלוטת יותרת המוח היא הרגולטור העיקרי של המערכת האנדוקרינית של הגוף. מאמר זה מתאר את ההתפתחות של organoids מן בלוטת יותרת המוח העכבר כמו מודל הפריה חוץ גופית 3D רומן לחקור את אוכלוסיית תאי הגזע של הבלוטה אשר הביולוגיה והתפקוד נשארים מובנים היטב.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בלוטת יותרת המוח היא בלוטת האנדוקרינית הראשית ויסות תהליכים פיזיולוגיים מפתח, כולל צמיחת הגוף, חילוף החומרים, התבגרות מינית, רבייה, ותגובת מתח. לפני יותר מעשור, תאי גזע זוהו בבלוטת יותרת המוח. עם זאת, למרות היישום של גישות vivogenic, פנוטיפ שלהם, ביולוגיה, ותפקיד עדיין לא ברור. כדי להתמודד עם תעלומה זו, מודל חדש וחדשני אורגנויד במבחנה מפותחת כדי לפענח עמוק ביולוגיה של תאי גזע בלוטת יותרת המוח. אורגנוידים מייצגים מבני תאים תלת-ממדיים, אשר בתנאי תרבית מוגדרים, מתפתחים באופן עצמי מתאי גזע (אפיתל) של רקמה ומסמנים מחדש סימני היכר מרובים של תאי גזע אלה ורקמתם. זה מוצג כאן כי אורגנוידים שמקורם בבלוטת יותרת המוח מפתחים מתאי הגזע של הבלוטה, בנאמנות recapitulate שלהם in vivo phenotypic ומאפיינים פונקציונליים. בין היתר, הם משחזרים את מצב ההפעלה של תאי הגזע כמו ויוו המתרחשים בתגובה לנזק מקומי שנגרם מהונדסים. האורגנוידים ניתנים להרחבה לטווח ארוך תוך שמירה איתנה על פנוטיפ הגבעול שלהם. מודל המחקר החדש הוא בעל ערך רב כדי לפענח את הפנוטיפ של תאי הגזע והתנהגות במהלך תנאים מרכזיים של שיפוץ בלוטת יותרת המוח, החל התבגרות יילודים כדי דהייה הקשורים להזדקנות, ומ בריא לבלוטות חולים. כאן, פרוטוקול מפורט מוצג כדי להקים אורגנוידים שמקורם בבלוטת יותרת המוח עכבר, אשר מספקים כלי רב עוצמה לצלול לתוך העולם עדיין חידתי של תאי גזע בלוטת יותרת המוח.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בלוטת יותרת המוח היא בלוטה אנדוקרינית זעירה הממוקמת בבסיס המוח, שם היא מחוברת להיפותלמוס. הבלוטה משלבת תשומות היקפיות ומרכזיות (היפותלמיות) כדי ליצור שחרור הורמונלי מכוון ומתואם, ובכך מווסתת איברים אנדוקריניים למטרה במורד הזרם (כגון בלוטות יותרת הכליה ובלוטות המין) לייצור הורמונים מתאימים בזמן הנכון. בלוטת יותרת המוח היא הרגולטור העיקרי של המערכת האנדוקרינית ולכן הוא מכונה בצדק בלוטת הורים1.

בלוטת יותרת המוח של העכבר מורכבת משלוש אונות (איור 1), כלומר, האונה הקדמית (AL), האונה האמצעית (IL) והאונה האחורית (PL). AL האנדוקרינית העיקרית מכילה חמישה סוגי תאים הורמונליים, כולל סומטוטרופים המייצרים הורמון גדילה (GH); לקטוטרופים המייצרים פרולקטין (PRL); קורטיקוטרופים המפרישים הורמון adrenocorticotropic (ACTH); תירוטרופים האחראים על ייצור הורמון מגרה בלוטת התריס (TSH); וגונדוטרופים שהופכים הורמון מחלמן (LH) והורמון מגרה זקיק (FSH). PL מורכב תחזיות אקסונליות מן ההיפותלמוס שבו ההורמונים אוקסיטוצין ו vasopressin (הורמון antidiuretic) מאוחסנים. ה- IL ממוקם בין AL ו- PL ובתים מלנוטרופים המייצרים הורמון מגרה מלנוציטים (MSH). בבלוטת יותרת המוח האנושית, IL נסוג במהלך הפיתוח, מלנוטרופים מופצים בתוך AL1. בנוסף לתאים האנדוקריניים, בלוטת יותרת המוח מכיל גם בריכה של תאי גזע, מסומן בעצם על ידי גורם שעתוק SOX2 2,3,4,5,6. תאי SOX2+ אלה ממוקמים באזור השולי (MZ), בטנת האפיתל של השסע (לומן שריד עוברי בין AL ל- IL), או מפוזרים כאשכולות לאורך הפרנצ'ימה של AL, ובכך מציעים שתי נישות תאי גזע בבלוטה (איור 1)2,3,4,5,6.

בהתחשב באופי החיוני של בלוטת יותרת המוח, תקלה של הבלוטה קשורה עם תחלואה חמורה. Hyperpituitarism (מאופיין על ידי הפרשת יתר של הורמון אחד או יותר) ו hypopituitarism (ייצור פגום או חסר של הורמון אחד או יותר) יכול להיגרם על ידי גידולים נוירואנדוקריניים יותרת המוח (PitNETs; למשל, גידולים המייצרים ACTH המובילים למחלת קושינג) או על ידי פגמים גנטיים (למשל, חוסר GH וכתוצאה מכך גמדות)7. בנוסף, ניתוח בלוטת יותרת המוח (למשל, כדי להסיר גידולים), זיהומים (למשל, שחפת ההיפותלמוסית-יותרת המוח, או זיהומים בעקבות דלקת קרום המוח חיידקית או דלקת המוח), תסמונת שיאן (נמק בגלל זרימת דם לא מספקת עקב איבוד דם כבד בלידה- מתן), אפופלקסיה בלוטת יותרת המוח ופגיעה מוחית טראומטית הם גורמים חשובים אחרים של hypofunction בלוטת יותרת המוח8 . הוכח כי בלוטת יותרת המוח העכבר בעל יכולת התחדשות, להיות מסוגל לתקן נזק מקומי הציג על ידי אבלציה מהונדסת של תאים אנדוקריניים 9,10. תאי הגזע SOX2+ מגיבים בחריפות לפציעה שנגרמה מראה פנוטיפ פעיל, מסומן על ידי התפשטות משופרת (וכתוצאה מכך התרחבות תאי גזע) וביטוי מוגבר של גורמים ומסלולים הקשורים לגבעול (למשל, WNT / NOTCH). יתר על כן, תאי הגזע מתחילים לבטא את ההורמון ablated, ולבסוף וכתוצאה מכך שיקום משמעותי של אוכלוסיית התאים המדולדלים במהלך החודשים הבאים (5 עד 6) 9,10. כמו כן, במהלך שלב ההתבגרות היילוד של הבלוטה (3 השבועות הראשונים לאחר הלידה), תאי הגזע של בלוטת יותרת המוח משגשגים במצב פעיל 6,11,12,13, ואילו הזדקנות אורגניזמית קשורה לירידה בתפקוד תאי הגזע במקום, עקב סביבה דלקתית גוברת (מיקרו)בהזדקנות (או 'הדלקה')10,14 . בנוסף, tumorigenesis בבלוטה קשורה גם עם הפעלת תאי גזע 7,15. למרות הפעלת תאי גזע זוהתה במספר מצבים של שיפוץ בלוטת יותרת המוח (נסקר ב 7,16), המנגנונים הבסיסיים עדיין לא ברורים. מאז in vivo גישות (כגון מעקב שושלת בעכברים מהונדסים) לא סיפקו תמונה ברורה או מקיפה של תאי גזע בלוטת יותרת המוח, פיתוח של מודלים במבחנה אמין לחקור ביולוגיה של תאי גזע בלוטת יותרת המוח נורמלית וחולנית היא חיונית. תרבות הפריה חוץ גופית סטנדרטית של תאי גזע בלוטת יותרת המוח העיקריים נשאר לקוי בגלל יכולת צמיחה מוגבלת מאוד ותנאים לא פיזיולוגיים (2D) עם אובדן מהיר של פנוטיפ (לסקירה מפורטת יותר, ראה16). תרביות כדור 3D (pituispheres) הוקמו מתאי גזע בלוטת יותרת המוח כפי שזוהו על ידי אוכלוסייה צדדית ופנוטיפ SOX2 + 2,3,4. הפיתוספירות גדלות באופן קלונלי מתאי הגזע, מבטאות סמני גזע ומראים יכולת בידול לסוגי התאים האנדוקריניים. עם זאת, הם אינם מתרחבים במידה ניכרת תוך הצגת מעבר מוגבלת בלבד (2-3 קטעים)3,4. מבנים דמויי כדור התקבלו גם מקבצי תאי גזע לא מנותקים של יותרת המוח כאשר הם מתורבתים ב-50% מטריגל מדולל במשך שבוע אחד, אך יכולת ההרחבה לא הוצגה17. הגישה pituisphere משמש בעיקר ככלי קריאה עבור מספרי תאי גזע, אבל יישומים נוספים מוגבלים על ידי יכולת הרחבה נחותה16.

כדי לטפל ולהתגבר על חסרונות אלה, מודל 3D חדש הוקם לאחרונה, כלומר, organoids, החל AL האנדוקרינית העיקרית של עכברים המכילים את תאי הגזע MZ ו parenchymal. הוכח כי האורגנוידים אכן נגזרים מתאי הגזע של בלוטת יותרת המוח, בנאמנות recapitulate הפנוטיפ שלהם18. יתר על כן, האורגנוידים ניתנים להרחבה לטווח ארוך, תוך שמירה איתנה על טבע הגבעול שלהם. לכן, הם מספקים שיטה אמינה להרחיב תאי גזע בלוטת יותרת המוח העיקריים לחקר מעמיק. מחקר כזה אינו בר השגה עם מספר מוגבל של תאי גזע שניתן לבודד מ יותרת המוח, אשר גם אינם ניתנים להרחבה בתנאים 2D16. הוכח כי organoids הם כלים יקרי ערך ואמינים לחשוף תכונות תאי גזע בלוטת יותרת המוח חדשים (מתורגם in vivo)14,18. חשוב לציין, מודל organoid משקף בנאמנות את מצב הפעלת תאי הגזע בלוטת יותרת המוח כפי שהתרחשו במהלך נזק לרקמות מקומיות והתבגרות יילודים, מראה יעילות היווצרות משופרת ושכפול מסלולים מולקולריים upregulated 14,18. לפיכך, מודל organoid שמקורו בבלוטת יותרת המוח הוא חדשני ורב עוצמה יותרת המוח ביולוגיה של תאי גזע מודל מחקר, כמו גם כלי קריאת הפעלת תאי גזע.

פרוטוקול זה מתאר בפירוט את הקמתם של אורגנוידים שמקורם בבלוטת יותרת המוח של העכבר. לשם כך, האל על מבודדת ומנותקת לתאים בודדים, המוטמעים במטריצה חוץ-תאית המחקה מטריגל (להלן ECM). הרכבה תא-ECM הוא אז תרבית במדיום מוגדר, בעצם המכיל גורמי גדילה של תאי גזע ורגולטורים עובריים בלוטת יותרת המוח (המכונה עוד יותרת המוח 'מדיום organoid בלוטת יותרת המוח' (PitOM)18; טבלה 1). לאחר האורגנוידים מפותחים במלואם (לאחר 10-14 ימים), ניתן להרחיב אותם עוד יותר מעבר רציף שוקת ונתונים לחקירה נרחבת במורד הזרם (למשל, אימונופלואורסצנטיות, RT-qPCR, ותמלול בתפזורת או חד-תאית; איור 1). בטווח הארוך יותר, צפוי כי organoids תא גזע בלוטת יותרת המוח יסלול את הדרך תיקון רקמות גישות ורפואה רגנרטיבית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניסויים בבעלי חיים למחקר זה אושרו על ידי הוועדה האתית של KU Leuven לניסויים בבעלי חיים (P153/2018). כל העכברים שוכנו במתקן החיות של האוניברסיטה בתנאים סטנדרטיים (טמפרטורה קבועה של 23 ± 1.5 מעלות צלזיוס, לחות יחסית 40%-60%, ומחזור יום /לילה של 12 שעות), עם גישה למים ומזון עד ליביטום.

1. עכברים

  1. השתמש בזני עכבר זמינים מסחרית, כגון עכברי C57BL/6J, בגיל צעיר-מבוגר (בני 8-12 שבועות). באופן כללי, 2-3 עכברים מספקים מספר מספיק של תאי AL לפרוטוקול.

2. בידוד וניתוק של העכבר AL

הערה: בינוני A, B ו- C מוכנים מראש19,20. קומפוזיציות מוצגות בטבלה 2.

  1. בידוד של עכבר אל על
    1. הרדים את העכברים על ידי חנק CO2 , ואחריו עריפת ראש (איור 2A). לשטוף ראשי עכברים עם מים deionized כדי להסיר את הדם לרסס אותם עם 70% EtOH כדי ליצור סביבה סטרילית.
    2. בעזרת כלים כירורגיים סטריליים, הסירו את עור הראש בין האוזניים (איור 2B).
    3. פתח את הגולגולת והסר את המוח.
      1. לשבור את 'גשר האף' (כלומר, חלק קדמי של העצם הקדמית; איור 2B) עם מספריים סטריליות.
      2. פתחו את הגולגולת עוד יותר עם מספריים, החל מגשר האף השבור לכיוון האוזניים, משני הצדדים (איור 2C).
      3. הסר את הגולגולת ואת המוח עם פינצטה סטרילית, מבלי לגעת בבלוטת יותרת המוח (איור 2D).
    4. הסר את סלה הסרעפת עם פינצטה קהה, מבלי לפגוע בבלוטת יותרת המוח. השלך את ה- PL ואת ה- IL מה- AL תחת סטריאומיקרוסקופ.
      הערה: PL ו- IL מקושרים ולכן מוסרים בו זמנית. חלקים אלה מופיעים כרקמה לבנה, בהשוואה ל-AL בצבע ורוד (איור 2D).
    5. בזהירות לבודד את AL עם פינצטה קהה ולאסוף אותו בקבוק 10 מ"ל Erlenmeyer, מלא 3 מ"ל של בינוני A (ראה טבלה 2). מניחים את הבקבוקון על הקרח עד לעיבוד נוסף.
  2. ניתוק של עכבר AL
    1. הסר את המדיום העל-טבעי (SN) A מבקבוק ארלנמייר המכיל את ה- AL המבודד. הוסף 2 מ"ל של תמיסת טריפסין 2.5% טרום המלחמה (37 °C) ודגר ב 37 °C (15 °F) במשך 15 דקות.
    2. מבלי להסיר את פתרון הטריפסין, הוסיפו 2 מ"ל של פתרון DNase לפני המלחמה (37 °C) (2 מיקרוגרם / מ"ל במדיום A; סינון סטרילי באמצעות רשת של 0.22 מיקרומטר), וסובבו את בקבוק ארלנמייר 10 פעמים. תן את בלוטת יותרת המוח לשקוע לתחתית (~ 1 דקות) ולהסיר את SN.
    3. יש להוסיף 2 מ"ל של תמיסת מעכב טריפסין (37°C) (0.1 מ"ג/מ"ל במדיום A; מסונן באמצעות רשת של 0.22 מיקרומטר) ולדגור ב-37°C למשך 10 דקות. תן את משקע בלוטת יותרת המוח לתחתית ולהסיר את SN.
    4. יש להוסיף 2 מ"ל של B בינוני (37°C) לפני המלחמה (ראו טבלה 2) ולדגור ב-37°C למשך 5 דקות. מבלי להסיר את ה-SN, הוסיפו 2 מ"ל של C בינוני (37 מעלות צלזיוס) (ראו טבלה 2) ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
    5. תן את בלוטת יותרת המוח לשקוע לתחתית ולהסיר את SN. לשטוף את בלוטת יותרת המוח שלוש פעמים עם מראש (37 °C )? C בינוני.
    6. לנתק את בלוטת יותרת המוח לתאים בודדים.
      1. הוסף 2 מ"ל של prewarmed (37 °C) בינוני C. שאיפה ולגרש את בלוטת יותרת המוח עם סטרילי, מלוטש להבה פסטר פיפטה פיפטה מספר פעמים, עד שברים אינם נראים יותר.
      2. מעבירים את המתלים לצינור 15 מ"ל עם 4.5 מ"ל של פתרון DNase (37 °C) (2 מיקרוגרם / מ"ל בינוני A; מסונן סטרילי באמצעות רשת של 0.22 מיקרומטר). לשטוף את Erlenmeyer שלוש פעמים עם 2 מ"ל של מראש (37 °C) בינוני C ולהעביר את ההשעיה לצינור 15 מ"ל.
    7. מערבבים את ההשעיה התא שנאספה ולסנן אותו דרך מסננת תא 40 מיקרומטר לתוך צינור 30 מ"ל. לשטוף את צינור 15 מ"ל ואת מסננת התא שלוש פעמים עם 2 מ"ל של C בינוני ולהעביר את ההשעיה לצינור 30 מ"ל.
    8. מקם את הקצה של פיפטה פסטר זכוכית, מלא 2 מ"ל של 3% סלמון סרום בקר (BSA) פתרון (בינוני A; סטרילי מסונן דרך רשת 0.22 מיקרומטר), בתחתית הצינור בעדינות פיפטה החוצה כדי ליצור שכבת צפיפות גלויה. צנטריפוגה ב 190 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (65 °F).
    9. הסר את SN על ידי היפוך הצינור בתנועה שוטפת אחת ולהסיר את טיפות SN הנותרות עם קצה P1000. לפנק מחדש את גלולה התא ב 1 מ"ל של קר כקרח מתקדם DMEM / F12 (עו"ד DMEM / F12) ולכמת את התאים עם מונה תא.

3. הקמה ופולחן של אורגנוידים שמקורם באל על

הערה: להפשיר ECM על קרח מראש (2-3 שעות עבור 1 מ"ל) ולשמור אותו על קרח למשך הפרוטוקול.

  1. זריעת אורגנויד ופולחן
    1. צנטריפוגה ההשעיה תא AL ב 190 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (4 °F) ולהסיר את SN. Resuspend גלולה התא עו"ד DMEM / F12 באמצעות אמצעי האחסון הספציפי מחושב כדי להגיע לצפיפות תאים של 1.1 x 106 תאים / מ"ל.
      הערה: לדוגמה, אם ההשעיה התאית מכילה 500,000 תאים / מ"ל, יש לחדש את גלולה התא ב 454.54 μL של Adv DMEM / F12 כדי להגיע לצפיפות הרצויה של 1.1 x 106 תאים / מ"ל.
    2. להוציא את נפח ההשעיה התא הדרוש לציפוי (על פי המספר הרצוי של בארות לזרע להתפתחות organoid) ולהוסיף ECM ביחס 30:70 (30% השעיית תאים (ב עו"ד DMEM / F12 ) ו 70% ECM). מערבבים היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה.
      הערה: לדוגמה, עבור טיפה אחת של 30 μL (ראה שלב 3.1.3), יש לערבב (בעדינות) 9 μL של השעיית תא (המכיל ~ 10,000 תאים כאשר נלקח מן 1.1 x 1010 6 תאים / השעיה מ"ל) עם 21 μL של ECM.
    3. לבאר, להפקיד טיפה 30 μL של תערובת השעיית התא / ECM (ראה שלב 3.1.2) על צלחת מחוממת מראש (37 °C ) 48-well. להפוך את הצלחת ולתת ECM להתמצק ב 37 °C (50 °F) במשך 20 דקות.
      הערה: מחממים מראש את צלחות התרבות לפחות 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס.
    4. החזירו את הצלחת לכיוון הנכון שלה והוסיפו בזהירות 250 μL של PitOM לפני המלחמה (37 °C) (ראה טבלה 1) בתוספת 10 מעכבי סלע מיקרומטר (Y-27632).
    5. המשיכו לתרבות את האורגנוידים על ידי שינוי המדיום (נטול Y-27632) כל 2-3 ימים עד שהאורגנואידים יגדלו במלואם, וזה לוקח בין 10-14 ימים (איור 3A). לאחר מכן, להעביר את האורגנוידים.
      הערה: בעת שאיפת המדיום, הקפד לא לשבש את כיפת ECM. הטה מעט את צלחת התרבות והסר את המדיום מהשוליים התחתונים של הבאר. טרי (לפני המלחמה ב 37 °C (50 °F) בינוני יש להוסיף בעדינות לצד הבאר. אם טיפות ג'ל לבטל לצרף, לאסוף את organoids ו resuspend ולתרבות אותם שוב בטיפת ECM חדשה.
  2. מעבר אורגנויד
    1. לשאוף את המדיום בעדינות ולהוסיף 400 μL של קר כקרח עו"ד DMEM / F12 כדי לפורר את ECM ולאסוף את organoids בצינור microcentrifuge. לשטוף פעם אחת עם 400 μL של קר כקרח Adv DMEM / F12 EM. צנטריפוגה ב 200 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (4 °F).
    2. הסר את SN בזהירות ולהוסיף 400 μL של אנזים טריפל אקספרס (37 °C) טריפל אקספרס (1X). מערבבים על ידי היפוך הצינור מספר פעמים, ודגור ב 37 °C (5 °F) במשך 5 דקות.
    3. הוסף 400 μL של קר כקרח עו"ד DMEM / F12 וצנטריפוגה ב 200 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (4 °F). הסר את ה- SN.
    4. לפנק מחדש את הכדור עם 100 μL של קר כקרח Adv DMEM / F12 ולאחר מכן לשבור את האורגנוידים על ידי צנרת נמרצת למעלה ולמטה עם קצה P200 צר (כלומר, לדחוף את הקצה הריק נגד החלק התחתון של צינור microcentrifuge, כדי להפחית את קוטר הפתיחה שלה) עד שברי organoid (עם קוטר סביב 50 מיקרומטר) מתקבלים (איור 3B).
      הערה: תערובת הדיסוציאציה צריכה להכיל בעיקר שברי אורגנויד ורק כמה תאים בודדים. דיסוציאציה קשה של האורגנוידים לתאים בודדים משפיעה לרעה על הצמיחה מחדש של האורגנוידים.
    5. הוסף 800 μL של עו"ד DMEM / F12 וצנטריפוגה ב 190 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (4 °F). הסר את ה- SN.
    6. מעבר האורגנוידים ביחס של 1:2 ל-1:4. Resuspend את הכדור בנפח נאות של עו"ד DMEM / F12 לפי הצורך לציפוי ולהוסיף ECM ביחס 30:70 (30% השעיית תאים ו 70% ECM). מערבבים היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה.
    7. זרע ותרבות האורגנוידים כמתואר לעיל בשלבים 3.1.3-3.1.5.
      הערה: בממוצע, 20 organoids לפתח לבאר מתוך 10,000 תאים שלם AL זרע (0.2%). מעבר זה 0 organoids ניתן לפצל ביחס 1:2, וכתוצאה מכך >50 organoids לפתח לכל באר (קטע 1). לאחר מכן ניתן לפצל אורגנוידים ביחס של 1:2 ל-1:4 במהלך הקטעים הבאים. צמיחה מחדש של organoids מאט לאחר ~ 10 קטעים (המקבילים 3 חודשים של תרבות), concretated בהדרגה פחות ופחות organoids קטן יותר.

4. שימור קריופרציה של אורגנוידים שמקורם באל על והפשרה

  1. שימור קריופרציה של אורגנוידים
    1. פעל בהתאם לפרוטוקול המעבר משלב 3.2.1 עד שלב 3.2.5.
    2. Resuspend גלולה organoid (המכיל שברים ותאים) עם 1 מ"ל של מדיום cryopreservation (טבלה 3). מעבירים את ההשעיה להקפאה ומניחים אותה על קרח.
      הערה: אורגנוידים (כלומר, שברים ותאים תוצאתיים) מתוך עד ארבע בארות של צלחת 48-well ניתן לשלב בהקפאה אחת.
    3. מניחים את cryovials במיכל הקפאה ולהעביר אותם למינוס 80 °C (80 °F).
    4. לאחר 24 שעות, העבירו את הדגימות לתיבת הקפאה ואחסנו אותן בחנקן נוזלי (-196 מעלות צלזיוס) לאחסון לטווח ארוך.
  2. הפשרת אורגנוידים שמורים של קריופ
    1. הסר את cryovial ממיכל החנקן הנוזלי ומניחים אותו על קרח. מיד להמשיך עם פרוטוקול ההפשרה.
    2. להפשיר את הפתרון עם שברי organoid cryopreserved ותאים בודדים ב 37 °C (אמבט מים).
      הערה: אל תשמור את הפתרון במשך יותר מ 2 דקות ב 37 °C (50 °F) כדי למנוע רעילות תאים על ידי DMSO.
    3. העבירו את התוכן לצינור 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של עו"ד DMEM/F12 קר כקרח עם 30% סרום בקר עוברי (FBS). יש לשטוף את ההקפאה עם 1 מ"ל של עו"ד DMEM/F12 עם 30% FBS.
    4. צנטריפוגה ב 190 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (65 °F). תוסיפו מחדש את הכדור עם 1 מ"ל של עו"ד DMEM/F12 קר כקרח והעבירו את ההשעיה לצינור מיקרוצנטריפוגה.
    5. צנטריפוגה ב 190 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (65 °F). לנפח מחדש את הכדור בנפח נאות של עו"ד DMEM / F12 לפי הצורך לציפוי ולהוסיף ECM ביחס של 30:70. מערבבים היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה.
    6. זרע ותרבות האורגנוידים כמתואר לעיל בשלבים 3.1.3-3.1.5.

5. אימות אורגנוידים שמקורם באל על

  1. איסוף וליזה של אורגנוידים לבידוד RNA
    1. לאסוף ולצנטריפוגה האורגנוידים כמתואר לעיל (שלב 3.2.1).
    2. הסר את SN ולהוסיף 350 μL של מאגר תמוגה עם 1% 2-mercapto-אתנול. מערבולת עבור 30 s ולאחסן ב -80 °C (80 °F) או להמשיך מיד לבידוד RNA.
      זהירות: היזהר כי 2-mercapto-אתנול הוא תרכובת רעילה. כל העבודה חייבת להיעשות בברדס אדים כימי תוך לבישת כפפות ניטריל, מסכת אבק ומשקפי בטיחות. 2-Mercapto-אתנול יכול לגרום נזק בלתי הפיך לעיניים ולעור.
  2. קיבעון והטבעה של אורגנוידים לכתם אימונו-היסטוכימיה/פלואורסצנטיות
    1. לאסוף ולצנטריפוגה האורגנוידים כמתואר לעיל (שלב 3.2.1).
    2. הסר את SN, להוסיף 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde (PFA) ודגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT) על שייקר מסלולית (100 סל"ד).
      אזהרה: PFA הוא מסרטן אנושי ידוע שיכול לגרום נזק בלתי הפיך לקרנית. כל העבודה חייבת להיעשות במכסה מנוע של אדים כימיים. כפפות ניטריל ומשקפי בטיחות חייבים תמיד להיות משוחקים.
    3. צנטריפוגה ב 200 x g במשך 5 דקות ולהסיר את SN. הוסיפו 1 מ"ל של PBS, דגרו 10 דקות ב-RT על שייקר מסלולי (100 סל"ד), וצנטריפוגה ב-90 x גרם למשך 3 דקות ב-4 °C (4 °F). חזור על שלב הכביסה פעמיים. יש לאחסן ב-PBS בטמפרטורה של 4 °C (4 °F).
    4. לעיבוד רקמות והתייבשות, להסיר את SN ולהוסיף 150 μL של 2% ג'ל agarose (ב PBS) לכדור organoid באמצעות קצה p200 מורחב מראש (עשה על ידי חיתוך חתיכה קטנה של הקצה). מיד לשפוך את כל עוצמת הקול למעלה ולהוציא במכסה של צינור microcentrifuge.
      הערה: חשוב לעבוד במהירות, כמו הג'ל המכיל את organoids יתמצק במהירות.
    5. נותנים לג'ל להתמצק בחוזקה במשך 30 דקות ומעבירים את דיסק הג'ל לקלטת היסטולוגיה. יש לטבול ולאחסן ב-50% EtOH, עד להתייבשות במעבד הרקמות.
    6. להטמעת פרפין, מניחים את דיסק הג'ל (בעזרת מלקחיים) בתבנית הטבעה וממלאים בפרפין חם (60 מעלות צלזיוס). מניחים את התבניות על 4 מעלות צלזיוס עד שהפרפין מוצק (כ-45 דקות). דגימות אלה ניתן לאחסן ב 4 °C (4 °F) או יכול להיות נתון באופן מיידי חתך.
    7. Microtome בלוקים פרפין המכיל organoids בעובי 5 מיקרומטר ולאסוף את הדגימות על שקופיות זכוכית. הוסף טיפה אחת של מים deionized מתחת לכל קטע כדי לאפשר מתיחה נכונה של הקטע ומניחים את השקופיות על צלחת חימום שטוחה ב 37 °C (50 °F) לילה. יש לאחסן את השקופיות עם מקטעים בטמפרטורה של 4 °C (4 °F) או להמשיך ישירות עם כתמים אימונוהיסטוכימיים או אימונופלואורסצנטיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאחר בידוד וניתוק של AL, התאים הבודדים המתקבלים נזרעים ב- ECM וגדלים בפיתום (איור 1, טבלה 1). איור 3A מציג את תרבית התא ואת הצפיפות בזריעה (יום 0). פסולת קטנה מסוימת עשויה להיות נוכחת (איור 3A, ראשי חץ לבנים), אך תיעלם בעת המעבר. 14 יום לאחר הזריעה, האורגנוידים שמקורם באל-על מפותחים במלואם (איור 3A). האורגנוידים מציגים מורפולוגיה ציסטית, עם שכבת אפיתל המקיפה לומן. בשלב זה, organoids להג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האורגנוידים שמקורם באל, כמתואר כאן, מייצגים מודל מחקר רב עוצמה לחקר תאי גזע בלוטת יותרת המוח במבחנה. נכון לעכשיו, גישה זו organoid הוא הכלי הזמין היחיד כדי אמין וחזק לגדול ולהרחיב תאי גזע בלוטת יותרת המוח העיקרי. מודל אורגנויד בלוטת יותרת המוח נגזר מתאי גזע עובריים (ESC) או תאי גזע פלוריפוטנט המושרה (iPSC) דווח בעבר, אשר מקרוב recapitulatesess יותרת המוח organogenesis עוברי23; עם זאת, למרות מאוד שימושי כדי ללמוד פיתוח בלוטת יותרת המוח או מודל מחלת יותרת המוח 23,24,25, הפרוטוקול שדווח, הח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרן המחקר KU Leuven והקרן למחקר מדעי (FWO) - פלנדריה. E.L. (11A3320N), ו- C.N. (1S14218N) נתמכים על ידי מלגת דוקטורט מ- FWO / FWO-SB.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250
צלחות 48 בארות, מטופלות TC, עטופות בנפרדCostar734-1607
A83-01Sigma-AldrichSML0788
Advanced DMEM/F12Gibco12634010
אלבומין בקר (דרגת תרבית תאים)Serva47330
B-27 ( 50X), מינוס ויטמין AGibco12587010
תבניות בסיס VWR720-1918
מאגר RLTQiagen79216
קלטות, Q Path MicrotwinVWR720-2191
מסננת תאים, 40 ומיקרו; m mesh,פלקון352340
כולרה חד פעמי מ-Vibrio choleraeSigma-AldrichC8052
Deoxyribonuclease I מלבלב בקרSigma-AldrichD5025
D-glucoseMerck108342
Dimethylsulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2650
DMEM, אבקה, גלוקוז גבוהGibco52100039
Eppendorf צינורות נעילה בטוחה, 1.5 מ"לEppendorf30120086
Epredia SuperFrost Plus מגלשות הידבקותThermo Fisher ScientificJ1800AMNZ
Epredia HistoStar Embedding Workstation, 220 עד 240VacThermo Fisher Scientific12587976
אתנול מוחלט 99.8+%Thermo Fisher Scientific
סרום בקר עוברי (FBS)Sigma-AldrichF7524
תוסף GlutaMAXGibco35050061
HEPESSigma-AldrichH4034
HEPES Buffer SolutionGibco15630056
InSolution Y-27632Sigma-Aldrich
(200 מ"מ)Gibco25030081
מטריג'ל גורם גדילה מופחת (GFR) מטריצת ממברנת בסיס,קורנינג15505739
מיכל הקפאה מר פרוסטיThermo FisherScientific 5100-0001
(100X)Thermo Fisher Scientific17502048
N-אצטיל-L-ציסטאיןסיגמא-אולדריץ'A7250
צינורות קריוגניים של Nunc Biobanking and CellThermo Fisher Scientific375353
Paraformaldehyde לסינתזה (PFA)Merck818715
PBS, pH 7.4Gibco10010023
Penicillin G מלח נתרןSigma-AldrichP3032
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יחידות / מ"ל)Gibco15140122
פנול אדוםMerck107241
אשלגן כלורי (KCl)Merck104936
חלבון EGF אנושי רקומביננטי, CFR& D systems236-EG
רקומביננטי אנושי FGF בסיסי/FGF2/bFGF (157 aa) חלבוןR& D מערכות234-FSE
רקומביננטי אנושי FGF-10פפרוטק100-26
רקומביננטי אנושי IGF-1פפרוטק100-11
רקומביננטי אנושי IL-6פפרוטק200-06
רקומביננטי אנושי נוגיןפפרוטק120-10C
רקומביננטי אנושי R-Spondin-1פפרוטק120-38
רקומביננטי אדם/עכבר FGF-8bPeprotech100-25
עכבר רקומביננטי סוניק קיפוד/SHH (C25II) N-TerminusR& D systems464-SH
RNeasy מיקרוקיט Qiagen74004
SB202190סיגמא-אולדריץ'S7067
SeaKem LE אגרוזלונזה50004
נתרן כלורי (NaCl)BDH102415K
נתרן די-מימן פוספט 1-הידראטPanReac-AppliChemA1047
נתרן מימן פחמתי (NaHCO3)Merck106329
נתרן-פירובט (C3H3NaO3)Sigma-AldrichP5280
Stericup-GP, 0.22 ומיקרו; mMilliporeSCGPU02RE
Steriflip-GP יחידת מסנן עליון צינור צנטריפוגה סטרילי, 0.22 μ mMilliporeSCGP00525
מים סטרילייםFreseniusB230531
מלח סטרפטומיצין סולפטSigma-AldrichS6501
Thermo Scientific Excelsior ES מעבד רקמותThermo Scientific12505356
Titriplex IIIMerck108418
TrypL Express Enzyme (1X), פנול אדוםתרמו
מבית Glycine max (פולי סויה)Sigma-AldrichT9003
תמיסת טריפסין 2.5%Thermo Fisher Scientific15090046
תוסף רעלן10342652 688001-L-גלוטמין ללא LDEV תוסף N-2 Culture מעכב טריפסין מבית Fisher Scientific 12605028

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Melmed, S. The pituitary. 3rd ed. , Elsevier/Academic Press. Cambridge. 1(2011).
  2. Chen, J., et al. The adult pituitary contains a cell population displaying stem/progenitor cell and early-embryonic characteristics. Endocrinology. 146 (9), 3985-3998 (2005).
  3. Chen, J., et al. Pituitary progenitor cells tracked down by side population dissection. Stem Cells. 27 (5), 1182-1195 (2009).
  4. Fauquier, T., Rizzoti, K., Dattani, M., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C. A. F. SOX2-expressing progenitor cells generate all of the major cell types in the adult mouse pituitary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2907-2912 (2008).
  5. Rizzoti, K., Akiyama, H., Lovell-Badge, R. Mobilized adult pituitary stem cells contribute to endocrine regeneration in response to physiological demand. Cell Stem Cell. 13 (4), 419-432 (2013).
  6. Andoniadou, C. L., et al. Sox2+ stem/progenitor cells in the adult mouse pituitary support organ homeostasis and have tumor-inducing potential. Cell Stem Cell. 13 (4), 433-445 (2013).
  7. Nys, C., Vankelecom, H. Pituitary disease and recovery: How are stem cells involved. Molecular and Cellular Endocrinology. 525 (4), 111176(2021).
  8. Schneider, H. J., Aimaretti, G., Kreitschmann-Andermahr, I., Stalla, G. K., Ghigo, E. Hypopituitarism. Lancet. 369 (9571), 1461-1470 (2007).
  9. Fu, Q., et al. The adult pituitary shows stem/progenitor cell activation in response to injury and is capable of regeneration. Endocrinology. 153 (7), 3224-3235 (2012).
  10. Willems, C., et al. Regeneration in the pituitary after cell-ablation injury: time-related aspects and molecular analysis. Endocrinology. 157 (2), 705-721 (2016).
  11. Gremeaux, L., Fu, Q., Chen, J., Vankelecom, H. Activated phenotype of the pituitary stem/progenitor cell compartment during the early-postnatal maturation phase of the gland. Stem Cells and Development. 21 (5), 801-813 (2012).
  12. Zhu, X., Tollkuhn, J., Taylor, H., Rosenfeld, M. G. Notch-dependent pituitary SOX2+ stem cells exhibit a timed functional extinction in regulation of the postnatal gland. Stem Cell Reports. 5 (6), 1196-1209 (2015).
  13. Russell, J. P., et al. Pituitary stem cells produce paracrine WNT signals to control the expansion of their descendant progenitor cells. eLife. 10 (1), 59142(2021).
  14. Vennekens, A., et al. Interleukin-6 is an activator of pituitary stem cells upon local damage, a competence quenched in the aging gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (25), 2100052118(2021).
  15. Mertens, F., et al. Pituitary tumors contain a side population with tumor stem cell-associated characteristics. Endocrine-Related Cancer. 22 (4), 481-504 (2015).
  16. Laporte, E., Vennekens, A., Vankelecom, H. Pituitary remodeling throughout life: are resident stem cells involved. Frontiers in Endocrinology. 11 (1), 604519(2021).
  17. Yoshida, S., et al. Isolation of adult pituitary stem/progenitor cell clusters located in the parenchyma of the rat anterior lobe. Stem Cell Research. 17 (2), 318-329 (2016).
  18. Cox, B., et al. Organoids from pituitary as novel research model to study pituitary stem cell biology. Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).
  19. Denef, C., Hautekeete, E., De Wolf, A., Vanderschueren, B. Pituitary basophils from immature male and female rats: distribution of gonadotrophs and thyrotrophs as studied by unit gravity sedimentation. Endocrinology. 130 (3), 724-735 (1978).
  20. Vander Schueren, B., Denef, C., Cassiman, J. J. Ultrastructural and functional characteristics of rat pituitary cell aggregates. Endocrinology. 110 (2), 513-523 (1982).
  21. Claes, C., et al. Human stem cell-derived monocytes and microglia-like cells reveal impaired amyloid plaque clearance upon heterozygous or homozygous loss of TREM2. Alzheimer's and Dementia. 15 (3), 453-464 (2019).
  22. Trompeter, H. -I., et al. MicroRNAs miR-26a, miR-26b, and miR-29b accelerate osteogenic differentiation of unrestricted somatic stem cells from human cord blood. BMC Genomics. 14, 111(2013).
  23. Suga, H., et al. Self-formation of functional adenohypophysis in three-dimensional culture. Nature. 480 (7375), 57-62 (2011).
  24. Matsumoto, R., et al. Congenital pituitary hypoplasia model demonstrates hypothalamic OTX2 regulation of pituitary progenitor cells. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 641-654 (2019).
  25. Kanie, K., et al. Pathogenesis of anti-PIT-1 antibody syndrome: PIT-1 presentation by HLA class I on anterior pituitary cells. Journal of the Endocrine Society. 3 (11), 1969-1978 (2019).
  26. Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
  27. Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
  28. Nolan, L. A., Kavanagh, E., Lightman, S. L., Levy, A. Anterior pituitary cell population control: basal cell turnover and the effects of adrenalectomy and dexamethasone treatment. Journal of Neuroendocrinology. 10 (3), 207-215 (1998).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים